DE2506601B2

DE2506601B2 - Tetrapeptide und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2506601B2
Application number: DE19752506601
Authority: DE
Inventors: Takaaki Dr. Fujisawa Aoyagi; Taiji Dr. Chigasaki Inui; Hajime Tokio Morishima; Akira Yokohama Takamatsu; Tomio Dr. Takeuchi; Hiroshi Dr. Fujisawa Kanagawa Tone; Hamao Dr. Umezawa
Original assignee: SANRAKU-OCEAN Co Ltd TOKIO
Current assignee: Mercian Corp
Priority date: 1974-02-28
Filing date: 1975-02-17
Publication date: 1980-04-24
Also published as: DE2506601A1; FR2262532B1; DE2506601C3; FR2262532A1; CA1040123A; GB1493969A

Description

R—Val—Val—X —Ala—X

inhibiert werden, wobei in der Formel die Symbole folgende Bedeutung besitzen; R=eine Acylgruppe, Val = L-Valin, X=4-Amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure und AIa=L-Alanin.

Einige dieser Verbindungen sind, wie berichtet wurde, gegenüber Magengeschwüren infolge ihrer Antipepsinaktivität wirksam. Klinische Untersuchungen, die sich mit dieser Wirkung befassen, sind veröffentlicht worden.

Diese N-Acylpeptide zeichnen sich durch das Vorliegen einer neuen Aminosäure aus, die in der Formel mit X bezeichnet wird. Diese Aminosäure steht, wie man annimmt, in einer engen Beziehung zu ihrer physiologisehen Aktivität Die Länge der Peptidkette sowie der Charakter der Acylgruppe stehen ebenfalls in einer Beziehung zu der Aktivität dieser Peptide.

Es ist die Annahme möglich, daß dann, wenn ein Peptid, das die Gruppe X, jedoch keine Acylgruppe trägt und eine kürzere Peptidkettenlänge aufweist und immer noch die Protease inhibierende Aktivität zeigt hergestellt werden kann, dieses Peptid veränderte Wirkungen aufweisen und in breitem Umfange eingesetzt werden kann, und zwar deshalb, da seine physikochemischen und biologischen Eigenschaften, wie beispielsweise seine Löslichkeit seine Absorption und Verteilung in verschiedenen Organen, verschieden sind.

Die Erfindung betrifft ein neues Tetrapeptid sowie N-Acylderivate davon gemäß Patentanspruch 1 sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen gemäß Patentanspruch 2.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind physiologisch aktiv. Sie besitzen eine Atitisaureproteaseaktivität, wobei im Falle des Teirapepiids diese Aktivität etwas geringer ist als im Falle der N-Acylderivate. Diese Aktivität ist jedoch immer noch höher als diejenige von herkömmlichen Pepsininhibitoren, beispielsweise eines Polysaccharid-Schwefelsäureesters, welcher derzeit als Pepsininhibitor eingesetzt wird. Ferner zeigt das Tetrapeptid seine inhibierende Wirkung gegenüber Pepsin in wesentlich stärkerem Ausmaße als synthetische Inhibitoren, beispielsweise Diazoacetylnorleucinmethylester (DAN), der ein bekannter Pepsininhibitor ist. Um eine 50%ige Inhibierung der Pepsinaktivität bei einer Konzentration von 260 mcg/ml zu erzielen erfordert DAN eine ungefähr 3 Stunden dauernde Vorbebiütung in Abwesenheit eines toxischen Schwermetallions, und zwar Cu ⁺ +, wie aus (»J. Biol. Chem«, 241,4295 (1966) hervorgeht. Das erfindungsgemäße neue Tetrapeptid hat eine sofortige Inhibitorwirkung auf die gleiche saure Protease zur Folge. Bei einer Konzentration von 9,98 mcg/ml ist eine 50%ige Inhibierung ohne Vorbebrütung erzielbar. Die Kontaktzeit zwischen dem Tetrapeptid und dem Enzym beträgt nur 30 Minuten.

