DE2506601A1 - Neue tetrapeptide sowie verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

Neue Tetrapeptide sowie Verfahren zu ihrer

Es ist bekannt, dass bestimmte Peptide physiologische Aktivitäten aufweisen, so dass sie intensiv erforscht worden sind. Insbesondere Peptide r-iit einem Acy !anteil an ihrem N-Ende, d.h. N-Acylpeptide, zeigen eine interessante Aktivität. Von sauren Proteasen wurde beispielsweise berichtet, dass sie in spezifischer Weise durch H-Acylpept,ide, ä.h. Pepstatine, der allgemeinen Formel:

R-Val-Val-X-Ala-X

inhibiert werden, wobfei in der Formel die Symbole folgende Bedeutungen besitze;: j R ~ eine Acy !gruppe, VaI = L-Valin, X = 4-Amino-3-hydr-T>xy"-i-rischylheptansä"are und &Ia = L-Alanin«

Einige dieser Verbindungen sind, wie berichtet wurde? gegenüber Magengeschwüren infolge ihrer Antipepsinaktivität wirksam. Klinische Untersuchungen, die sich mit dieser Wirkung befassen* sind veröffentlicht worden.

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Diese N-Acylpeptide zeichnen sich durch das Vorliegen einer neuen Aminosäure aus, die in der Formel mit X bezeichnet wird. Diese Aminosäure steht, wie man annimmt, in einer engen Beziehung zu ihrer physiologischen Aktivität. Die Länge der Peptidkette sowie der Charakter der Acylgruppe stehen ebenfalls in einer Beziehung zu der Aktivität dieser Peptide.

Es ist die Annahme möglich, dass dann, wenn ein Peptid, das die Gruppe X, jedoch keine Acylgruppe trägt und eine kürzere Peptidkettenlänge aufweist und immer noch die Protease inhibierende Aktivität zeigt, hergestellt werden kann, dieses Peptid veränderte Wirkungen aufweisen und xn. breitem Umfange eingesetzt werden kann, und zwar ·:'!■-.. halb, ά& sein© pbysioÄamischen und biologisch an Eigenschaften* wis beispielsweise seine Löslichkeit ,.seine Absorption r.'i verteilung in verschiedenen Organen, verschieden sind,

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass ein N-Acylpeptid der allgemeinen Formel H-VaI-VaI=X-Ala X teilweise durch Mikroorganismen ssrsatät wird, und zwar Bakterien, Schimmelpilze, Hafen sowas Strahlenpilze, oder durch ein Enzym, das durch derartige Mikroorganismen erzeugt v*ird. Es wurde ferner festgestellt, dass ein Peptid der Formel VaI-X-AIa-X, wobei es sich uitl eine :"βιΐ3 Verbindung handelt, durch diesen Abbau erhalten wird«

Diese S üb & ta ^. α anthält ;· miser noch die v?ich~ige neue Aminosäure X in äQiz MolekZ'lt jsdooh --.ainon Äcylaii^sil^ Es rurde weiter gefunden, dass ei :> neues N-Acylpe^tia der allgerasiaea Fornvsl?

R'-VaI-X-AIa-Z,

worin R^! für e-ir^n Acylar.teil steht, der dem Anteil R der vorstehend angegebenen Verbindung R-Val-Val-X-Ala-X entspricht

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oder davon verschieden ist, durch eine chemische Acylierung des N-Endes des vorstehend erwähnten neuen Peptide hergestellt werden kann. Ferner hat es sich herausgestellt, dass diese neuen Verbindungen, und zwar Val-X-Ala-X und R¹-VaI-X-AIa-X, physiologisch oder biochemisch aktiv sind.

Durch die Erfindung wird daher ein Verfahren zur Herstellung * eines neuen physiologisch aktiven Peptids der Formel Val-X-Ala-X sowie N-acylierter Verbindungen davon geschaffen, bei dessen Durchführung eine Verbindung der allgemeinen Formel R-Val-Val-X-AIa-X oder ein Salz oder ein Ester davon durch ein Enzym hydrolysiert wird, welches durch einen Mikroorganismus erzeugt wird und R-Val-Val-X-AIa-X zu Val-X-Ala-X zu zersetzen vermag, worauf das auf diese Weise erhaltene Val-X-Ala-X unter Anwendung einer üblichen Methode acyliert werden kann.

Wie vorstehend erwähnt wurde, ist das Peptid Val-X-Ala-X, das aus R-Val-Val-X-Ala-X hergestellt wird, eine wertvolle Substanz sowie eine neue Verbindung, die erstmalig nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellt werden kann. Kein Verfahren zur spezifischen Zersetzung von R-Val-Val-X-Ala-X zu Val-X-Ala-X, und zwar enzymatisch oder nicht enzymatisch, ist bisher bekannt gewesen.

Die N-Acylpeptide der allgemeinen Formel R¹-Val-X-Ala-X werden aus dem Peptid Val-X-Ala-X nach einer bekannten Acylierungsmethode hergestellt. Diese Verbindungen sind ebenfalls bisher nicht bekannte wertvolle neue Verbindungen.

Die Erfindung wird durch die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 ein Diagramm, das die Wirkung des pH-Wertes auf die Aktivität des Enzyms wiedergibt, die durch die Zahl η der Mole an erzeugter Isovaleriansäure wiedergegeben wird.

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Fig. 2 die Wirkung des pH-Wertes auf das Enzym, die durch den Prozentsatz der Restaktivität wiedergegeben wird, nachdem das Enzym während einer Zeitspanne von 60 Minuten bei verschiedenen pH-Werten gehalten worden ist.

Fig. 3 die Wirkung von Wärme auf die Enzymaktivität, die durch die Zahl η der Mole an erzeugter Isovaleriansäure wiedergegeben wird.

Fig. 4 die Wärmestabilität des Enzyms, die ebenfalls durch den Prozentsatz der Restaktivität wiedergegeben wird, nachdem das Enzym bei verschiedenen Temperaturen während einer Zeitspanne von 10 Minuten gehalten worden ist.

Fig. 5 das UV-AbsorptionsSpektrum des neuen Tetrapeptids, und zwar L-VaIyl-4-amino-3-hydroxyⁱ6-methylheptanoyl-L-alanyl-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure, in einer Methanollösung.

Fig. 6 das IR-AbsorptionsSpektrum der vorstehend angegebenen
Verbindung, die in Kaliumbromid pelletisiert worden ist.

Zur Durchführung der Erfindung wird die Verbindung der allgemeinen Formel R-Val-Val-X-Ala-X oder ein Material, das diese
Verbindung enthält, als Ausgangsmaterial eingesetzt. R kann
jede Acylgruppe sein, Acylgruppen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen sind jedoch im allgemeinen vorzuziehen. Ferner kann die Acylgruppe teilweise durch eine oder mehrere Hydroxylgruppen oder Halogenatome oder ein C-Ende einer veresterten Carboxylgruppe substituiert sein. Als Ausgangsmaterial kann eine einzige Verbindung oder eine Mischung von Verbindungen der vorstehend angegebenen allgemeinen Formel eingesetzt werden. Diese Verbindungen können in Form eines Rohmaterials oder in Form von Salzen mit Kationen eingesetzt werden, welche nicht die enzymatische Reaktion beeinflussen. Wahlweise kann eine Gärbrühe oder ein Roh-

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extrakt dieser Verbindungen eingesetzt werden, wenn sie durch Gärung erzeugt werden, ferner kann man auf einen Rohextrakt aus einer Reaktionsmischung als Ausgangsmaterial zurückgreifen, wenn die Verbindungen chemisch synthetisiert werden.

Die erfindungsgemäss eingesetzten Mikroorganismen sind Stämme, die ein Enzym erzeugen, das R-Val-Vai-X-AIa-X zu Val-X-Ala-X zu zersetzen vermag. Erwähnt seien insbesondere Stämme, die zu dem Genus Bacillus gehören. Ferner kommen andere Genera von Bakterien sowie Fungi Imperfecti in Betracht. Derartige Mikroorganismen werden nachfolgend näher beschrieben.

a) Bacillus

Nachfolgend werden Beispiele für Bakterien angegeben, die zu einem Bacillus gehören, der ein Enzym mit der vorstehend erwähnten Eigenschaft erzeugt: Bacillus megaterium ATCC 13639, Bacillus cereus ATCC 9634, Bacillus subtilis ATCC 10783, Bacillus circulans ATCC 13403 und Bacillus sphaericus ATCC 14577.

Eine geeignete Enzymzubereitung zur Durchführung des erfindangsgemässen Verfahrens kann durch Züchten des Mikroorganismus auf einem geeigneten Medium unter geeigneten Bedingungen erhalten werden. Der Mikroorganismus kann in einer flüssigen Kultur mit oder ohne Belüftung und Rühren oder auf einer festen Kultur gezüchtet werden.

Die Medien, die zum Wachsenlassen der Mikroorganismen gemäss vorliegender Erfindung eingesetzt werden, sind die Nährmedien, die sich als geeignet für das Wachsenlassen von Mikroorganismen erwiesen haben. Als Kohlenstoffquelle kann man alle diejenigen Kohlehydrate einsetzen, die normalerweise bei der Gärung verwendet werden, wie Stärke, Dextrin, Rohrzucker, Maltose, Glyzerin oder dergleichen. Der Stickstoff kann von irgendeinem Material geliefert werden, das in üblicher Weise eingesetzt wird,

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beispielsweise von Peptm, Fleischextrakt, Hefe, Sojabohnenmehl, Maisflüssigkeit, Gluten, Harnstoff, Ammoniumsalzen, Nitratsalzen oder dergleichen. Weizen- sowie Reiskleie, Sojabohnen, die mit organischen Lösungsmitteln behandelt worden sind," Nähragar oder dergleichen können als feste Züchtungsmedien eingesetzt werden. Die Medien können Mg⁺⁺-, Ca⁺⁺-, Fe⁺⁺-, Mg⁺⁺-, Phosphationen, verschiedene Vitamine, Aminosäuren oder dergleichen als anorganische Ionen sowie gegebenenfalls Spurenelemente enthalten.

Das Züchten kann bei Temperaturen sowie pH-Werten durchgeführt werden, wie sie gewöhnlich zum Wachsenlassen von Mikroorganismen eingehalten werden. Der Anfangs-pH-Wert beim Züchten wird vorzugsweise zwischen 4,5 und 8,5 gehalten, während die Temperatur auf einen Wert zwischen 15 und 4O°C eingestellt wird, und zwar je nach dem eingesetzten Mikroorganismus. Zur Induktion des Enzyms kann eine kleine Menge des Ausgangsmaterials dem Medium vor dem Züchten oder nach einem anfänglichen Wachsen des Mikroorganismus zugesetzt werden.

Alle Materialien, die das aktive Enzym enthalten, können als Enzymzubereitung zur Durchführung" des erfindungsgemässen Verfahrens eingesetzt werden, beispielsweise eine Kulturbrühe mit Zellen, ein Brühenfiltrat, ein Extrakt aus einer festen Kultur, Zellen, Zellen, die mit organischen Lösungsmitteln behandelt worden sind, gefriergetrocknete Zellen, getrocknete Zellen oder Extrakte aus Zellen sowie konzentrierte Zubereitungen oder teilweise oder hochgereinigte Zubereitungen, die aus den vorstehend erwähnten Substanzen durch Aussalzen, Ausfällen mit organischen Lösungsmitteln, Gelfiltration oder Chromatographie erhalten werden. Unlösliches Enzym oder immobilisierte Zellen, die nach in neuerer Zeit entwickelten Methoden hergestellt werden, können ebenfalls verwendet werden.

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Die spezifische Zersetzungsreaktion kann in der Weise durchgeführt werden, dass das Enzym in Kontakt mit dem Ausgangsmaterial gebracht wird. Während der Reaktion wird die Temperatur vorzugsweise zwischen 15 und 75 C und der pH-Wert zwischen 5 und 9 gehalten. Die bevorzugte Konzentration des Ausgangsmaterials schwankt zwischen 0,01 und 5 Gewichts-%. Die Reaktion sollte während einer Zeitspanne von 30 Minuten bis 48 Stunden durchgeführt werden. Die Bedingungen hängen von der Form der Ensy^nzcbereitung, dem Ausgangsmaterial, dem Mikroorganismus oder dergleichen ab.

Der folgende Versuch zeigt die Wirkung des pH-Wertes auf die Abbaureaktion bei Einsatz einer Zellsuspension von 3ac. circulans ATCC 13403 sowie Bac. megaterium ATCC 13639.

Versuch 1

Ein Medium, das 1 % Pepton, 0,7 % Fleischextrakt, 0,5 % Glukose und 0,3 % NaCl, und zwar jeweils auf das Gewicht bezogen, enthält und einen pH-Wert von 7 besitzt, wird hergestellt, worauf 50 ml des Mediums in einen 500 ml-Kolben gegossen und bei 120°C während einer Zeitspanne von 1G Minuten sterilisiert werden. Das Medium wird mit Bac. circulans ATCC 13403 beimpft. Nach einer Inkubation bei 30 C während einer Zeitspanne von 48 Stunden auf einem sich hin- und herbewegenden Schüttler (120 üpm) werden die Zellen durch Zentrifugieren mit 10000 Upn während einer Zeitspanne von 10 Minuten geerntet. Die Zellen, die auf diese Weise erhalten worden sind, werden mit einer kalten, 0,9 Gewichts-%igen NaCl-Lösung gewaschen und in destilliertem Wasser (OD,,_ =34)

Diu mu

suspendiert.

Eine Mischung aus 1 ml von 2 mg/ml Isovaleryl-L-valyl-L-valyl-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptanoyl-L-alanyl-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure, 0,5 ml einer O,4m-Pufferlösung mit dem in

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— ft —

Tabelle I angegebenen pH-Wert und 0,5 ml der Zellsuspension wird bei 37°C während einer Zeitspanne von 1 Stunde inkubiert. Der pH-Wert der Reaktionsmischung wird auf 2,0 unter Einsatz von HCl eingestellt. Die überstehende Flüssigkeit wird auf eine kleine Säule {0 = 0,7 χ 7 cm), die mit einem Kationenaustauscherharz (Dowex 5o) gefüllt ist, aufgebracht. Die Säule wird mit destilliertem Wasser zur Entfernung von nicht-umgesetztem Ausgangsmaterial gewaschen. Das Reaktionsprodukt wird mit 0,5n-NH.OH quantitativ eluiert. Die Pepsin-Inhibitoraktivität des Sluats wird anhand der nachfolgend geschilderten Methode untersucht. Die Wirkung des pH-Wertes auf diesen Abbau bei Verwendung einer Zellsuspension von Bac. megaterium ATCC 13639 wird in der gleichen Weise wie zuvor ebenfalls untersucht.