Pepstatin inhibiert saure Proteasen bei einer geringeren Konzentration als das erfindungsgemäße Tetrapeptid. Einer der Nachteile von Pepstatin als Arzneimittel oder Reagenz ist jedoch seine schlechte Löslich-

hi keit in Wasser, insbesondere bei neutralem und sauberem pH. Im Falle des erfindungsgemäßen Tetrapeptids ist dieser Nachteil durch Entfernung der hydrophoben Reste, und zwar des Acylrestes sowie von Valin, nicht

mehr gegeben, wobei die Aktivität in etwas reduzierter Form beibehalten wird. Das erfindungsgemäße Tetrapeptid besitzt eine wesentlich höhere Löslichkeit in Wasser als das Ausgangsmaterial. Das Tetrapeptid wandert als Kation bei der Elektrophorese bei einem sauren pH-Wert, während sich Pepstatin nicht bewegt, wie aus der US-PS 38 46 516 hervorgeht Der Rf-Wert des Tetrapeptids bei der Dünnschichtchromatographie unter Einsatz eines Lösungsmittelssystems aus Butanol, Butylacetat, Essigsäure und Wasser ist geringer als der- ι ο jenipe von Pepstatin, was bedeutet, daß die Wasserlöslichkeit des Tetrapeptids höher ist als diejenige von Pepstatin.

Daher ist das neue Tetrapeptid als Arzneimittel oder als Reagens den herkömmlichen Inhibitoren für saure Proteasen deutlich überlegen.

Darfsber hinaus spielt dieses neue Tetrapeptid eine wichtige Rolle als Zwischenverbindung zur Herstellung der erfindungsgemäßen N-Acylderivate.

Die zur chemischen Acylierung das neuen Tetrapeptids in den werter unten folgenden Beispielen beschriebenen Methoden sind herkömmliche Methoden (vgl. »Biochemistry«, 2, 1346 (1963) sowie »Chemical Abstracts«, 56,10267h (1962). Die Reaktion ist sehr einfach, wobei es sich um eine Einstufenreaktion handelt

Die Erfindung wird durch die beigefügten Zeichnungen näher erläutert Es zeigen:

F i g. 1 ein Diagramm, das die Wirkung des pH-Wertes auf die Aktivität des Enzyms wiedergibt, die durch die Zahl η der Mole an erzeugter Isovaleriansäure wiedergegeben wird,

F i g. 2 die Wirkung des pH-Wertes auf das Enzym, die durch den Prozentsatz der Restaktivität wiedergegeben wird, nachdem das Enzym während einer Zeitspanne von 60 Minuten bei verschiedenen pH-Werten gehalten J5 worden ist,

F i g. 3 die Wirkung von Wärme auf die Enzymaktivität die durch die Zahl π der Mole an erzeugter Isovaleriansäure wiedergegeben wird,

F i g. 4 die Wärmestabilität des Enzyms, die ebenfalls -ίο durch den Prozentsatz der Restaktivität wiedergegeben wird, nachdem das Enzym bei verschiedenen Temperaturen während einer Zeitspanne von 10 Minuten gehalten worden ist

Fig.5 das UV-Absorptionsspektrum des neuen ·»■> Tetrapeptids, und zwar L-Valyl^-amino-S-hydroxyö-methylheptanoyl-L-alanyl^-amino-S-hydroxy-e-methylheptansäure, in einer Methanollösung.

F i g. 6 das IR-Abscptionsspektrum der vorstehend angegebenen Verbindung, die in Kaliumbromid pelleti- w siert worden ist

Zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 2 wird ein N-Acylpentapeptid der allgemeinen Formel

R-VaI-VaI-X-AIa-X

rj

oder ein Material, das diese Verbindung enthält, als Ausgangsmaterial eingesetzt. R ist eine Acylgruppe oder eine Halogenacylgruppe mit jeweils 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, während VaI₁ X und AIa die im Patentanspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen. w

Als Ausgangsniaterial kann ein einziges derartiges N-Acylpentapeptid oder eine Mischung aus diesen Peptiden verwendet werden. Die Verbindungen können in Form eines Rohmaterials oder in Form von Salzen mit Kationen eingesetzt werden, welche nicht die h^r> enzymatische Reaktion beeinflussen. Wahlweise kann eine Gärbrühe oder ein Rohextrakt dieser Verbindungen verwendet werden, wenn sie durch Gärung erzeugt werden, ferner kann man auf ein Rohextrakt aus einer Reaktionamischung als Ausgangsmaterial zurückgreifen, wenn die Verbindungen chemisch synthetisiert werden.

Die genannten N-Acylpentapeptide werden an einem" Enzym hydrolisiert, das von den im Paptentanspruch 2 angegebenen Mikroorganismen erzeugt worden ist

Eine geeignete Enzymzubereitung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann durch Züchten des Mikroorganismus auf einem geeigneten Medium unter geeigneten Bedingungen erhalten werden. Der Mikroorganismus kann in einer flüssigen Kultur mit oder ohne Belüftung und Rühren oder auf einer festen Kultur gezüchtet werden.

Die Medien, die zum Wachsenlassen der Mikroorganismen gemäß vorliegender Erfindung eingesetzt werden, sind die Nährmedien, die sich als geeignet für das Wachseniassen von Mikroorganismen erwiesen haben. Als Kohiunstoffquelle kann man alle diejenigen Kohlehydrate einsetzen, die normalerweise bei der Gärung verwendet werden, wie Stärke, Dexuin, Rohrzucker, Maltose, Glyzerin oder dergleichen. Der Stickstoff kann von irgendeinem Material geliefert werden, das in üblicher Weise eingesetzt wird, beispielsweise von Pepton, Fleischextrakt, Hefe, Sojabohnenmehl, Maisflüssigkeit Gluten, Harnstoff, Ammoniumsalzen, Nitratsalzen oder dergleichen. Weizen- sowie Reiskleie, Sojabohnen, die mit organischen Lösungsmitteln behandelt worden sind, Nähragar oder dergleichen können als feste Züchtungsmedien eingesetzt werden. Die Medien können Mg⁺+-, Ca⁺⁺-, Fe⁺⁺-, Mg⁺⁺-, Phosphationen, verschiedene Vitamine, Aminosäuren oder dergleichen als anorganische Ionen sowie gegebenenfalls Spurenelemente enthalten.

Das Züchten kann bei Temperaturen sowie pH-Werten durchgeführt werden, wie sie gewöhnlich zum Wachsenlassen von Mikroorganismen eingehalten werden. Der Anfangs-pH-Wert beim Züchten Wird vorzugsweise zwischen 4,5 und 8,5 gehalten, während die Temperatur auf einen Wert zwischen 15 und 40° C eingestellt wird, und zwar je nach dem eingesetzten Mikroorganismus. Zur Induktion des Enzyms kann eine kleine Menge des Ausgangsinaterials dem Medium vor dem Züchten oder nach einem anfänglichen Wachsen des Mikroorganismus zugesetzt werden.

Alle Materialien, die das aktive Enzym enthalten, können als Enzymzubereitung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden, beispielsweise eine Kulturbrühe mit Zellen, ein Brühenfiltrat, ein Extrakt aus einer festen Kultur, Zellen, Zellen, die mit orjganischen Lösungsmitteln behandelt worden sind, gefriergetrocknete Zellen, getrocknete Zellen odei Extrakte aus Zellen sowie konzentrierte Zubereitungen oder teilweise oder hochgereinigte Zubereitungen, die aus den vorstehend erwähnten Substanzen durch Aussalzen, Ausfällen mit organischen Lösungsmitteln, Gelfiltration oder Chromatographie erhalten werden. Unlösliches Enzym oder immobilisierte Zellen, die nach in neuerer Zeit entwickelten Methoden hergestellt werden, können ebenfalls verwendet werden.