In der Tabelle I sind die Ergebnisse zusammengefasst.

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Tabelle I

Wirkung des pH-Wertes auf die Aktivität

Aktivität

Bac.cir- Bac.mega- Coryneculans terium bacte-ATCC 13403 ATCC 13639 rium equi

ATCC 6939

>200 200 80 65 65 65 65 65 65 80

100 125

>200

>200

180

125

80

65

65

65

65

65

65

80

125

>200

Pseudomonas
segnis ATCC 4358

Colleto- Macrotrichum phomina sp. phaseoli ATCC 20438 ATCC 20441

>200

200

100

80

80

80

80

80

100

125

150

200

>200

200 180 150 100

100 150 200

>200

200

200

100

85

80

80

80

80

100

200

>200

>200

>200

200

109

ßO

65

65

65

65

80

80

100

200

Bemerkung 1: Die Aktivität in dieser Tabelle sowie nachfolgend wird als das Volumen des Eluats aus der Ionenaustauscherharz-Säule als Anzahl der μΐ angegeben, die erforderlich ist, um die IB_go der Pepsin-Inhibitoraktivität zu erzielen.

Bemerkung 2: Diese Tabelle betrifft auch die Verwendung von anderen Genera von Bakterien als Bacillus, insbesondere Corynebacterium equi ATCC 6939 und Pseudomonas segnis ATCC 4358 (vgl. den weiter unten folgenden Versuch 6) sowie die Verwendung eines Fungus Imperfectus, insbesondere Colletotrichum sp. ATCC 20438 sowie Macrophomina phaseoli ATCC 20441 (vgl. den weiter unten folgenden Versuch 12).

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Die Konzentration des Reaktionsproduktes in dem Eluat steht in einem umgekehrten Verhältnis zu dem Volumen des Eluats, das für die ID₅₀ der Pepsin-Inhibitoraktivität erforderlich ist. Bei der Durchführung dieses Abbaus zeigt Bac. circulans ATCC 13403 eine hohe Aktivität zwischen einem pH von 5,0 und 8,5 und Bac. megaterium ATCC 13639 bei einem pH zwischen 5,5 und 9,0.

Die Untersuchung der Pepsin-Inhibitoraktivität wird erfindungsgemäss nach folgender Methode durchgeführt: Eine Mischung aus 1 ml eines 0,6 Gewichts-%igen hochgereinigten Kaseins, gelöst in 0,08 m einer Lactatpufferlösung mit einem pH-Wert von 2,2, 0,7 ml einer 0,02m KCl-HCl-Pufferlösung mit einem pH von 2,0 und 0,2 ml einer Lösung, welche die Probeverbindung enthält, wird bei 37°C während einer Zeitspanne von 3 Minuten inkubiert. Dieser Mischung werden 4 meg Pepsin (SIGMA, 2XCRY), gelöst in 0,1 ml einer 0,2m KCl-HCl-Pufferlösung, zugesetzt. Die Mischung wird bei 37°C während einer Zeitspanne von 30 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 2,0 ml einer 1,7m Perchlorsäure abgestoppt. Nach einem Stehenlassen während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur wird die optische Dichte (a) der überstehenden Flüssigkeit bei 280 mu abgelesen. Gemäss der Gleichung :

wird die inhibierende Wirkung ermittelt. Dabei bedeutet (b) die optische Dichte bei 280 mu des Reagenzglases ohne die Probelösung

Die ID₅₀ wird als die Menge definiert, die zur Erzielung einer 50 %igen Inhibierung erforderlich ist.

Zur Durchführung des erfindungsgemassen Abbauverfahrens, insbesondere unter Einsatz einer teilweise gereinigten Enzymzuberei-

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tung, kann die Reaktionsmischung erforderlichenfalls Mg , Mn , Ca ,Zn , Co oder Fe enthalten.

Der Abbau erfolgt gewöhnlich in wässriger Lösung, man kann jedoch auch eine nicht-wässrige Lösung verwenden. In diesem Falle sollten ein geeignetes Lösungsmittel sowie die Konzentration dahingehend ausgewählt werden, dass nicht die Enzymaktivität inhibiert wird.

Wie vorstehend erwähnt, ist das erfindungsgemasse Verfahren nicht auf die Art der mit R in der Formel bezeichneten Acylgruppe beschränkt, was aus folgenden experimentellen Ergebnissen hervorgeht.

Versuch 2

Verschiedene Ausgangsmaterialien, die in der Tabelle II zusammengefasst sind, werden bei einem pH-Wert von 7,0 mit einer Zellsuspension von Bac. sphaericus ATCC 14577, hergestellt nach der in Versuch 1 beschriebenen Methode, umgesetzt (die Tabelle II zeigt ferner die Verwendung eines Bakterienstammes eines anderen Genus als Bacillus, und zwar Micrococcus rubens ATCC 186, vgl. den weiter unten folgenden Versuch 7, sowie den Einsatz eines Fungus Imperfectus, und zwar Colletotrichum sp. ATCC 20438, vgl. den weiter unten folgenden Versuch 13).

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Tabelle II
Wirkung des Acylrestes auf die Aktivität

Aktivität

R in \. Mikro- Bacillus Micrococcus Colleto-

R-Val-Val\ orga- sphaericus rubens trichum sp.

X-AIa-X Nnismus ATCC 14577 ATCC 186 ATCC 20438

Zeit O Min 60 Min O Min 60 Min 0 Min 60 Min

CH₃-CO- > 200 65 y 200 80 > 200 70

CH₃-CH₂-CO >200 65 >2C0 80 >200 70

CH₃-(CH₂) ₂-C0 >2OO 65 > 200 80 >200 70

⁰⁰S^CH-CO- >200 65 >200 80 >200 70

CH₃-(CH₂J₃-CO- >200 65 >200 80 > 200 65

>200 65 >200 80 >200 65

₃
CH -(CH,) .-CO- >200 70 >200 85 >200 70

3 AH

^CH3^ gh- (CH₀) .,-CO- >200 65 >200 80 >200 70 CH₃/ * ²

CH₃-CH₂-CH-(CH₂) ₂-C0->200 70 >200 80 >200 65

CH₃

CH₃-(CH₂) ₆-C0- >200 65 >200 80 >200 50

Cl-CH₂-CO- >200 65 >200 85 >200 70

ch/ ^l

(Methylester)

3^XCH-CH_O-CO- >200 70 /200 85 > 200 70

Wie aus der Tabelle II hervorgeht, ist die abbauende Wirkung auf Verbindungen mit verschiedenen Acylgruppen oder Estern davon praktisch immer die gleiche.

Einige Vorversuche ergeben die geeignete einzuhaltende Konzentration des Ausgangsmaterials, wobei die Abbaugeschwindigkeit sowie wirtschaftliche Überlegungen berücksichtigt werden. Verbindungen,

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die unter die allgemeine Formel R-Val-Val-X-Ala-X fallen und als Ausgangsmaterialien zur Durchführung der Erfindung eingesetzt werden, können teilweise eine schlechte Löslichkeit in Wasser besitzen, diese Verbindungen können jedoch in Forn- von Salzen oder Suspensionen mit entsprechender Konzentration eingesetzt werden. Ist die Konzentration des eingesetzten Ausgangsmaterials höher als seine Löslichkeit, dann kann ein zufriedenstellendes Ergebnis bei der Durchführung des Abbauverfahrens durch gewisse Modifizierungen erzielt werden, beispielsweise durch eine längere Reaktionszeit, durch langsames Rühren oder durch die Verwendung von weiterer Enzymzubereitung*

Versuch 3

Mischungen aus dem gleichen Ausgangsmaterial, das zur Durchführung des Versuchs 1 eingesetzt wurde, wobei die in der Tabelle III angegebenen Gewichtskonzentrationen eingehalten werden, und der Zellsuspension von Bac. sphaericus ATCC 14577, erhalten gemäss Versuch 2, werden bei 37 C während der in der Tabelle IXI angegebenen Zeitspannen inkubiert. Die Inhalte der Reagenzglaser 5, 6 und 7 werden während der Inkubation gerührt. Die Reagenzgläser 6 und 7 werden mit weiteren 0,5 ml der Zellsuspension nach 24-stündiger Inkubation versetzt (die Tabelle III zeigt ferner die Verwendung eines Bakterienstammes eines anderen Genus als Bacillus, und zwar Escherichia coli ATCC 11303, vgl. den weiter unten folgenden Versuch 8, sowie den Einsatz eines Fungus Imperfectus, und zwar Kabatielle caulivora ATCC 20439, vgl. den weiter unten folgenden Versuch 14).

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Tabelle III

Wirkung der Konzentration des Ausgangsmaterials auf

die Aktivität

Aktivität

Konzentra tion des Ausgangs materials, %	Reak tions zeit, Std.	Bac. sphaericus ATCC 14577	Escherichia coli ATCC 11303	Kabatiella caulivora ATCC 20439
(1) 0,005	■ 1	2,2	2,35	7,5
(2) 0,01	5	2,35	2,5	8,0
(3) 0,05	24	2,35	2,5	8,0
(4) 0,1	24	2,35	2,85	8,0
(5) 0,5	24	2,85	3,0	8,5
(6) 1,0	48	2,85	3,0	8,5
(7) 2,0	48	2,85	3,0	8,5

Wie vorstehend gezeigt wird, verläuft die Abbaureaktion bei jeder beliebigen Konzentration des Ausgangsmaterials durch Auswahl einer geeigneten Reaktionsperiode sowie eines bestimmten Volumens der Zellsuspension, wobei jedoch 0,01 bis 5 Gewichts-% bevorzugte Konzentrationen im Hinblick auf einen wirksamen Verbrauch des Ausgangsmaterials sowie im Hinblick auf wirtschaftliche Erwägungen sind. Geringere Konzentrationen können eingehalten werden, wenn spezielle Methoden angewendet werden, beispielsweise bei Verwendung eines unlöslichen Enzyms oder beim Einsatz von immobilisierten Zellen.

Die Temperatur zur Durchführung des Abbauverfahrens lässt sich leicht durch einige Vorversuche ermitteln und hängt von der Form der Enzymzubereitung, der Art des Ausgangsmaterials sowie von einer wirtschaftlichen Durchführung des Verfahrens ab. Der folgende Versuch zeigt die Wirkung der Temperatur auf die Abbauaktivität von Bac. cereus ATCC 9634.

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Versuch 4

Eine Zellsuspension von Bac, cereus ATCC 9634, hergestellt nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise, sowie das Ausgangsmaterial, das zur Durchführung des Versuchs 1 verwendet worden ist, werden bei einem pH-Wert von 7,0 nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise bei verschiedenen Temperaturen, die in ^ er Tabelle IV angegeben sind, inkubiert, Dia Abbauaktivität wird untersucht (die Tabelle IV zeigt auch die Verwendung eines Bakterienstammes eines anderen Genus als Bacillus, und zwar Arthrobacter ureafaciens ATCC 7562, vgl. den weiter unten folgenden Versuch 9, sowie den Einsatz eines Fungus Imperfectus, und zwar Ascochyta phaseolorum ATCC 14728, vgl. den weiter unten folgenden Versuch 15).

Tabelle IV

Wirkung der Temperatur auf die Aktivität

Kl- ra- r,°C	Bac. cereus ATCC 9634	Aktivität Arthrobacter ureafaciens ATCC 7562	Ascochyta phaseolorum ATCC 14728
20	100	150	150
30	65	80	70
40	50	65	60
50	40	60	40
60	30	55	30
70	50	65	50
80	> 200	>200	>200

Wie aus der Tabelle IV hervorgeht, zeigt Bac. cereus ATCC 9634 eine hohe Aktivität zwischen 30 und 70 C. Der bevorzugte Temperaturbereich dieses Verfahrens liegt zwischen 15 und 75°C, da kei-

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ne Aktivität bei einer tieferen Temperatur trotz einer langsameren Reaktionsgeschwindigkeit verlorengeht.

Wie vorstehend angegeben worden ist, wird das Verfahren der spezifischen Zersetzung gemäss vorliegender Erfindung in der Weise durchgeführt, dass das Enzym in Kontakt mit dem Ausgangsmaterial gebracht wird. Dies kann auch in der Weise erfolgen, dass das Ausgangsmaterial einer wachsenden Kultur des Mikroorganismus zugesetzt wird.

Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Abbauverfahrens kann das Ausgangsmaterial dem Medium in Form einer wässrigen Lösung oder Suspension oder in Form eines Pulvers, und zwar je nach seinen Eigenschaften, hauptsächlich in Abhängigkeit von seiner Löslichkeit in Wasser, während des Züchtens des Mikroorganismus, zu Beginn des Züchtens oder nach einem anfänglichen Wachsen des Mikroorganismus zugesetzt werden. Eine Konzentration von 0,01 bis 5 Gewichts-% des Ausgangsmaterials wird vorzugsweise eingesetzt, wobei dieses auf einmal oder in Portionen zugegeben werden kann.

Ein Produkt dieser Abbaureaktion, ein Tetrapeptid, und zwar L-VaIyl-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptanoyl-L-alany1-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure, kann nach einer der Methoden gew onnen werden, die gewöhnlich für die Isolierung und Reinigung von Oligopeptiden eingesetzt werden, beispielsweise durch Adsorption an Aktivkohle oder einem lonenaustauscherharz, Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, Chromatographie mit Kieselgel oder Aluminiumoxydgel, Gelfiltration oder dergleichen. Der folgende Versuch zeigt das Abbauverfahren unter Verwendung von Bac. cereus ATCC 9634 sowie die Gewinnung eines kristallinen Produktes.