Die partielle Hydrolyse kann in der Weise durchgeführt werden, daß das Enzym in Kontakt mil dem Ausgangsmaterial gebracht wird. Während der Reaktion wird die Tempera'ur vorzugsweise zwischen !5 und 75°C und der pH-Wert zwischen 5 und 9 gehalten. Die bevorzugte Konzentration des Ausgangsmaterials schwankt zwischen 0,01 und 5 Gewichts-%. Die Reaktion sollte während einer Zeitspanne von 30 Minuten

bis 48 Stunden durchgeführt werden. Die Bedingungen hängen von der Form der Enzymzubereitung, dem Ausgangsmaterial, dem Mikroorganismus oder dergleichen ab.

Der folgende Versuch zeigt die Wirkung des pH-Wertes auf die Abbaureaktion bei Einsatz einer Zellsuspension von Bac. circulans ATCC 13403 sowie Bac. megaterium ATCC 13639.

Versuch 1

Ein Medium, das 1% Pepton, 0,7% Fleischextrakt. 0,5% Glukose und 0,3% NaCI, und zwar jeweils auf das Gewicht bezogen, enthält und einen pH-Wert von 7 besitzt, wird hergestellt, worauf 50 ml des Mediums in einen 500-ml-Kolben gegossen und bei 120°C während einer Zeitspanne von 10 Minuten sterilisiert werden. Das Medium wird mit Bac. circulans ATCC 13403 beimpft. Nach einer Inkubation bei 3O⁰C während einer Zeitspanne von 48 Stunden auf einem sich hin- und herbewegenden Schüttler (120UpM) werden die Zellen durch Zentrifugieren mit 10 000 UpM während einer Zeitspanne von 10 Minuten geerntet. Die Zellen, die auf dijse Weise erhalten worden sind, werden mit einer

Tabelle I

Wirkung des pH-Wertes auf die Aktivität

kalten, 0,9 Gewichts°/oigen NaCI-Lösung gewaschen und in destilliertem Wasser (ODf,wm_V-34)suspendiert.
Eine Mischung aus 1 ml von 2 mg/ml Isovaleryl-L-va-IyI-L-valyl-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptanoyl-L-alanyl-4-amino 3-hydroxy-6-methylheptansäure, 0,5 ml einer 0,4 m-Pufferlösung mit dem in Tabelle I angegebenen pH-Wert und 0,5 ml der Zellsuspension wird bei 37°C während einer Zeitspanne von 1 Stunde inkubiert. Der pH-Wert der Reaktionsmischung wird auf 2,0 unter Einsatz von HCI eingestellt. Die überstehende Flüssigkeit wird auf eine kleine Säule (0 =0,7 χ 7 cm), die mit einem Kationenaustauscherharz (Dowex 50) gefüllt ist, aufgebracht. Die Säule wird mit destilliertem Wasser zur Entfernung von nicht-umgesetztem Ausgangsmaterial gewaschen. Das Reaktionsprodukt wird mit 0,5 Π-ΝΗ4ΟΗ quantitativ eluiert. Die Pepsin-Inhibitoraktivität des Eluats wird anhand der nachfolgend geschilderten Methode untersucht. Die Wirkung des pH-Wertes auf diesen Abbau bei Verwendung einer Zellsuspension von Bac. megaterium ATCC 13639 wird in der gleichen Weise wie zuvor ebenfalls untersucht.
In der Tabelle I sind die Ergebnisse zusammengefaßt.

pH	Aktivität	Bac.	Corynebacte-	Pseudomo-	Colletotrichum	Macro-
	Bac. circulans	megaterium	rium equi	nas seg'nis	sp.	phomina phaseoli ATCC 20 441
		ATCC 13 639	ATCC 6939	ATCC 4358	ATCC 20 43U	>200
	ATCC 13 403	>200	>200	>200	>200	200
4	>200	180	200	180	200	100
4,5	200	125	100	150	200	80
5	80	80	80	100	100	65
53	65	65	80	80	85	65
6	65	65	80	80	80	65
6,5	65	65	80	80	80	65
7	65	65	80	80	80	80
73	65	65	100	80	80	80
8	65	65	125	80	100	100
8,5	80	80	150	100	200	200
9	100	125	200	150	>200	>200
93	125	>200	>200	>200	>200
10	>200

Bemerkung 1:

Die Aktivität in dieser Tabelle sowie nachfolgend wird als das Volumen des Eiuats aus der Ionenaustauscherharze ule als Anzahl der μΐ angegeben, die erforderlich ist, um die ID» der Pepsin-Inhibitoraktivität zu erzielen.

Bemerkung 2:

Diese Tabelle betrifft auch die Verwendung von anderen Genera von Bakterien als Bacillus, insbesondere Corynebacterium equi ATCC 6939 und Pseudomonas segnis ATCC 4358 (vgL den weiter unten folgenden Versuch 6) sowie die Verwendung eines Fungus Imperfectus, insbesondere Colletotrichum sp. ATCC 20 438 sowie Macrophomia phaseoli ATCC 20441 (vgL den weiter unten folgenden Versuch 12).

Die Konzentration des Reaktionsproduktes in dem Eluat steht in einem umgekehrten Verhältnis zu dem Volumen des Eluats, das für die ID50 der Pepsin-Inhibitoraktivität erforderlich ist Bei der Durchführung dieses Abbaus zeigt Bac. circulans ATCC 13403 eine hohe Aktivität zwischen einem pH von 5,0 und 83 und Bac. megaterium ATCC 13639 bei einem pH zwischen 53 und 9,0.

Die Untersuchung der Pepsin-Inhibitoraktivität wird erfindungsgemäß nach folgender Methode durchgeführt: Eine Mischung aus 1 ml eines 0,6 gewichts%igen hochgereinigten Kaseins, gelöst in 0,08 m einer Lactatpufferlösung mit einem pH-Wert von ZX 0,7 ml einer 0,02 m-KCl-HCl-Pufferlösung mit einem pH von 2,0 und 0,2 ml einer Lösung, welche die Probeverbindung enthält, wird bei 37° C während einer Zeitspanne von 3 Minuten inkubiert Dieser Mischung werden 4 meg Pepsin (SIGMA, 2XCRY), gelöst in 0,1 ml einer 0,2 m-KCI-HCl-Pufferlösung, zugesetzt Die Mischung wird bei 37"C während einer Zeitspanne von 30 Minuten inkubiert Die Reaktion wird durch die Zugabe von 2,0 ml einer 1,7 m Perchlorsäure abgestoppt Nach einem Stehenlassen während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur wird die optische Dichte (a) der

überstehenden Flüssigkeit bei 280 πιμ abgelesen. Gemäß der Gleichung:

TbT

x 100

wire' /ie inhibierende Wirkung ermittelt. Dabei bedeutet (b) die optische Dichte bei 280 π\μ des Reagenzglases ohne die Probelösung.

Die IDsn wird als die Menge definiert, die zur Erzielung einer 5O°/oigen Inhibierung erforderlich ist.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Abbauverfahrens, insbesondere unter Einsatz einer teilweise gereinigten Enzymzubereitung, kann die Reaktionsmischung erforderlichenfalls Mg⁴ \ Mn* \ Ca⁺ *, Zn^{+ 4}, Co ' ' oder Fe ' ' enthalten.

Der Abbau erfolgt gewöhnlich in wäßriger Lösung,

verwenden. In diesem Falle sollten ein geeignetes Lösungsmittel sowie die Konzentration dahingehend ausgewählt werden, daß nicht die Enzymaktivität inhibiert wird.

Wie vorstehend erwähnt, ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht auf die Art der mit R in der Formel be-") zeichneten Acylgruppe beschränkt, was aus folgenden experimentellen Ergebnissen hervorgeht.

Versuch 2

Verschiedene Ausgangsmaterialien, die in der Tabcl i" le Il zusammengefaßt sind, werden bei einem pH-Wert von 7,0 mit einer Zellsuspension von Bac. sphaericus ATCC 14577, hergestellt nach der in Versuch 1 beschriebenen Methode, umgesetzt (die Tabelle II zeigt ferner die Verwendung eines Bakterienstammes eines ii anderen Genus als Bacillus, und zwar Micrococcus rubens ATCC 186, vgl. den weiter unten folgenden Versuch 7, sowie den Einsatz eines Fungus Imperfectus, und

Z'viäT v^öiiciüiriCnünn 5p. γλ ι \_.v_- ävtjo. Vgl. uCil SVCitCT

unten folgenden Versuch 13).