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Versuch 5

Bac. cereus ATCC 9634 wird in der gleichen Weise wie in Versuch 1 gezüchtet. Gewaschene Zellen werden in einem O,0im-Phosphatpuffer mit einem pH von 7,0 suspendiert und mit einer Prench-Presse aufgerissen. Ein zellfreier Extrakt wird durch Zentrifugieren bei IO OOO üpm während einer Seitspanne von 20 Minuten, erhalten. Eine Mischung aus 50 ml von 2 mg/ml n-Caprayl-L-valyl-L~valyl-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptanoyl-L~alanyl-4-amino-3-hydroxy~6-methylheptansäure-Suspension, 50 ml des zellfreien Extraktes und 1 ml Toluol (um einen Schutz gegenüber einer mikrobiellen Kontamination zu gewährleisten) wird bei 37°C während einer Zeitspanne von 15 Stunden inkubiert. Der Niederschlag, der beim Einstellen des pH-Wertes auf 2 unter Verwendung von HCl ausfällt, wird durch Zentrifugieren entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wird auf eine mit Dowex 50 (X4, H⁺-Typ) gefüllte Säule (0 = 2 χ 20 cm) aufgebracht. Die Säule wird mit Wasser gewaschen. Aktive Fraktionen, die mit 0,5n NH₄OH eluiert worden sind, werden gesammelt und mit einem gleichen Volumen n-Butanol extrahiert. Die Butanolschicht wird an einer Kieselgelsäule (0 = 2 χ 30 cm) adsorbiert.

Die Eluierung wird unter Einsatz eines Lösungsmittelsystems aus n-Butanol/Essigsäure/H₂0 mit einem Volumenverhältnis von 4:1:1 durchgeführt. Nach der Konzentration wird die aktive Fraktion gesammelt und auf eine mit Sephadex LH 20 gefüllte Säule (0=1 χ 50 cm) aufgebracht.

Rohe kristalline L-Valyl^-amino-S-hydroxy-ö-methyiheptanoyl-L-alanyl-4-amino-3-hydroxy-6-aminoheptansäure wird aus der aktiven Fraktion der Gelfiltration erhalten. Eine ümkristallisation in Methanol ergibt 45,2 mg farbloser Kristalle.

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- 18 b) Bakterien, die anderen Genera als Bacillus angehören

Nachfolgend werden Beispiele für Bakterien angegeben, die ein Enzym mit der vorstehend geschilderten Fähigkeit erzeugen und zu anderen Genera als Bacillus gehören: Pseudomonas segnis ATCC 4358, Xanthomonas campestris NRRL B1459 (ATCC 13951), Acetobacter rancens NRRL B65 (ATCC 7839), Aeromonas hydrophile NRRL B9O9, Protaminobacter ruber NRRL B1O48 (ATCC 8457), Microcyclus flavus ATCC 23276, Agrobacterium radiobacter ATCC 4718, Alcaligenes faecalis ATCC 8750, Escherichia coli ATCC 11303, Citrobacter freundii ATCC 8090, Enterobacter aerogenes ATCC 8329, Sarcina lutea ATCC 9341, Micrococcus rubens ATCC 186, Staphylococcus epidermidis ATCC 155, Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871, Leuconostoc mesenteroides NRRL B1299 (ATCC 11449), Lactobacillus brevis ATCC 8287, Propionibacterium shermanii ATCC 13673, Corynebacterium equi ATCC 6939, Microbacterium lacticum ATCC 8180, Cellulomonas fimi ATCC 8183, Arthrobacter ureafaciens ATCC 7562 sowie Clostridium butyricum ATCC 6014.

Die Materialien und Methoden zum Züchten der Mikroorganismen sowie die Erzeugung der Enzymzubereitungen, wie beispielsweise von Kulturbrühen, Zellen, teilweise oder hochgereinigten Enzymzubereitungen oder dergleichen, die im Zusammenhang mit den Mikroorganismen beschrieben worden sind, die zu dem Genus Bacillus gehören, können in der gleichen Weise angewendet werden, wenn Bakterien eingesetzt werden, die zu anderen Genera als Bacillus gehören.

Der folgende Versuch zeigt die Wirkung des pH-Wertes auf die Abbauaktivität von Zellsuspensionen von Corynebacterium equi ATCC 6939 und Pseudomonas segnis ATCC 4358.

Versuch 6

Unter Einsatz von Corynebacterium equi ATCC 6939 und Pseudomonas

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segnis ATCC 4358 wird die Wirkung des pH-Wertes auf die Abbauaktivität nach der in Versuch 1 beschriebenen Arbeitsweise untersucht. Die Ergebnisse gehen aus der obigen Tabelle I hervor.

Wie aus der Tabelle I zu entnehmen ist, ist die Aktivität hoch bei pH-Werten zwischen 5 und 8 sowie zwischen 5,5 und 9,0 im Falle von Corynebacterium equi ATCC 6939 bzw. Pseudomonas segnis ATCC 4358.

Die Abbauaktivität ist unabhängig von der Art der Aeyigrupps das Ausgangsmaterials.

Versuch 7

Unter Einsatz von Micrococcus rubens ATCC 186 wird die Abbauaktivität gegenüber verschiedenen Ausgangsmaterialien in der gleichen Weise wie gemäss Versuch 2 untersucht. Die Ergebnisse gehen aus der obigen Tabelle II hervor.

Wie der Tabelle II zu entnehmen ist, wird praktisch die gleiche Aktivität gegenüber sämtlichen verschiedenen Verbindungen beobachtet.

Versuch 8

Unter Einsatz von Escherichia coli ATCC 11303 werden die Konzentration des Ausgangsmaterials sowie die Reaktionszeit bei der Durchführung des Abbauverfahrens in der gleichen Weise wie i:i Versuch 6 untersucht. Die Ergebnisse gehen aus der vorstehenden Tabelle III hervor.

Die Inhalte der Reagenzgläser 5, 6 und 7 werden langsam während der Inkubation gerührt, während in die Reagenzgläser 6 und 7 weitere 0,5 ml der Zellsuspension nach 24-stündiger Inkubation ein-

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gefüllt werden. Wie aus der Tabelle III hervorgeht/ ähneln die Ergebnisse sehr stark denjenigen, die bei der Durchführung des Versuchs 3 ermittelt worden sind.

Versuch 9

Unter Einsatz von Arthrobacter ureafaciens ATCC 7562 wird die Wirkung der Temperatur auf die Abbauaktivität in der gleichen Weise wie in Versuch 6 untersucht. Die Ergebnisse gehen aus der obigen Tabelle IV hervor.

Wie der Tabelle IV zu entnehmen ist, wird eine hohe Aktivität zwischen 30 und 7O°C beobachtet. Die erfindungsgemäss bevorzugt eingehaltene Temperatur liegt zwischen 15 und 75°C, wie bereits erwähnt worden ist, da keine Enzymaktivität bei tieferen Temperaturen trotz der geringen Reaktionsgeschwindigkeit verlorengeht.

Versuch 10

Isovaleryl-L-valyl-L-valyl-^amino-S-hydroxy-e-methylheptanoy.l-L-alanyl-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure wird unter Verwendung einer Zellsuspension von Sarcina lutea ATCC 9341 abgebaut. Das Abbauprodukt wird in der gleichen Weise wie in Versuch 5 gewonnen. Farblosse Kristalle (34 mg) werden erhalten.

Versuch 11

Es wird ähnlich wie gemäss Versuch 10 verfahren, wobei n-Caproyl-L-valyl-L-valyl-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptanoyl-L-alanyl-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure sowie Cellulomonas fimi ATCC 8183 verwendet werden. Man erhält 38 mg des Zersetzungsproduktes in Form von farblosen Kristallen.

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c) Fungi Imperfecti

Nachfolgend werden Beispiele für Mikroorganismen angegeben, die zu dem Genus Fungus Imperfectus gehören, wobei diese Mikroorganismen ein Enzym mit der vorstehend geschilderten Fähigkeit zu erzeugen vermögen: Phomales einschliesslich Macrophomina phaseoli ATCC 20441 sowie Ascochyta phaseolorum ATCC 14728, Melanconiales einschliesslich Colletotorium sp. ATCC 20438 und Kabatiella caulivora ATCC 20439, Moniliales einschliessliche Stemphylium sarcinaeforme ATCC 2044Γ: und Mycelia sterilia einschliesslich Rhizoctonia sp. ATCC 20433 sowie Fusarium sp. ATCC 20440.

Die Materialien und Methoden zum Züchten der Mikroorganismen sowie die Herstellung der Enzymzubereitungen, beispielsweise der Kulturbrühe, der Zellen, partiell oder hochgereinigter Enzymzubereitungen oder dergleichen, ähneln den Methoden, die im Falle von Bakterien angewendet werden, die zu dem Genus Bacillus gehören, mit der Ausnahme, dass das Medium, das gewöhnlich zum Wachsenlassen der Fungi verwendet wird, bei einer Temperatur zwischen 10 und 35°C sowie bei einem pH-Wert zwischen 3 und 8 gehalten wird. Die bevorzugte Inkubationszeit für die Durchführung der Abbaureaktion liegt zwischen 30 Minuten und 72 Stunden.

Der folgende Versuch mit Co1letotrichum sp. ATCC 20438 und Macrophomina phaseoli ATCC 20441 ist ein Beispiel für die Wirkung des pH-Wertes auf die Zersetzung.

Versuch 12

Ein Medium, das 0,5 % Stärke, 0,5 % Glukose, 0,5 % Sojabohnenmehl, 0,1 % KH₂PO₄ und 0,05 % MgSO₄.7H₂O, jeweils bezogen auf das Gewicht, enthält, wird hergestellt, worauf 50 ml des Mediums in einen 500 ml-Kolben gegossen und bei 120°C während einer Zeit-

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spanne von 20 Minuten sterilisiert werden. Das Medium wird mit Colletotrichum sp. ATCC 20438 beimpft.

Nach einer Inkubation bei 28 C während einer Zeitspanne von 72 Stunden auf einem Rotationsschüttler (200 Upm) werden die Zellen durch Zentrifugieren bei 3000 Upm während einer Zeitspanne von 10 Minuten gewonnen. Isovaleryl-L-valyl-L-valyl-4-amino-3-hydroxy-e-methylheptanoyl-L-alanyl^-amino-S-hydroxy-e-methylheptansäure und die Zellen werden bei verschiedenen pH-Werten in der gleichen Weise wie bei der Durchführung des Versuchs 1 inkubiert. Unter Verwendung von Macrophomina phaseoli ATCC 20441 wird die gleiche Methode durchgeführt, wobei ähnliche Ergebnisse erhalten werden, wie aus Tabelle I hervorgeht. Es wird eine hohe Zersetzungsaktivität bei einem pH-Wert zwischen 5,5 und 8,5 mit Colletotrichum sp. ATCC 20438 und bei einem pH-Wert zwischen 5,0 und 9,0 mit Macrophomina phaseoli ATCC 20441 beobachtet.

Versuch" 13

Die in der Tabelle II zusammengefassten verschiedenen Ausgangsmaterialien werden mit einer Zellsuspension von Colletotrichum sp. ATCC 20438, hergestellt wie gemäss Versuch 12, umgesetzt, worauf die Zersetzungsaktivität untersucht wird. Es wird praktisch die gleiche Aktivität gegenüber allen getesteten Verbindungen beobachtet, und zwar unabhängig von Unterschieden bezüglich der Acylgruppe. Die in der Tabelle II gezeigten Ergebnisse sind praktisch die gleichen im Falle des Versuchs 13 sowie des Versuchs 2.

Versuch 14

Das gleiche Ausgangsmaterial, das gemäss Versuch 12 eingesetzt worden ist, sowie eine Zellsuspension von Kabatiella caulivora ATCC 20439, hergestellt nach der Methode gemäss Versuch 12, werden unter Einhaltung der in Tabelle III angegebenen verschiedenen

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Konzentrationen in der gleichen Weise wie bei der Durchführung des Versuchs 3 inkubiert. Die in der Tabelle III zusammengefassten Ergebnisse des Versuchs 14 ähneln denjenigen, die bei der Durchführung des Versuchs 3 ermittelt worden sind.

Versuch 15

Die Wirkung der Temperatur auf die Abbauaktivität wird untersucht, wobei eine Zellsuspension von Ascochyta phaseolorum ATCC 14728, hergestellt nach der Methode gemäss Versuch 12, verwendet wird. Die Ergebnisse sind die gleichen wie bei der Durchführung des Versuchs 4. Eine hohe Aktivität wird, wie aus der obigen Tabelle IV zu ersehen ist, für andere Mikroorganismen bei Temperaturen zwischen 30 und 7O°C erzielt. Wie im Falle von Bakterien kann auch im Falle von Fungi Imperfecti eine Temperatur von 15 bis 75°C eingehalten werden.

Versuch 16

Stemphylium sarcinaeforme ATCC 20442 wird gezüchtet. Die Zellen werden gemäss Versuch 12 gewonnen. Ein zellfreier Extrakt wird in der Weise hergestellt, dass die Zellen unter Verwendung einer French-Presse aufgerissen werden, worauf das Material bei 10000 üpm während einer Zeitspanne von 20 Minuten zentrifugiert wird.

In ähnlicher Weise wie im Falle des Versuchs 5 wird n-Caproyl-L-valyl-L-valyl^-amino-S-hydroxy-G-methylheptanoyl-L-alanyl^- amino-3-hydroxy-6-methylheptansaure mit dem zellfreien Extrakt umgesetzt, wobei 45,2 mg eines farblosen kristallinen Produktes erhalten werden.

d) Enzym

Die Mikroorganismen, welche ein Enzym zu erzeugen vermögen, das

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R-Val-Val-X-Ala-X zu Val-X-Ala-X in spezifischer Weise zersetzt, sind unter folgenden Genera weit verbreitet: Pseudomonas, Xanthomonas, Acetobacter, Aeromonas, Protaminobacter, Microcyclus, Agrobacterium, Alcalignes, Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Micrococcus, Staphylococcus, Sarcina, Brevibacterium, Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Propionibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Cellulomonas, Arthrobacter, Bacillus, Clostridium, Macrophomina, Ascochyta, Colletotrichum, Kabatiella Stemphylium, Fusarium sowie Rhizoctonia,

Das Enzym, das durch diese Mikroorganismen gebildet wird, kann aus den Kulturbrühen aus den Zellen isoliert und gereinigt werden, die durch Züchten der Mikroorganismen unter den vorstehend angegebenen Bedingungen sowie unter Einsatz der vorstehend beschriebenen Medien erhalten werden, Eine kleine Menge des Substrats oder des Ausgangsmaterials des Abbauverfahrens kann dem Medium an einem entsprechenden Zeitpunkt zugesetzt werden, beispielsweise zu Beginn des Züchtens oder nach dem anfänglichen Wachstum, um die Bildung des Enzyms zu induzieren oder um eine stärkere Wirkung des Enzyms zu bewirken. Alle vorstehend angegebenen Mikroorganismen können verwendet werden, jedoch werden die Mikroorganismen, die zu dem Genus Bacillus gehören, zur industriellen Produktion des Enzyms in bevorzugter Weise eingesetzt. Das Züchten des Mikroorganismus kann in einer flüssigen oder festen Kultur durchgeführt werden, wobei jedoch eine Submerskultur Vorteile bei der Durchführung in industriellem Maßstabe bietet. Gereinigtes Enzym wird aus der Kulturbrühe gewonnen. Das gereinigte Enzym besteht aus einem zellfreien Extrakt, der durch Extraktion mit Wasser oder einer Pufferlösung aus den Zellen nach einem Aufbrechen mit einem Schalloszillator, einer French-Presse oder einer Homogenisierungseinrichtung, unter Einsatz eines Lysozyms, eines organischen Lösungsmittels oder dergleichen durch Aussalzen unter Verwendung von Ammoniumsulfat, unter Einsatz einer O-(Diäthyl-

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aminoäthyl)-Zellulose (DÄM-Zellulose) -Chromatographie, einer Sephadex G-200-Gelfiltration sowie einer zweiten DÄAX-Zellulose-Chromatographie hergestellt wird. Eine Streptomycin-Behandlung kann erforderlichenfalls zur Entfernung von Nukleinsäuren durchgeführt werden. Eine Wärmebehandlung bei 60 C während einer Zeitspanne von 10 Minuten vor der ersten D&AÄ-Zellulose-Chromatographie kann ebenfalls durchgeführt werden und liefert zufriedenstellende Ergebnisse. In einigen Fällen kann das Ammoniumsulfat-Aussalzen weggelassen werden. Dies hängt von der anfänglich zur Durchführung der Reinigung eingesetzten Rohsubereitung ab.

Der folgende Versuch zeigt im Detail die Reinigungsmethode. Versuch 17

Ein Medium, das die gleiche Zusammensetzung wie das Medium gemäss Versuch 1 aufweist, wird hergestellt,, worauf 50 ml dieses Mediums in einen 500 ml-Kolben gegossen werden. Nach einer Sterilisation bei 12O°C während einer Zeitspanne von 10 Minuten wird das Medium mit Bacillus sphaericus ATCC 14577 beimpft and in einer sich hin- und herbewegenden Schüttelvorrichtung (120 üpm) bei 30°C während einer Zeitspanne von 24 Stunden zur Gewinnung einer Impfkultur inkubiert. In einen 20 1-Gärungsbehälter werden 10 1 eines Mediums mit der gleichen Zusammensetzung gegeben, worauf dieses bei 1200C während einer Zeitspanne von 15 Minuten sterilisiert und mit der Impfkultur beimpft wird. Das Züchten erf<
und Belüftung (5 1/Minute).

impft wird. Das Züchten erfolgt bei 30°C unter Rühren (300 üpm)

Nach einem 15-stündigen Wachsenlassen wird Isovaleryl-L-valyl-L-valyl^-amino-S-hydroxy-e-methylheptanoyl-L-alanyl^-amino-S-hydroxy-6-methylheptansäure der Kultur in einer Konzentration von 50 mcg/ml zugesetzt, worauf das Züchten während einer Zeit-

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spanne von weiteren 33 Stunden fortgesetzt wird. Die Zellen werden durch Zentrifugieren unter Einsatz einer Sharpless-Zentrifuge gesammelt, in 2 1 eines kalten 0,01m-Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,0 suspendiert und durch eine Schallbehandlung bei 20 Kilohertz während einer Zeitspanne von 2 Minuten aufgebrochen. Diese sowie die folgenden Methoden werden bei einer Temperatur von 4°C durchgeführt. Die überstehende Flüssigkeit des bei der Schallbehandlung erhaltenen Produkts wird auf 60°C während einer Zeitspanne von 10 Minuten bei einem pH-Wert von 7 erhitzt. Der erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt, worauf 3,8 g Streptomycinsulfat zu 1,7 1 der überstehenden Flüssigkeit zugesetzt werden. Ausgefällte Nukleinsäure wird durch Zentrifugieren entfernt. Die auf diese Weise erhaltene überstehende Flüssigkeit wird gegen 0,01mtris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 8,0 während einer Zeitspanne von 16 Stunden dialysiert. Die dialysierte überstehende Flüssigkeit wird an einer DÄAÄ-Zellulosesäule (1 1), die zuvor mit einer 0,01m-tris-HCl-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0 ins Gleichgewicht gebracht worden ist, adsorbiert, worauf die Säule mit dem gleichen Puffer sowie mit 0,Im-NaCl, gelöst in dem gleichen Puffer, aufeinanderfolgend gewaschen wird. Das Enzym wird mit 3 1 einer Lösung aus 0,3m-NaCl in dem gleichen tris-Puffer eluiert. Das aktive Eluat wird unter Einsatz einer Ultrafiltrationsvorrichtung konzentriert und einer Gelfiltration mit einer Sephadex-G-200-Säule (# = 5 χ 100 cm) unterzogen, die mit dem gleichen tris-Puffer, der 0,2m-NaCl enthält, ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Die aktiven Fraktionen, die aus der Säule auslaufen, werden gesammelt und gegenüber einer 0,01m-Phosphatpufferlösung nit einem pH-Wert von 6,5 während einer Zeitspanne von mehr als 6 Stunden dialysiert. Die dialysierte Lösung wird an einer DÄAÄ-Zellulosesäule (50 ml) adsorbiert, die mit dem gleichen Phosphatpuffer ins Gleichgewicht gebracht (äquilibriert) worden ist. Die Säule wird nacheinanderfolgend mit dem Puffer und mit 150 ml des gleichen Puffers, der 0,Im-NaCl

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enthält, gewaschen. Das Enzym wird unter Einhaltung eines linearen Gradienten von 6Θ0 ml einer O,1m-NaOl-Lösung bis 600 ml einer O,3m-NaCl-Iiösung in dem gleichen Phosphatpuffer eluiert.

Eine Zusammenfassung der Werte der Reinigung geht aus der Tabelle V hervor.

Tabelle V
Reinigung des Enzyms

Gesamt- Gesamt- Spezifische Ausbeute, volumen, aktivit- Aktivität, % ml tat, Einheiten/ Einheitenmg Protein

Überstehende Flüssigkeit des schall- 1 700 behandelten Materials

erste DÄAÄ-Zellulose-^ behandlung

Sephadex G-200

zweite DÄAÜ-Zellulosebehandlung __

Die Enzymzubereitung, die aus einem aktiven Peak bei der Chromatographie erhalten wird, ergibt eine einzige Bande bei einer Scheibengelelektrophorese, einer Gelektrofokusierung sowie bei einer Ultrazentrifugenbehandlung und weist die folgenden enzymatischen und physikochemischen Eigenschaften auf.

d)-1 Wirkung und Substratspezifizität

Dieses Enzym ist sowohl bezüglich seiner Wirkung als auch seiner Substratspezifität einzigartig. Es wirkt auf eine Verbindung der allgemeinen Formel R-Va1-Val-X-AIa-X zur Gewinnung eines Peptids (Val-X-Ala-X), einer organischen Säure (RCOOH) und L-Valin. Es hydrolysiert zwei C-NH-Bindungen, wie durch die Zahlen

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700	10	500	o,	02	100
520	7	392	o,	11	70
61	5	491	73		52
28	1	900	225		18

1 und 2 in der folgenden Formel gezeigt wird:

CH₃ CH₃ . ^ CHo CH₃ £ ^NCH *■ CIT

v !^H 1 /^CH\

C,—I—NH- ^VC ^!—-NHT -.C X—AIa—X

M ί. Ii ' ι II

Ο« 0 ί Ο

Man nahm bisher an, dass die Wirkungen auf die zwei Bindungen auf verschiedene enzymatische Wirkungen zurückgehen, und zwar eine Aminoacylase-Wirkung (T) und eine Peptidasewirkung (2), dieses Enzym übt jedoch beide Wirkungen aus. Eine noch interessantere und wichtigere Eigenschaft, die nachfolgend noch näher beschrieben wird, besteht darin, dass dieses besondere Enzym keine anderen C-N-Bindungen aufspaltet, beispielsweise die Bindung zwischen dem L-Valin und X, X und L-Alanin oder L-Alanin und X. Die Wirkung auf verschiedene Arten von N-Acylpeptiden_f die in der Tabelle VI angegeben ist, zeigt eine sehr interessante Substratspezifität. Diese Ergebnisse wurden bei der Durchführung einer 20 Stunden dauernden Reaktion unter den Bedingungen erhalten, die nachfolgend unter dem Abschnitt "Untersuchung der Aktivität" beschrieben werden.

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Tabelle VI Substratspezifität

Substrat

Val-X-Ala-X

IVA-VaI
IVA-Val-Val
IVA-VaI-Va1-X I IVA-Val-Val-X-Ser IVA-Val-Val-X-Ala-X IVA-Val-Val-X-Ala-Thr IVA-Val-Val-X-Ser-X

Acetyl-Val-Val-X-Ala-X

Propionyl-Val-Val-X-AIa-X

II Isovaleryl-Val-Val-X-AIa-X

Caproyl -Val-Val-X-Ala-X

Isocaproyl-Val-Val-X-AIa-X

Acetyl-Val-X-Ala-X Isovaleryl-Val-X-Ala-X III Palmitoyl-Val-X-Ala-X Benzyl-Val-X-Ala-X

2-Phenoxypropionyl-Val-X-AIa-X

Produkte Organische Säuren

L-Valin

xx

^xxx

XXXX

In der Tabelle besitzen die Symbole folgende Bedeutungen:

IVA: Isovaleryl, Ser: L-Serin, Thr: L-Threonin χ

XX

XXX

XXXX

VaI-X anstatt Val-X-Ala-X Val-X-Ser anstatt Val-X-Ala-X Val-X-Ala-Thr anstatt Val-X-Ala-X Val-X-Ser-X anstatt Val-X-Ala-X 508836/0973

Der Gruppe I in der Tabelle ist die Empfindlichkeit von N-Isovalerylpeptiden gegenüber dem Enzym zu entnehmen. IVA-VaI sowie IVA-Val-Val, wobei IVA für Isovaleryl steht, werden nicht durch das Enzym gespalten. Die Hydrolyse erfolgt an den N-Acylpeptiden mit einer längeren Kette als sie IVA-Val-Val besitzt, wie beispielsweise IVA-Va1-VaI-X. Die Produkte dieser Reaktion sind Isovaleriansäure, L-Valin und VaI-X. IVA-Val-Val-X-Ser, wobei Ser für L-Serin steht, IVA-Val-Val-X-Ala-X mit mehr Aminosäureresten als die vorstehend angegebene Verbindung, IVA-Val-Val-X-Ala-Thr mit L-Threonin an dem Ende eines Carboxy1-restes, wobei Thr für L-Threonin steht, und IVA-Val-Val-X-Ser-X mit einem L-Serinrest anstelle von L-Alanin sind jeweils gegenüber dem Enzym anfällig. In diesen Fällen bestehen die Reaktionsprodukte zusätzlich zu Isovaleriansäure und L-Valin aus VaI-X, Val-X-Ser, VaI-X-AIa-X, Val-X-Ala-Thr bzw. Val-X-Ser-X. Die Gruppe II in der Tabelle gibt eine Beziehung zwischen der Art der Acylgruppe und der Empfindlichkeit bzw. Anfälligkeit wieder. Dieses Enzym ist ebenfalls gegenüber anderen Peptiden als Isovalerylpeptiden aktiv. Dies bedeutet, dass Acetyl-Val-Val-X-AIa-X, Propionyl-Val-Val-X-Ala-X, Isovaleryl-Val-Val-X-Ala-X, n-Caproyl-Val-Val-X-Ala-X sowie Isocapropyl-Val-Val-X-Ala-X jeweils in organische Säuren, L-Valin und Val-X-Ala-X gespalten werden. Kein N-Acylpeptid mit einer Acylgruppe an dem N-Ende des Valins in Nachbarstellung zu dem X, wie beispielsweise N-Acyl-Val-X-Ala-,ist gegenüber diesem Enzym anfällig, wie der Gruppe III zu entnehmen ist. Dieses besondere Enzym wirkt auf die Moleküle von N-Acylpeptiden der allgemeinen Formel R-Val-Val-X-zur Gewinnung von Peptiden (VaI-X-), organischen Säuren und L-Valin ein. Bisher war kein Enzym mit der vorstehend geschilderten Wirkung und Substratspezifität bekannt.

d)-2 Optimaler pH und pH-Stabilität

Öer optimale pH-Wert der enzymatischen Reaktion beträgt 7,0.

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Die Hydrolysereaktion kann auch bei einem schwach sauren oder schwach alkalischen pH-Wert erfolgen, wie aus Fig. 1 hervorgeht. Dieses Enzym ist bei einem pH-Wert zwischen 6 und 9 stabil, wie aus Fig. 2 hervorgeht.

d)-3 Untersuchung der Aktivität

Die enzymatische Aktivität wird in der Weise untersucht, dass die organische Säure, die aus dem N-Acylpeptid freigesetzt wird, gaschromatographisch gemessen wird.

Die Aktivität wird erfindungsgemäss gemäss folgender Methode ermittelt: Eine Reaktionsmischung aus 5 mg/ml IVA-Val-Val-X-AIa-X, O,05m-Phosphatpuffer, pH 7,0 und Enzym in einem Gesamtvolumen von 1,0 ml wird bei 37°C während einer Zeitspanne von 30 Minuten inkubiert. Gebildete Isovaleriansäure wird mit Äther extrahiert und gaschromatographisch mit n-Valeriansäure als Innenstandard untersucht. Eine Aktivitätseinheit entspricht der Bildung von 1 η-Mol Isovaleriansäure pro Minute.