Tabelle Il

Wirkung des Acylrestes auf die Aktivität

R in R-VaI-VaI-X-AIa-X Mikroorganismus

CH₁-CO-

CII₃-CH₂-CO

CH₁-(CHj)₂-CO

CIi-CO-

CH₃-(CHj)J-CO-CH₁

CH-CH₂-CO-

CHj
CHj-(CHj)₄-CO-

CH-(CH₁J₂-CO-CH₃

CH₃- CH₂- CH- (CHj)₂- CO-CH₃

Aktivität	60 Min.	Micrococcus	rubens	Colletotrichum	sp.
	65	ATCC 186		ATCC 20438
Bacillus sphaericui	65
ATCC 14577	65	0 Min.	60 Min.	0 Min.	60 i\
Zeit		>200	80	>200	70
0 Min.	>200	80	>200	70
>200	>200	80	>200	70
>200
>200

>200 65 >200 80 >200 70

>200 65 >200 80 >200 65

>200 63 >200 80 >200 65

>200 70 >200 85 >200 70

>200 65 >200 80 >200 70

>200 70 >200 80 >200 65

!0

Fortsetzung

R in R VaI VaI-X-AIa- X
Mikroorganismus

CHj-(CIIA-CO-CI-CII₂-CO-

CH-CH₂-CO-

CH, (Methylester)

Aktivität	Micmcot'-'us	nihcns	Collclotrichum
Bacillus sphaericus	ATCC 186		ATCC 204.18
ATCC 14577
/eil	0 Min.	60 Min.	0 Min.
O Min. 60 Min.

>200 65 >200 80 >200 50

>2()0 65 >200 85 >200 70

>200

70 >200

85 >200

70

Wie aus der Tabelle Il hervorgeht, ist die abbauende Wirkung auf Verbindungen mit verschiedenen Acylgruppen oder Estern davon praktisch immer die gleiche.

Einige Vorversuche ergeben die geeignete einzuhaltende Konzentration des Ausgangsmaterials, wobei die Abbaugeschwindigkeit sowie wirtschaftliche Überlegungen berücksichtigt werden. Einige Verbindungen, die unter die allgemeine Formel

R-VaI-VaI-X-AIa-X

fallen und als Ausgangsmaterialien zur Durchführung der Erfindung eingesetzt werden, können eine schlechte Löslichkeit in Wasser besitzen, diese Verbindungen können jedoch in Form von Salzen oder Suspensionen mit entsprechender Konzentration eingesetzt werden. Ist die Konzentration des eingesetzten Ausgangsmaterials höher als seine Löslichkeit, dann kann ein zufriedenstellendes Ergebnis bei der Durchführung des Abbauverfahrens durch gewisse Modifizierungen erzielt werden, beispielsweise durch eine längere Reaktionszeit, durch langsames Rühren oder durch die Verwendung von weiterer Enzymzubereitung.

Versuch 3

Mischungen aus dem gleichen Ausgangsmaterial, das zur Durchführung des Versuchs I eingesetzt wurde, wobei die in der Tabelle III angegebenen Gewichtskonzentrationen eingehalten werden, und der Zellsuspension von Bac. sphaericus ATCC 14577, erhalten gemäß Versuch 2, werden bei 37°C während der in der Tabelle III angegebenen Zeitspannen inkubiert. Die Inhalte der Reagenzgläser 5, 6 und 7 werden während der Inkubation gerührt. Die Reagenzgläser 6 und 7 werden mit weiteren 0,5 ml der Zellsuspension nach 24stündiger Inkubation versetzt (die Tabelle III zeigt ferner die Verwendung eines Bakterienstammes eines anderen Genus als Bacillus, und zwar Escherichia coli ATCC 11303, vgl. den weiter unten folgenden Versuch 8, sowie den Einsatz eines Fungus Imperfectus, und zwar Kabatiella caulivora ATCC 20439, vgl. den weiter unten folgenden Versuch 14).