Die Enzymaktivität kann auch in der Weise untersucht werden, dass L-Valin oder Val-X-Ala-X mit einem Aminosäure-Autoanalysator gemessen werden oder eine Densitometrie auf einem Dünnschi chtchromatogramm, das mit Ninhydrin behandelt worden ist, durchgeführt wird. Die in Versuch 1 beschriebene Methode kann ebenfalls angewendet werden.

d)-4 Optimale Temperatur

Die optimale Temperatur beträgt 63°C. IVA-Val-Val-X-Ala-X wird mit dem Enzym unter den Bedingungen inkubiert, die vorstehend unter dem Abschnitt "Untersuchung der Aktivität" beschrieben worden sind, mit der Ausnahme, dass verschiedene Temperaturen eingehalten werden. Die Ergebnisse gehen aus der

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Fig. 3 hervor. Der Temperaturbereich zur Erzielung der optimalen Aktivität beträgt 15 bis 7O°C.

d)-5 Wärmestabilität

Das Enzym ist sehr wärmestabil. Nach einer Behandlung bei 8O°C während einer Zeitspanne von 10 Minuten bei einem pH-Wert von 7 sind noch 60 % der ursprünglichen Aktivität vorhanden. Bei einem Erhitzen auf 90 C während einer Zeitspanne von 10 Minuten gehen 98 % der Aktivität verloren. Die Fig. 4 gibt eine Wärmeinaktivierungskurve wieder.

d)-6 Inhibierung und Aktivierung

Die Inhibierung des Enzyms wird in Gegenwart von 2mM o-Phenanthrolin, p-Chlormercuribenzoat, ß-Merkaptoäthanol, Dithiothreit, N-Bromsuccinimid und HgCl- beobachtet. Die Zugabe von Co hat eine Erhöhung der Aktivität um 34 % bei 2 mM und 66 % bei 10 mM zur Folge, während die Zugabe von Ca eine 29 %ige Erhöhung der Aktivität bei 10 mM bewirkt. Die Tabelle VII zeicrt die Wirkung von verschiedenen Reagentien auf die Aktivität.

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Tabelle VII

Wirkung von verschiedenen Inhibitoren und Metallionen

Inhibitoren und Metallionen

Äthylendiamintetraessigsäure o-Phenanthrolin p-Chlormercuribenzoat Monojodessigsäure Diisopropylphosphorfluoridat ß-Merkaptoäthanol Dithiothreit NaN₃

N-Bromsuccinimid Bleiacetat

Quecksilber(II)-acetat Kobaltchlorid

Kalziumchlorid

Zinkchlorid

Vergleich (keine Zugabe)

d)-7 Physicochemische Eigenschaften

Eine Scheibengelelektrophorese ergibt eine einzige Bande mit einem R_D_ -Wert von 0,048 bei einem pH von 9,5 in einem 7,5 %igen Acrylamidgel und von 0,232 in einem 5 %igen Gel. Eine Gelelektrofokusierung ergibt eine einzige Bande eines isoelektrischen Punktes bei einem pH-Wert von 4,2. Das Molekular-

Konzentration, mM	Relative Aktivität
2	30
2	0
2	2
2	84
10	100
2	0
2	0
2	100
2	0
2	43
2	0
2	134
10	166
2	110
10	129
2	66
10	44
	100

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gewicht des Enzyms wird nach der Gelfiltrationsmethode berechnet, wobei ein Wert von 345 000 ermittelt wird. Der Sedimentationskoeffizient wird zu 14,5S berechnet. Bei der Durchführung einer SDS-Gelelektrophorese wird eine einzige Bande beobachtet, deren Molekulargewicht zu 45 500 berechnet wird. Dies legt das Vorliegen von Untereinheiten nahe.

Wie vorstehend ausgeführt wurde, weist dieses besondere Enzym einige neue und einzigartige Eigenschaften auf. In erster Linie werden saure'Proteaseinhibitoren, wie Pepstatine, restriktiv und spezifisch durch dieses Enzym hydrolysiert. Ferner weist dieses Enzym, das eine einzige Bande bei der Scheibengelelektrophorese, der Gelelektrofokusierung sowie beim Ultrazentrifugieren ergibt, sowohl eine Acylase- als auch Peptidaseaktivität auf. Ferner zeigt es einzigartige Substratspezifjt&t. Nur N-Acyl-valyl-valyl^-amino-S-hydroxy-e-methylheptanoyl-Verbindungen sind gegenüber diesem Enzym empfindlich. N-Acylvalin, N-Acylvalylvalin und N-Acylvalyl^-amino-S-hydroxy-ö-methylheptanoyl-Verbindungen werden nicht angegriffen. Die Bindung, die gegenüber diesem Enzym anfällig ist, ist eine Bindung zwischen einer Acylgruppe und L-Valin sowie eine Bindung zwischen L-Valin und L-Valin. Eine Bindung zwischen L-Valin und X sowie andere Bindungen werden nicht aufgespalten. Kein Enzym mit den vorstehend geschilderten Eigenschaften ist bisher gefunden worden. Dieses Enzym eignet sich zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens, d.h. zur Herstellung des neuen physiologisch aktiven Peptids sowie seiner N-Acylderivate. Ferner kann das Enzym auch auf andere Verfahren angewendet werden, beispielsweise auf eine Modifizierung von Antibiotika, Hormonen sowie Enzyminhibitoren sowie zur Herstellung von neuen physiologisch aktiven Substanzen durch eine Kombination aus enzymatischer Reaktion und chemischer Synthese.

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- 35 e) Identifizierung des Hydrolyseproduktes

Das Produkt des enzymatischen Abbaus von R-Val-Val-X-Ala-X ist eine neue Verbindung, wie vorstehend erwähnt wurde. Die Identifizierung sowie die Eigenschaften der Verbindung werden nachfolgend angegeben:

Die Verbindung wird in Form von farblosen Kristallen mit einem F. von 171 bis 172°C (verfärbt bei 168°C) und(fc]p³ = - 51,0 (1 Gewichts-% in Methanol) erhalten. Die Fig. 5 zeigt das UV-Spektrum. Das IR-Spektrum geht aus Fig. 6 hervor, wobei die folgenden Banden beobachtet werden: 332O_r 3090, 2955, 1660, 1545, 1470, 1450, 1390, 1300, 1260, 1178, 1080, 938, 890, 860, 760 und 650 cm . Eine Aminosäureanalyse des Hydrolysats der Kristalle in 6 n-HCl bei 105 C während einer Zeitspanne von 15 bis 24 Stunden ergibt L-Valin, L-Alanin sowie 4-Amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure in einem Verhältnis von 1:1:1,6 bis 1,9. Es wird keine organische Säure bei Einsatz eines Ätherextraktes des Hydrolysats auf gaschromatographischem Wege festgestellt. Die Elementaranalyse ergibt folgende Werte: C = 57,37, H = 9,16, N = 11,20 und 0 = 22,27, woraus sich die Formel ^C24^H46°7^N4 ^ableitet. Nimmt man an, dass die Verbindung das Hydrolyseprodukt von R-Val-Val-X-Ala-X ist, dann kann man von folgender Verbindung ausgehen : L-VaIyl^-amino-S-hydroxy-e-methylheptanoyl-L-alanyl^- amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure. Das Massenspektrum einer acetylierten Verbindung des Produktes gibt ebenfalls diese Struktur wieder. Daher kann die Struktur des Produktes der Hydrolyse von R-Val-Val-X-Ala-X, die durch das vorstehend genannte Enzym bewirkt wird, als bestimmt angesehen werden.

Das Produkt ist in Methanol, Äthanol, Pyridin und Essigsäure löslich, leicht löslich in n-Propanol, n-Butanol, η-Amy!alkohol

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und Azeton, jedoch unlöslich in Äther, Äthylacetat und Butylacetat. Es liefert positive Thionylchlorid-, Hydroxaminsäure/Eisen(III)-chlorid-, Kaliumpermanganat-, Rydon-Smith- und Ninhydrin-Reaktionen, jedoch negative Ehrlich-, Sakaguchi-, Naphthoresorcinsowie Anisaldehyd/Schwefelsäure-Reaktionen.

Die folgenden Rf-Werte dieser Verbindung werden bei einer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer Kieselgelplatte festgestellt: 0,57, 0,15 und 0,23 in Lösungsmitte!systemen aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser (4:1:1, bezogen auf das Volumen), n-Butanol, Butylacetat, Essigsäure und Wasser (4:1:1:1, bezogen auf das Volumen) bzw. wässrigem n-Butanol. Das Produkt wandert in Richtung auf die Kathoden als Kation bei der Durchführung einer Hochspannungspapierelektrophorese bei 3 500 V während einer Zeitspanne von 15 Minuten sowie unter Verwendung einer Pufferlösung aus Ameisensäure, Essigsäure und Wasser (25:75:900, bezogen auf das Volumen).

f) Acylierung

Eine Acylierung des Peptids Val-X-Ala-X, das durch Hydrolyse von R-Val-Val-X-Ala-X mit den verschiedenen Enzymzubereitungen gemäss a) bis d) erhalten worden ist, wird an der Aminogruppe des Valins nach üblichen Methoden durchgeführt.

Jedes geeignete Acylierungsmittel, das die in die Aminogruppe einzuführende gewünschte Gruppe besitzt, kann verwendet werden. Geeignete Beispiele sind Carbonsäurehalogenide, Carbonsäureanhydride oder gemischte Anhydride, Thiocarbonsäuren sowie Ester von Halogencarbonsäuren. Diese Mittel können jede Gruppe, die mit der Aminogruppe des Peptids verbunden werden soll, aufweisen. Die vorstehend erwähnte Gruppe des Mittels kann ferner beispielsweise eine Hydroxy-, Alkoxy-, Amino- oder Halogengruppe tragen.

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Nachfolgend werden Beispiele für derartige Mittel angegeben: Carbonsäurehalogenide, Carbonsäureanhydride oder gemischte Anhydride, Thiocarbonsäureanaloga sowie Ester von Halogencarbonsäuren, die eine Formyl-, Acetyl, Propionyl-, Butyryl-, Isobutyryl-, Valeryl-, Isovaleryl-, Caproyl-, Isocaproyl, Heptanoyl-, Capryloyl-, Capryl-, Lauroy1-, Myristoyl-, Palmitoyl-, Stearoyl-, Arachidoyl-, Oleoyl-, Erucyl-, Linoleoyl-, Linolenoyl-, ß-Hydroxypropionyl-, Oxalyl-, Malonyl-, Benzoyl-, Cinnamoyl-, Phthaloyl-, Acryloyl-, Phenoxyacetyl- oder Phenoxypropionylgruppe tragen.

Zur Durchführung der Acylierungsreaktion können geeignete Bedingungen der üblichen Methoden eingehalten werden. Das N-acylierte Peptid wird durch die folgende Reaktion gebildet:

^CH3· ^h CH₃ CH₃

CH · Acylierung ^V

H₂N-HC-CO-X-AIa-X Acyl-N-HC-CO-X-AIa-X

(deren Salze oder Ester) ⁿ

Werden Ester des Peptids zur Durchführung der Reaktion verwendet, dann kann freies N-Acylpeptid durch Verseifung des veresterten Produktes erhalten werden. Wie bereits erwähnt wurde, sind die auf diese Weise erhaltenen N-Acylpeptide neue und wertvolle Verbindungen, die verschiedene physiologische Aktivitäten besitzen. Die Verbindungen lassen sich auf dem Gebiet der Medizin, Biochemie oder dergleichen einsetzen.

g) Antiprotease-Aktivität und Toxizität

Als Beispiel für eine der physiologischen Aktivitäten des Peptids

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sowie von seinen N-Acylderivaten, die erfindungsgemäss erhalten werden, sei die Antipepsin- sowie die Antikathepsin D-Aktivität erwähnt. Diese Aktivitäten sind ebenso wie die akute Toxizität in der Tabelle VIII zusammengefasst. Die Aktivitäten (ID₅₀) werden nach der Methode ermittelt, die vorstehend beschrieben worden ist und in "The Journal of Antibiotics" 25, 689 (1972) geschildert wird. Die Antiprotease-Aktivitäten des Peptids sowie seiner N-Acylderivate sind extrem hoch. Verwendet man Mäuse zur Bestimmung der Toxizität, so stellt man fest, dass sie sehr niedrig ist.

Tabelle VIII
Antiprotease-Aktivität und akute Toxizität

Peptid und N-Acy!peptid

ID₅₀ (mcg/ml)
Pepsin Kathepsin D

Val-X-Ala-X

Acetyl-Val-X-Ala-X

Isobutyry1-Val-X-Ala-X Isovaleryl-Val-X-Ala-X Benzoyl-Val-X-Ala-X

Phenoxyacetyl-Val-X-Ala-X

Phenoxypropionyl-Val-X-AIa-X

Palmitoyl-Val-X-Ala-X

9,98

0,031

0,021

0,01

0,031

0,02

0,02 0,45

6,5

0,42

0,28

0,045

0,05

0,008

0,01
1,1

Akute Toxizität, mg/kg

LD_ 5000 oder mehr

LD

0 4000 oder mehr 3000 oder mehr

LD

LD₅₀ 1350

LD LD

₅₀

1500 2100

Bemerkung: Die akute Toxizität wird in der Weise untersucht, dass die Verbindungen an Mäuse durch abdominale Injektion verabreicht werden.

Erfindungsgemäss können das neue Peptid der Formel Val-X-Ala-X sowie verschiedene N-Acylderivate davon hergestellt werden, beispielsweise N-Acetyl-, N-Propionyl-, N-Butyryl-, N-Isobutyryl-,

5 0 9 C- 3 6 / 0 9 7 3

N-Valeryl-, N-Isovaleryl-, N-Caproyl-, N-Isocaproyl-, N-Heptanoyl-, N-Isoheptanoyl-, N-Anteisoheptanoyl-, N-Octanoyl, N-Lauroyl-, N-Myristoyl-, N-Palmitoyl-, N-Stearoyl-, N-Oleoyl-, N-Benzoyl-, N-Phthaloyl-, N-Acryloyl-, N-Phenoxyacetyl-, N-Phenoxypropionyl-, N-OxalyJ-, N-Malonyl- sowie N-ß-Hydroxypropionylpeptid.

Die folgenden Beispiele erläutern Methoden zur Durchführung der Erfindung. Diese Beispiele sollen jedoch die Erfindung nicht beschränken.

Beispiel 1

Ein Medium, das aus 1 % Pepton, 0,7 % Fleischextrakt, 0,5 % Glukose und 0,3 % NaCl, jeweils bezogen auf das Gewicht, besteht und einen pH-Wert von 7 besitzt, wird hergestellt. Das Medium (50 ml/500 ml-Kolben) wird bei 120°C während einer Zeitspanne von 10 Minuten sterilisiert und mit einer Kultur von Bacillus sphaericus ATCC 14577 beimpft. Nach einer Inkubation auf einem sich hin- und herbewegenden Schüttler (120 üpm) bei 30°C während einer Zeitspanne von 48 Stunden werden durch Zentrifugieren mit 10 000 Upm die Zellen gesammelt und in einem O,01m-Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) (ODg₁₀ ~ ³⁵) suspendiert. Eine Mischung aus 50 ml der Zellsuspension, 50 ml von 2 mg/ml Isovaleryl-L-valyl-L-valyl^-amino-S-hydroxy-e-methylheptanoyl-L-alanyl-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure und 0,5 ml Toluol wird bei 37°C während einer Zeitspanne von 24 Stunden inkubiert. Die überstehende Flüssigkeit, die durch Zentrifugieren der inkubierten Mischung nach einer pH-Einstellung auf einen Wert von 2 mit HCl erhalten wird, wird auf eine mit Dowex 50 (H ) gefüllte Säule (0 = 3 χ 5 cm) aufgebracht. Die Säule wird mit H₂O gewaschen. Mit 0,5n NH.OH eluierte aktive Fraktionen werden vereinigt und mit einem gleichen Volumen n-Butanol extrahiert. Die

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Chromatographie des Extraktes wird unter Einsatz einer Kieselgelsäule (0 = 2 χ 30 cm) durchgeführt, wobei ein Lösungsmittelsystem aus n-Butanol, Essigsäure und H₂O (4:1:1, bezogen auf das Volumen) verwendet wird. Die aktive Fraktion wird auf eine mit Sephadex LH-2O gefüllte Säule (0=1 χ 50 cm) zur Durchführung einer Gelfiltration aufgebracht. Durch Konzentration der aktiven Fraktion aus der Sephadex-Säule werden Kristalle erhalten, Eine ümkristallisation aus Methanol liefert 45,3 mg kristalliner L-VaIyl-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptanoyl-L-alanyl-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure (Val-X-Ala-X). Unter Verwendung von Escherichia coli ATCC 11303. Ih genau der gleichen Weise wird das gleiche Ausgangsmaterial hydrolysiert, wobei 36,5 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X erhalten werden.

Beispiel 2

Bacillus megaterium NRRL B938 (ATCC 13639) wird in einer Weise gezüchtet, die der in Beispiel 1 beschriebenen ähnlich ist. Die Zellen werden entfernt.

Zu 200 ml des Brühenfiltrats werden 100 mg n-Caproyl-L-valyl-L-valyl^-amino-S-hydroxy-e-methylheptanoyl-L-alanyl^-amino-S-hydroxy-6-methylheptansäure gegeben. Die Mischung wird bei 37°C unter leichtem Rühren während einer Zeitspanne von 24 Stunden inkubiert. Nach einer Methode, die der in Beispiel 1 beschriebenen ähnlich ist, werden 42,8 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X erhalten.

Die vorstehend beschriebene Arbeitsweise wird unter Einsatz von Staphylococcus epidermidis ATCC 155 wiederholt. Man erhält 29 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X.

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Beispiel 3

Bacillus sphaericus ATCC 14577 wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 gezüchtet, mit der Ausnahme, dass die Inkubation während einer Zeitspanne von 20 Stunden durchgeführt wird. Die Kultur wird aseptisch in einer Menge von 5 ml pro 100 ml der Gärbrühe von Pepstatin zugesetzt, das während einer Zeitspanne von 96 Stunden gezüchtet worden ist, und zwar gemäss dem Beispiel der US-PS 3 740 319.

Die Gärung bei 27 C wird während einer Zeitspanne von weiteren 35 Stunden fortgesetzt. Nach der gleichen Arbeitsweise wie in Beispiel 1 werden 38,8 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X von 1 1 des Brühenfiltrats gewonnen. Verwendet, man Brevibacterium ammoniagenes ATCC 68711 in der gleichen Weise, dann erhält man 25,7 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X.

Beispiel 4

Bacillus sphaericus ATCC 14577 wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 wachsen gelassen. Nach einem 16-stündigen Wachstum wird ein feines Pulver des gleichen Ausgangsmaterials, das gemäss Beispiel 1 verwendet worden ist,aseptisch der Kultur zugesetzt, wobei eine Endkonzentration von 2 mg/ml eingestellt wird. Nach einem weiteren Züchten während einer Zeitspanne von 30 Stunden werden 39,5 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X aus 50 ml des Brühenfiltrats nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode abgetrennt. Nach der gleichen Methode werden unter Einsatz von Microbacterium lacticum ATCC 8180 32 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X erhalten.

Beispiel 5

Eine Zellsuspension von Bacillus megaterium NRRL B938 (ATCC

13639), hergestellt nach der Methode gemäss Beispiel 1, wird gefriergetrocknet. Zu 50 ml der gleichen Lösung des Ausgangsmaterials, das gemäss Beispiel 1 verwendet worden ist, werden 0,7 g der gefriergetrockneten Zellzubereitung sowie Wasser zur Einstellung eines Gesamtvolumens von 100 ml zugesetzt. Der pH wird auf 7,0 eingestellt. Die Mischung wird bei 37°C während einer Zeitspanne von 24 Sekunden inkubiert.Nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise werden 45,4 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X gewonnen.

Verfährt man in der vorstehend beschriebenen Weise unter Einsatz von Enterobacter aerogenes ATCC 8329, dann erhält man 30,2 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X.

Beispiel 6

Eine Zellsuspension von Bacillus circulans ATCC 13403 wird nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode hergestellt.Die Suspension wird mit einer French-Presse behandelt. Durch Zentrifugieren mit 10 000 üpm während einer Zeitspanne von 20 Minuten erhält man einen zellfreien Extrakt. 30 g Ammoniumsulfat werden zu 50 ml des Extrakts zugesetzt. Der Niederschlag wird in einer kleinen Menge eines O,01m-Phosphatpuffers (pH 7,2) aufgelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Die dialysierte Lösung wird an einer DÄAÜ-Zellulosesäule (0 = 3 χ 30 cm), die mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist, adsorbiert. Die Säule wird mit dem gleichen Puffer gewaschen, worauf das Enzym mit dem gleichen Puffer, der 0,3m NaCl enthält, eluiert wird. Eine Mischung aus 50 ml der partiell gereinigten Enzymlösung (OD₂RO ⁼ ^^ ^un(* ^⁰ "¹^ ^^er 9ΐ^β^^οηβη Lösung des Ausgangsmaterials, das gemäss Beispiel 1 verwendet worden ist, wird bei 37°C während einer Zeitspanne von 5 Stunden inkubiert. Nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise werden 49 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X aus der Reaktionsmischung erhalten. In

ähnlicher Weise werden bei Einsatz von Alcaligenes faecalis ATCC 8750 36 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X erhalten.

Beispiel 7

Ein Medium, das aus 1 Teil Weizenkleie und 1 Teil einer 0,2 Gewichts-%igen Hefeextraktlösung besteht, wird bei 12O°C während einer Zeitspanne von 10 Minuten sterilisiert und dann mit einer Kultur von Bacillus subtilis NRRL B543 (ATCC 10783) beimpft. Das Züchten wird bei 30°C während einer Zeitspanne von 96 Stunden durchgeführt. Das Enzym wird mit einem 5-fachen Volumen eines O,01m-Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7 extrahiert. Eine Mischung aus 200 ml des Extrakts und 100 mg eines feinen Pulvers des gleichen Ausgangsmaterials, das gemäss Beispiel 1 eingesetzt worden ist, wird unter leichtem Rühren bei 37 C während einer Zeitspanne von 20 Stunden inkubiert. Unter Einhaltung der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise liefert die Inkubationsmischung 43,2 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X.

Beispiel 8

Ein Medium, das 200 ml Kartoffelextraktlösung, 5 g Glukose, 15 g Glyzerin, 30 g Hefeextrakt, 5 g Fleischextrakt, 2 ml Äthanol sowie 20 g CaCO- in einem Gesamtvolumen von 1 1 enthält und einen pH-Wert von 7,O aufweist, wird hergestellt. Das Medium wird in einen Roux-Kolben in einer Tiefe von 5 mm eingefüllt, bei 120°C während einer Zeitspanne von 15 Minuten sterilisiert und mit einer Kultur von Acetobacter rancens NRRL B65 (ATCC 7839) beimpft. Das Züchten wird bei 30°C während einer Zeitspanne von 72 Stunden durchgeführt. Die Zellen werden anschliessend gesammelt. Verwendet man die Zellen in der gleichen Weise wie in Beispiel 1, dann erhält man 27 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X.

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Beispiel 9

Ein Medium, das 200 ml Kartoffelextraktlösung, 20 g Glukose, 1 g Hefeextrakt und 20 g Agar in einem Gesamtvolumen von 1 1 enthält und einen pH-Wert zwischen 6,5 und 7,0 aufweist, wird hergestellt. Das Medium wird in einen Roux-Kolben in einer Tiefe von 5 mm eingefüllt, bei 12O°C während einer Zeitspanne von 15 Minuten sterilisiert und mit Xanthomonas campestris NRRL B1459 (ATCC 13951) beimpft. Der Kolbeninhalt wird bei 30 C während einer Zeitspanne von 72 Stunden inkubiert. Die Zellen werden von der Agarkultur geerntet. Unter Einsatz der Zellen nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise erhält man 37 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X.

Beispiel 10

Ein Medium mit der in Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung, das 2 Gewichts-% Agar enthält, wird hergestellt und in eine Roux-Flasche in einer Tiefe von 5 mm eingefüllt. Das Medium wird bei 120⁰C während einer Zeitspanne von 10 Minuten sterilisiert und mit Agrobacterium radiobacter ATCC 4718 beimpft. Nach einer Inkubation bei 30 C während einer Zeitspanne von 72 Stunden werden die Zellen von der Agarkultur abgeerntet. Unter Verwendung der Zellen werden nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise 32,5 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X erhalten.

Beispiel 11

Unter Verwendung von Aeromonas hydrophila NRRL B9O9 (IAM 1018) nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise ergibt die Hydrolyse 25 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X.

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- 45 Beispiel 12

Unter Einsatz von Protaminobacter ruber NRRL B1O48 (ATCC 8457) liefert die Zersetzung nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise 24,9 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X.

Beispiel 13

Unter Verwendung von Microcyclus flavus ATCC 23276 liefert die Hydrolyse gemäss Beispiel 1 22,5 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X,

Beispiel 14

Unter Einsatz von Citrobacter freundii ATCC 8090 liefert die Hydrolyse gemäss Beispiel 1 28 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X.

Beispiel 15

Ein Medium, das 2 % Glukose, 1 % Pepton, 0,001 % NaCl, 0,05 % KH₃PO₄, 0,05 % K₂HPO₄, 0,02 % MgSO₄.7H₂O, 0,001 % MnSO₄.5H₂O und 0,001 % FeSO₄.7H₂O, jeweils bezogen auf das Gewicht, enthält und einen pH-Wert von 6,8 besitzt, wird hergestellt und bei 120°C während einer Zeitspanne von 10 Minuten sterilisiert. Das sterilisierte Medium wird aseptisch in einen sterilisierten 500 ml-Kolben bis zu dem Kolbenhals eingefüllt und mit einer Impfkultur von Clostridium butyricum ATCC 6014, hergestellt durch Züchten in einem 5 Gewichts-%igen Maismedium, beimpft. Der Kolben wird bei 37°C während einer Zeitspanne von 48 Stunden inkubiert. Nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise unter Einsatz der von der Kultur abgeernteten Zellen liefert die Hydrolyse 32,2 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X.

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Beispiel 16

Ein Medium, das 0,55 % Hefeextrakt, 1,25 % Pepton, 1,1 % Glukose, .1 % CH₃COONa. 3H₂O, 0,01 % MgSO₄.7H₂O, 0,005 % MnSO₄^H₃O, 0,0005 % FeSO₄.7H₂O, 0,025 % KH₃PO₄, 0,025 % K₃HPO₄, 20 % Leberextraktlösung und 0,5 % CaCO-, jeweils bezogen auf das Gewicht, enthält und einen pH-Wert von.7,0 besitzt, wird hergestellt und bei 120°C während einer Zeitspanne von 10 Minuten sterilisiert. Das Medium wird in einen sterilisierten 500 ml-Kolben bis zu dem Kolbenhals eingefüllt und mit Streptococcus faecalis ATCC 8043 beimpft. Der Kolben wird bei 37°C während einer Zeitspanne von 4 8 Stunden inkubiert.

Nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise unter Verwendung der von der Kultur abgeernteten Zellen ergibt die Hydrolyse 17,5 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X.

Beispiel 17

Unter Verwendung von Leuconostoc mesenteroides NRRL B1299 (ATCC 11449) nach der in Beispiel 16 beschriebenen Arbeitsweise liefert der Abbau 15,8 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X.

Beispiel 18

Unter Verwendung von Lactobacillus brevis ATCC 8287 nach der in Beispiel 16 beschriebenen Methode liefert der Abbau 15,9 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X.

Beispiel 19

Unter Einsatz von Propionibacterium shermanii ATCC 13673 nach der in Beispiel. 16 beschriebenen Arbeitsweise liefert die Hydro-

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lyse 14 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X. Beispiel 20

Ein Medium mit der in Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung wird hergestellt und bei 120 C während einer Zeitspanne von 10 Minuten sterilisiert. n-Caproyl-L-valyl-L-valyl-4-amino-3-hydroxy-e-methylheptanoyl-L-alanyl^-amino-S-hydroxy-e-methylheptansäure wird in einer solchen Menge aseptisch dem Medium zugegeben, dass eine Konzentration von 5 mg/ml eingestellt wird. Das Medium, das n-Caproyl-Val-Val-X-Ala-X enthält, wird mit Bacillus megaterium NRRL B938 (ATCC 13639) beimpft. Das Züchten wird nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise während einer Zeitspanne von 48 Stunden durchgeführt. Die Kulturbrühe wird mit der 5-fachen Wassermenge verdünnt und nach der Einstellung des pH-Wertes auf 2,0 filtriert.

Kristallines Val-X-Ala-X wird in einer Menge von 70,1 mg aus 50 ml des Filtrats nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode erhalten.

Beispiel 21

Ein Medium, das 0,5 % Glukose, 0,5 % Stärke, 0,5 % .Sojabohnenmehl, 0,1 % KH₂PO₄ und 0,05 % MgSO..7H₂O, jeweils bezogen auf das Gewicht, enthält, wird hergestellt. Das Medium (50 mg in einem 500 ml-Kolben) wird bei 120 C während einer Zeitspanne von 10 Minuten sterilisiert und mit Kabatiella caulivora ATCC 20439 beimpft. Der Kolben wird auf einem Rotationsschüttler (220 üpm) bei 28°C während einer Zeitspanne von 72 Stunden inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugieren bei 3 000 Upm abgeerntet und in einem O,01m-Phosphatpuffer (OD₆₁₀ =55) suspendiert. Unter

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Einsatz der Zellen wird nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise verfahren. Die Hydrolyse liefert 43 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X.

Beispiel 22

Fusarium sp. ATCC 20440 wird in ähnlicher Weise wie in Beispiel 21 gezüchtet, wobei ein Brühenfiltrat hergestellt wird. Zu 200 ml des Filtrats werden 100 mg einer feinpulverisierten n-Caproyl-L-valyl-L-valyl-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptanoyl-L-alanyl-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure gegeben. Die Reaktionsmischung wird bei 37 C unter leichtem Rühren während einer Zeitspanne von 24 Stunden inkubiert. Nach der in Beispiel beschriebenenArbeitsweise werden 44 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X erhalten.

Beispiel 23

Stemphylium sarcinaeforme ATCC 20442 wird während einer Zeitspanne von 48 Stunden nach der in Beispiel 22 beschriebenen Methode wachsen gelassen. Die Kultur wird aseptisch einer Pepstatingärbrühe zugesetzt, die während einer Zeitspanne von 96 Stunden gezüchtet worden ist (vgl. die in Beispiel 3 beschriebene Arbeitsweise). Die Zugabe erfolgt in einem volumetrisehen Verhältnis von 1:5. Die Gärung wird während einer weiteren Zeitspanne von 35 Stunden bei 28 C fortgesetzt. Von 1 1 des Brühenfiltrats des Gärungsverfahrens werden 36 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X nach einer Methode gewonnen, die der in Beispiel 21 beschriebenen ähnlich ist.

Beispiel 24

Rhizoctonia sp. ATCC 20443 wird während einer Zeitspanne von

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Stunden nach der in Beispiel 21 beschriebenen Methode gezüchtet. Es wird das gleiche Ausgangsmaterial wie in Beispiel aseptisch der Kultur zur Einstellung einer Endkonzentration von 2 mg/ml zugesetzt. Das Züchten wird wä/irend einer Zeitspanne von weiteren 48 Stunden fortgesetzt. Nach einer Methode, die der in Beispiel 1 beschriebenen ähnlich ist, werden 30,5 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X aus 50 ml des Kulturfiltrats gewonnen.

Beispiel 25

Eine Zellsuspension von Colletotrichum sp. ATCC 20438, hergestellt nach der in Beispiel 21 beschriebenen Arbeitsweise, wird gefriergetrocknet. Eine Reaktionsmischung, die 1,1g der gefriergetrockneten Zellen sowie 50 ml der gleichen Lösung des Ausgangsmaterials wie in Beispiel 1 in einem Gesamtvolumen von 100 ml enthält und einen pH-Wert von 7 aufweist, wird bei 37°C während einer Zeitspanne von 24 Stunden inkubiert. Unter Einhaltung einer Arbeitsweise, die der in Beispiel 1 beschriebenen ähnlich ist, werden 43 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X erhalten.

Beispiel 26

Eine Zellsuspension von Ascochy ta Phaseolorum ATCC 14728, hergestellt nach der in Beispiel 21 beschriebenen Arbeitsweise, wird mit einer French-Presse behandelt. Ein zellfreier Extrakt wird durch Zentrifugieren mit 10 000 Upm während einer Zeitspanne von 20 Minuten erhalten. Nach der in Beispiel 16 beschriebenen Arbeitsweise unter Verwendung des zellfreien Extrakts liefert der Abbau 50,8 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X.

Beispiel 27

Ein Medium, das aus 1 Teil Weizenkleie und 1 Teil einer 0,2 gew. -%igen Hefeextraktlösung besteht, wird hergestellt "und bei 12O°C während einer Zeitspanne von 10 Minuten sterilisiert. Das Medium wird mit Kabatiella caulivora ATCC 20439 beimpft und bei 28°C während einer Zeitspanne von 120 Stunden inkubiert. Das Enzym wird mit dem 5-fachen Volumen eines O,01m-Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7 extrahiert. Das gleiche Substrat, das gemäss Beispiel 1 verwendet worden ist, wird unter leichtem Rühren bei 37°C während einer Zeitspanne von 20 Stunden inkubiert. Unter Einhaltung einer Arbeitsweise, die der in Beispiel 1 beschriebenen ähnlich ist, werden 45 mg eines kristallinen VaI-X-AIa-X aus der Inkubationsmischung gewonnen.

Beispiel 28

Ein Medium, das 0,5 % Glukose, 0,7 % Fleischextrakt, 1 % Pepton und 0,3 % NaCl, jeweils bezogen auf das Gewicht, enthält und einen pH-Wert von 7 besitzt, wird hergestellt. Das Medium (1o 1) wird in ein 20 1-Gärgefäss eingefüllt und bei 120°C während einer Zeitspanne von 10 Minuten sterilisiert. Zur Herstellung einer Impfkultur werden 50 ml des gleichen Mediums in einen 500 ml-Kolben eingefüllt und mit Bacillus circulars ATCC 13403 beimpft. Der Kolben wird auf einem sich hin- und herbewegenden Schüttler (120 üpra) bei 30°C während einer Zeitspanne von 24 Stunden inkubiert. Dem Gärungsgefäss werden 100 ml der Impfkultur zugesetzt, worauf das Züchten durch Rühren mit 300 üpm sowie unter Belüftung (5 l/Minute) bei 30⁰C während einer Zeitspanne von 48 Stunden durchgeführt wird. Toluol wird der Kulturbrühe bei einem pH-Wert von 7,0 zur Einstellung einer Endkonzentration von 2 Volumen-% zugesetzt. Die Mischung wird unter leichtem Rühren bei 30°C während einer Zeitspanne von weiteren

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2 Stunden inkubiert und anschliessend filtriert. Die Enzymaktivität des klaren Filtrats (8,7 1) beträgt 0,8 Einheiten/ml. Dem Filtrat werden 5,3 kg (NH₄J₂SO₄ unter Kühlen und Rühren zur. Gewinnung eines Niederschlags zugesetzt. Eine Hälfte des Niederschlags wird gefriergetrocknet. Die Aktivität des gefriergetrockneten Pulvers (5,45 g) beträgt 520 Einheiten/g. Die andere Hälfte des Niederschlags wird in 1 1 Wasser aufgelöst und gegenüber Ammoniumsulfat dialysiert und anschliessend gefriergetrocknet. Eine rohe Enzymzubereitung wird in einer Menge von 3,78 g mit einer Aktivität von 625 Einheiten/g erhalten. Die Ausbeuten betragen 81,4 % bzw. 67,8 %.

Beispiel 29

Reaktionsmischung, die 100 mg Isovaleryl-L-valyl-L-valyl-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptanoyl-L-alanyl-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptansaure, 250 Einheiten eines gereinigten Enzyms, hergestellt nach der in Beispiel 17 beschriebenen Arbeitsweise, sowie einen O,05m-Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,2 in einem Gesamtvolumen von 100 ml enthält, wird bei 37°C während einer Zeitspanne von 20 Stunden inkubiert. Unter Einhaltung einer Arbeitsweise, die der in Beispiel 1 beschriebenen ähnlich ist, erhält man 61,8 mg eines kristallinen Val-X-Ala-X.

Beispiel 30

Zu 51 mg Val-X-Ala-X, gelöst in 15 ml H₃O bei einem pH-Wert von 8,5, wird 1 ml Acetylchlorid tropfenweise unter Rühren bei Zimmertemperatur zugesetzt, wobei der pH-Wert der Reaktionsmischung auf 8,5 unter Einsatz von In-NaOH sowie unter Verwendung eines den pH-Wert steuernden Geräts (COMBI-TITRATOR 30, METROMM HERISAU, Schweiz) gehalten wird. Nachdem die Reaktion beendet ist, wird der

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pH-Wert auf 1,8 unter Verwendung von 6n-HCl eingestellt. Die erhaltene Lösung wird mit 4 χ 5 ml n-Butanol extrahiert. Die Butanolschicht wird mit 3 ml Wasser dreimal gewaschen und dann eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in 0,5 ml Methanol aufgelöst, worauf 30 ml H₃O zugesetzt werden.

Die Lösung wird durch eine mit Dowex (50 χ 8) gefüllte Säule (50 bis 100 mesh, H , 10 ml) geschickt. Die Säule wird dann mit 20 ml H₃O gewaschen. Der Ablauf und das Waschwasser werden gesammelt, vereinigt und eingedampft. Nach dem Trocknen erhält man 45 mg eines weissen Pulvers, bei dem es sich um N-Acetyl-Val-X-AIa-X handelt. Die Ausbeute beträgt 81 %.

Analyse: Berechnet für ^C26^H48^N4°8^{: C 57}'³³' ^{H 8}*⁸⁸' ^N 10,29, 0 23,50 Gefunden: C 57,29, H 8,91, N 10,05, 0 23,83

Beispiel 31

Unter Einhaltung einer Arbeitsweise, die der in Beispiel 30 beschriebenen ähnlich ist, wobei Isobutyrylchlorid verwendet wird, liefert die Acylierung von 50 mg VaI-X-AIa-X 32 mg eines weissen Pulvers aus N-Isobutyryl-Val-X-Ala-X in einer 50 %igen Ausbeute.

Analyses Berechnet für ^C28^H52^N4°8^{: C 58}'⁷²' ^{H 9}'¹⁵' ^{N 9}/⁷⁸/ ° 22,35 Gefunden: C 58,95, H 9,16, N 9,56, 0 22,12

Beispiel 32

Unter Einhaltung einer Arbeitsweise, die der in Beispiel 30 beschriebenen ähnlich ist, wobei Isovalerylchlorid eingesetzt wird, liefert die Acylierung von 50 mg Val-X-Ala-X 28 mg eines weissen Pulvers, bei dem es sich um N-Isovaleryl-Val-X-Ala- handelt, das in einer 48 %igen Ausbeute erhalten wird.

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Beispiel 33

Zu 100 mg Val-X-Ala-X, gelöst in 5 ml Methanol, werden 54,2 mg Benzoesäureanhydrid tropfenweise unter Rühren und Kühlen in einem Eisbad zugesetzt. Die Lösung wird über Nacht bei 5 bis 7°C gerührt, worauf 5 ml H-O zugesetzt werden. Nach einem Eindampfen zur Entfernung des Methanols wird die erhaltene Lösung mit Äther extrahiert. Dabei erhält man einen weissen Niederschlag zwischen der Äther- und der Wasserschicht. Der Niederschlag wird gesammelt und getrocknet. Der Rückstand wird mit Äther gewaschen und in einem kleinen Volumen Methanol aufgelöst. Dann wird die Lösung auf eine mit Sephadex LH-20 in Methanol gepackte Säule (0 = 1,5 χ 80 cm) aufgegeben. Der Ablauf wird gesammelt und eingedampft. Dabei erhält man 32 mg N-Benzyl-Val-X-Ala-X in Form eines weissen Pulvers in einer Ausbeute von 32 %.

Beispiel 34

Zu 50 mg Val-X-Ala-X, suspendiert in 3 ml Dioxan, werden 42,9 mg Phenoxyessigsäureanhydrid, gelöst in 3 ml Dioxan, tropfenweise unter Rühren bei Zimmertemperatur zugesetzt. Die Lösung wird über Nacht gerührt, worauf 10 ml H₃O zugesetzt werden. Dioxan wird durch Eindampfen entfernt. Die erhaltene Lösung wird mit Benzol zweimal gewaschen und mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird eingedampft, worauf der Rückstand in einem kleinen Volumen Methanol aufgelöst wird. Eine Gelfiltration mit einer Sephadex LH-20-Säule liefert 22 mg eines weissen Pulvers, bei dem es sich um N-Phenoxyacetyl-Val-X-Ala-X handelt (Ausbeute 44 %>.

Beispiel 35

Zu 50 mg Val-X-Ala-X, gelöst in 4 ml H₃O (pH-Wert 8,5) werden

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20,2 rag 2-Phenoxypropionylchlorid, gelöst in 1 ml Azeton, tropfenweise bei Zimmertemperatur unter Rühren zugesetzt, wobei der pH-Wert auf 8,5 unter Verwendung von In-NaOH sowie unter Einsatz eines den pH-Wert konstant haltenden Gerätes gehalten wird. Die Lösung wird während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur gerührt und eingedampft. Der Rückstand wird mit einem kleinen Volumen Methanol extrahiert. Eine Sephadex LH-2O-Gelfiltration liefert 49 mg N-2-Phenoxypropionyl-Val-X-Ala-X in Form eines weissen Pulvers in 75 %iger Ausbeute.

Beispiel 36

Unter Einhaltung einer Methode, die der Methode gemäss Beispiel ähnlich ist, wobei Oxalylchlorid verwendet wird, liefert die Acylierung von 50 mg Val-X-Ala-X 39 mg N-Oxalyl-Val-X-Ala-X in einer 68 %igen Ausbeute.

Beispiel. 37

Unter Einhaltung einer Methode, die der in Beispiel 35 beschriebenen ähnlich ist, wobei Malonylchlorid verwendet wird, liefert die Acylierung von 50 mg Val-X-Ala-X 25,1 mg N-Malonyl-Val-X-AIa-X in einer 43 %igen Ausbeute.

Beispiel 38

Unter Einhaltung einer Arbeitsweise, die der in Beispiel 35 beschriebenen ähnlich ist, wobei Palmitoylchlorid eingesetzt wird, liefert die Acylierung von 50 mg Val-X-Ala-X 57,5 mg N-Palmitoyl-Val-X-Ala-X in einer 78 %igen Ausbeute.

Beispiel 39

Zu einer Lösung von 50,2 mg Val-X-Ala-X in 2,5 ml H2O werden 50,4 mg NaHCO. bei O⁰C zugesetzt. Dann werden 20,6 mg Monobrom- .

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propionylchlorid, gelöst in 2 ml Chloroform, tropfenweise unter kräftigem Rühren zugegeben. Das Rühren wird während weiteren 60 Minuten nach der Zugabe des Acylierungsmittels fortgesetzt. Eine wässrige Schicht wird gesammelt. 1 ml einer 1n-NaOH-Lösung wird zugesetzt. Die erhaltene Lösung wird bei 100 C während einer Zeitspanne von 2 Stunden am Rückfluss gehalten und dann auf Zimmertemperatur abkühlen gelassen. Die Reaktionsmischung wird mit 3 χ 2 ml n-Butanol nach einem Ansäuern mit HCl extrahiert. Die organische Schicht wird mit 2 χ 2 ml H₀O gewaschen und verdampft. Der Rückstand wird in Methanol aufgelöst. Eine Gelfiltration mit Sephadex LH-2O liefert 27,3 mg N-ß-Hydroxypropionyl-Val-X-Ala-X in Form eines weissen Pulvers in einer Ausbeute von 43 %.

Beispiel 40

Eine Rückflussbehandlung von 100 mg Val-X-Ala-X, gelöst in 10 ml HCl/Methanol, bei 60°C während einer Zeitspanne von 2 Stunden sowie ein Eindampfen der Mischung liafert den Methylester von Val-X-Ala-X. Der Ester (Rückstand) wird in 10 ml Methanol aufgelöst und mit Triäthylamin neutralisiert. Der Lösung wird die 5-fache Molmenge an Essigsäureanhydrid tropfenweise unter Rühren zugesetzt. Die Reaktion wird unter Rühren über Nacht fortgesetzt und durch Dünnschichtchromatographie sowie unter Anwendung der Ninhydrinreaktion überwacht. Die erhaltene Mischung wird eingedampft. Der Rückstand wird in 5 ml H-O aufgelöst und dann mit 3 χ 5ri1 Äthylacetat extrahiert. Die organische Schicht wird eingedampft. Dabei wird der Methylester von N-Acetyl-Val-X-Ala-X erhalten. Das Material wird in 3 ml Methanol aufgelöst, worauf 3 ml einer 1n-NaOH-Lösung zugesetzt werden. Die Verseifung des Esters erfolgt durch Rückflussbehandlung der Mischung bei 60°C während einer Zeitspanne von 3 Stunden. Die erhaltene Lösung wird mit HCl neutralisiert. Eine Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex LH-20 ergibt 70,4 mg N-Acetyl-Val-X-Ala-X in Form eines

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- 56 weissen Pulvers in einer 65 %igen Ausbeute.

Das erfindungsgemässe Peptid Val-X-Ala-X sowie seine N-Acylderivate besitzen eine geringe Toxizität. Mäuse, Hunde, Ratten und Kaninchen tolerieren eine orale Verabreichung von mehr als 2000 mg/kg der Verbindungen. Die LD₅₀ der Verbindungen gegenüber Tieren gehen aus der Tabelle VIII hervor (intraperitoneale Injektionen). Eine tägliche orale Verabreichung von 250 mg/kg einer jeden der Verbindungen an Ratten während einer Zeitspanne von 90 Tagen hat keine Toxizität zur Folge. Die Ratten wachsen mit der normalen Wachstumsgeschwindigkeit.

Vor der Auffindung von Pepstatin gemäss den US-PS 3 740 319 und 3 840 516 sowie der analogen Verbindungen gemäss vorliegender Erfindung war kein starker Pepsininhibitor bekannt. Wenn auch Polysaccharid-Schwefelsäureester dafür bekannt sind, dass sie Pepsin inhibieren, so ist ihre Wirkung sehr gering, wobei ausserdem die Blutkoagulierung inhibiert wird. Die erfindungsgemässen Verbindungen sind starke Pepsininhibitoren, wie anhand der 50 %igen Inhibierungskonzentration, die weiter oben geschildert worden ist, hervorgeht, wobei die Verbindungen keine Wirkung auf die Blutkoagulierung ausüben. Die starke Pepsininhibierende Wirkung zeigt an, dass diese Verbindungen wirksam zur Bekämpfung von Magengeschwüren sind. Dies wurde durch klinische Untersuchungen, wie sie in den US-PS 3 740 319 und 3 840 516 beschrieben werden, bestätigt.

Magengeschwüre von Ratten, die nach der Methode erzeugt werden, welche von Takagi et al in "Japanese Journal of Pharmacology", 18, 9-18p, 1968 beschrieben wird, wobei männliche Ratten in einen Käfig während einer Zeitspanne von 22 Stunden bei einer Temperatur von 23°C eingesperrt werden, können durch die Ver-

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bindungen therapeutisch behandelt werden, wobei die Ratten auch durch diese Verbindungen geschützt werden. 50 mg/kg Pepstatin sowie die erfindungsgemässen Verbindungen werden oral 30 Minuten vor dem Stress verabreicht. Die Ratten werden 48 Stunden nach dem Stress getötet. Das Heilungsverhältnis der Magengeschwüre beträgt 60 bis 75 %. Beträgt die Dosis 10 mg/kg, dann beträgt der Prozentsatz der Inhibierung der Geschwüre 50 bis 60 %. 50 bis 200 mg/kg der Verbindung werden sofort nach dem Stress sowie einmal täglich während einer Zeitspanne von 4 Tagen verabreicht, worauf die Ratten getötet werden. Die schnelle Heilung von Geschwüren ist im Falle von Ratten festzustellen, die mit Pepstatin sowie den analogen Verbindungen behandelt worden sind.

Eine Wirkung gegenüber Magengeschwüren von Ratten,die durch ein Abschnüren des Magenausgangs erzeugt werden, kann ebenfalls nachgewiesen werden. Das von Watanabe und Kasuya in "Chemical Pharmaceutical Bulletin", 11, 1282, 1963 beschriebene Verfahren wird angewendet. In Ratten, denen 2 bis 10 mg/kg oder grössere Dosen 30 Minuten sowie 14 Stunden nach dem Zuschnüren des Magenausgangs verabreicht worden sind, werden keine Geschwüre festgestellt. Die 50 %ige Inhibierungsdosis beträgt 0,5 bis 3 mg/kg.

Die Pepsinaktivität im Magensaft liegt bei weniger als 10 % derjenigen der Vergleichsprobe oder ist nicht feststellbar. Die erfindungsgemässen Verbindungen üben daher eine ausgeprägt schützende und heilende Wirkung gegenüber Magengeschwüren von Ratten aus.

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Claims (12)

1. Patentansprüche . 1.)Tetrapeptide der Formel

   Val-X-Ala-X,

   worin VaI für L-Valin steht, X ^Amino-S-hydroxy-ö-methylheptansäure oder ein Salz oder einen Ester davon bedeutet und AIa L-Alanin darstellt, sowie N-Acylpeptide dieser Tetrapeptide der Formel

   R¹-Val-X-Ala-X,

   worin R¹ für einen Acylrest oder einen Acylrest steht, der teilweise durch eine oder mehrere Hydroxylgruppen oder Halogenatome oder ein C-Ende einer veresterten Carboxylgruppe substituiert ist.
2. 2. N-Acylpeptide gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R¹ ein Rest ist, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Formyl, Acetyl, Propionyl, Butyryl, Isobutyryl, Valeryl Isovaleryl, Caproyl, Isocaproyl, Heptanoyl, Capryloyl,Capryl, Lauroyl, Myristoyl, Palmitoyl, Stearoyl, Arachidoyl, Oleoyl, Erucyl, Linoleoyl, Linolenoyl, ß-Hydroxypropionyl, Oxalyl, Malonyl, Benzoyl, Cinnamoyl, Phthaloyl, Acryloyl, Phenoxyacetyl und Phenoxypropionyl besteht.
3. 3. Verfahren zur Herstellung von Tetrapeptiden gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein N-Acylpeptid der allgemeinen Formel R-Val-Val-X-Ala-X, worin R für einen Acylrest oder einen Acylrest steht,der teilweise durch eine oder mehrere Hydroxylgruppen oder Halogenatome oder ein C-Ende einer veresterten Carboxylgruppe substituiert ist, und

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   VaI, X und Ala die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen, spezifisch zu einer Carbonsäure L-Valin und Val-X-Ala-X in der Weise zersetzt wird, dass das N-Acylpeptid mit einem Enzym kontaktiert wird, das durch einen Mikroorganismus erzeugt wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Enzym verwendet wird, das sich durch eine Substratspezifität für N-Acylpeptide der allgemeinen Formel R-Val-Val-X-Y auszeichnet, wobei R, VaI und X die in Anspruch 3 angegebenen Bedeutungen besitzen und Y für einen Aminosäurerest, einen Peptidrest oder einen Hydroxyrest steht, und die Fähigkeit besitzt, diese N-Acylpeptide spezifisch in eine Carbonsäure, L-Valin und VaI-X-Y zu zersetzen.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass

   der eingesetzte Mikroorganismus aus Bacillus megaterium NRRL B938 (ATCC 13639), Bac. circulans ATCC 1-3403 Bac. sphaericus ATCC 14577, Bac. cereus ATCC 9634, Bac. subtilis NRRL B543 (ATCC 10783), Clostridium butyricum ATCC 6014, Pseudomonas segnis ATCC 4358, Xanthomonas campestris NRRL B1459 (ATCC 13951), Acetobacter rancens NRRL B65 (ATCC 7839), Aeromonas hydrophila NRRL B9O9, Protaminobacter ruber NRRL B1O48 (ATCC 8457), Microcyclus flavus ATCC 23276, Agrobacterium radiobacter ATCC 4718, Alcaligenes faecalis ATCC 8750, Escherichia coli ATCC 11303, Citrobacter freundii ATCC 8090, Enterobacter aergoenes ATCC 8329, Micrococcus rubens ATCC 186, Staphylococcus epidermidis ATCC 155, Sarcina lutea ATCC 9341, Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871, Streptococcus faecalis ATCC 8043, Leuconostoc mesenteroides NRRL B1299 (ATCC 11449), Lactobacillus brevis ATCC 8287, Propionibacterium shermanii ATCC 13673, Corynebactfcrium equi ATCC 6939, Microbacterium lacticum ATCC 8180, Cellulomonas fimi ATCC 8183, Arthrobacter ureafaciens

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   ATCC 7562, Macrophomina phaseoli ATCC 20441, Ascochyta phaseolorum ATCC 14728, Colletotrichum sp. ATCC 20438, Kabatiella caulivora ATCC 20439, Stemphylium sarcinae forme ATCC 20442, Rhizoctonia sp. ATCC 20443 und Fusarium sp. ATCC 20440 besteht.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass

   R für Acylreste mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen oder die entsprechenden Halogenacylreste steht, in denen Wasserstoff durch wenigstens ein Halogenatom substituiert ist.
7. 7. Verfahren zur Herstellung von N-Acylpeptiden gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein N-Acylpeptid der allgemeinen Formel R-Val-Val-X-Ala-X, worin R für einen Acylrest steht und VaI, AIa und X die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen, spezifisch zu einer Carbonsäure, L-Valin und Val-X-Ala-X in der Weise zersetzt wird, dass das N-Acylpeptid mit einem Enzym kontaktiert wird, das durch einen Mikroorganismus erzeugt wird, worauf das auf diese Weise erhaltene Val-X-Ala-X acyliert wird.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Acylierung unter Verwendung von Acylierungsmitteln durchgeführt wird, die aus Carbonsäurehalogeniden, Carbonsäureanhydriden oder gemischten Anhydriden, Thiocarbonsäureanaloga oder Estern von Halogencarbonsäuren, die Formyl-, Acetyl-, Propionyl-, Butyryl-, Isobutyryl-, Valeryl-, Isovaleryl-, Caproyl-, Isocaproyl, Heptanoyl-, Capryloyl-, Capryl-, Lauroyl-, Myristoyl-, Palmitoyl-, Stearoyl-, Arachidoyl-, Oleoyl-, Erucyl-, Linoleoyl-, Linolenoyl-, ß-Hydroxypropionyl-, Oxalyl-, Malonyl-, Benzoyl-, Cinnamoyl-, Phthaloyl-, Acryloyl-, Phenoxyacetyl- oder Phenoxypropionylgruppen aufweisen, durchgeführt wird.
9. 9. Enzym, gekennzeichnet durch eine Substratspezifität für

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   N-Acylpeptide der allgemeinen Formel R-Val-Val-X-Y, worin R für einen Acylrest oder einen Acylrest steht, der teilweise durch eine oder mehrere Hydroxylgruppen oder Halogenatome oder ein C-Ende einer veresterten Carboxylgruppe substituiert ist, VaI für L-Valin steht, X 4-Amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure oder ein Salz oder einen Ester davon bedeutet, Y einen Aminosäure-, Peptid- oder Hydroxyrest darstellt, sowie die Fähigkeit, derartige N-Acylpeptide spezifisch zu R, VaI und VaI-X-Y zu zersetzen.
10. 10. Verfahren zur Herstellung des Enzyms gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Bacillus megaterium NRRL B938 (ATCC 13639), Bac. circulans ATCC 13403, Bac. sphaericus ATCC 14577, Bac. cereus ATCC 9634, Bac. subtilis NRRL B543 (ATCC 10783), Clostridium butyricum ATCC 6014, Pseudomonas segnis ATCC 4358, Xanthomonas campestris NRRL B1459 (ATCC 13951), Acetobacter rancens NRRL B65 (ATCC 7839), Aeromonas hydrophila NRRL B9O9, Protaminobacter ruber NRRL B1O48 (ATCC 8457), Microcyclus flavus ATCC 23276, Agrobacterium radiobacter ATCC 4718, Alcaligenes faecalis, ATCC 875O, Escherichia coli ATCC113O3, Cictrobacter freundii ATCC 8090, Enterobacter aerogenes ATCC 8329, Micrococcus rubens ATCC 186, Staphylococcus epidermidis ATCC 155, Sarcina lutea ATCC 9341, Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871, Streptococcus faecalis ATCC 8043, Leuconostoc mesenteroides NRRL B1299 (ATCC 11449), Lactobacillus brevis ATCC 8287, Propionibacterium shermanii ATCC 13673, Corynebacterium egui ATCC 6939, Microbacterium lacticum ATCC 8180, Cellulomonas fimi ATCC 8183, Arthrobacter ureafaciens ATCC 7562, Macrophomina phaseoli ATCC 20441, Ascochyta phased) lor um ATCC 14728, Colletotrichum sp. ATCC 20438, Kabatiella caulivora ATCC 20439, Stempfaylium sarcinaeforme ATCC 20442, Rhizoctonia sp. ATCC 2O443 und Fusarium sp. ATCC 20440 besteht, in einem Medium gezüchtet wird, wobei das Enzym gebildet und anschliessend von dem Medium

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    abgetrennt wird.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus dem Genus Bacillus angehört.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass dem Medium ein N-Acylpeptid zugesetzt wird, gegenüber welchem das Enzym die genannte Spezifität sowie die Fähigkeit der Zersetzung aufweist, um die Bildung des Enzyms zu induzieren.

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