Tabelle III

Wirkung der Konzentration des Ausgangsmaterials auf die Aktivität

Konzentration des	Reaktionszeit	Aktivität	Escherichia coli	Kabatiella
Ausgangsmaterials			ATCC 11 303	ATCC 20 439
		Bac. sphaericus	2,35	7,5
%	Std.	ATCC 14 577	2,5	8.0
(1) 0,005	1	2,2	2,5	8,0
(2) 0,01	5	2,35	2,85	8.0
(3) 0,05	24	2,35	3,0	8,5
(4) 0,1	24	2,35	3,0	8,5
(5) 0,5	24	2,85	3,0	8,5
(6) 1,0	48	2,85
(7) 2,0	48	2,85

Wie vorstehend gezeigt wird, verläuft die Abbaureaktion bei jeder beliebigen Konzentration des Ausgangsmaterials durch Auswahl einer geeigneten Reaktionsperiode sowie eines bestimmten Volumens der Zellsuspension, wobei jedoch 0,01 bis 5 Gewichts-% bevorzugte Konzentrationen im Hinblick auf einen wirksamen Verbrauch des Ausgangsmaterials sowie im Hinblick auf wirtschaftliche Erwägungen sind. Geringere Konzentrationen können eingehalten werden, wenn spezielle Methoden angewendet werden, beispielsweise bei Verwendung eines unlöslichen Enzyms odsr beim E'nsatz von immobilisierten Zellen.

Die Temperatur zur Durchführung des Abbauverfahrens läßt sich leicht durch einige Vorversuche ermitteln und hängt von der Form der Enzymzubereitung, der Art des Ausgangsmaterials sowie von einer wirt-

schaftlichen Durchführung des Verfahrens ab. Der folgende Versuch zeigt die Wirkung der Temperatur auf die Abbauaktivität von Bac. cereus ATCC 963<·.

Versuch 4

Fine Zellsuspension von Bac. cereus ATCC 9634, hergestellt nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise, sowie das Ausgangsmaterial, das zur Durchführung des Versuchs I verwendet worden ist, werden bei einem pH-Wert von 7,0 nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise bei verschiedenen Temperaturen, die in der Tabelle IV angegeben sind, inkubiert. Die Abbauaktivität wird untersucht (die Tabelle IV zeigt auch die Verwendung eines Bakterienstammes eines anderen Genus als Bacillus, und zwar Arthrobacter ureafaciens ATCC 7562, vgl. den weiter unten folgenden Versuch 9, sowie den Einsatz eines Fungus imperfectus, und zwar Äscochyta phaseoiorum ATCC 14728, vgl. den weiter unten folgenden Versuch 15).

Tabelle IV

Wirkung der Temperatur auf die Aktivität

Temperatur,	Aktivität	Arthiobacter	Äscochyta
¹C	Bac.	ureaiaciens	phaseolorun
	cereus	ATCC 7562	ATCC 14728
	ATCC 9634	150	150
20	100	80	70
30	65	65	60
40	50	60	40
50	40	55	30
60	30	65	50
70	50	>200	>200
80	>200

Wie aus der Tabelle IV hervorgeht, zeigt Bac. cereus ATCC 9634 eine hohe Aktivität zwischen 30 und 70"C. Der bevorzugte Temperaturbereich dieses Verfahrens liegt zwischen 15 und 75"C, da keine Aktivität bei einer tieferen Temperatur trotz einer langsameren Reaktionsgeschwindigkeitverlorengeht.

Wie vorstehend angegeben worden ist. wird das Verfahren der partiellen Hydrolyse gemäß vorliegender Erfindung in der Weise durchgeführt, daß das Enzym in Kontakt mit dem Ausgangsmaterial gebracht wird. Dies kann auch in der Weise erfolgen, daß cias Ausgangsmaterial einer wachsenden Kultur des Mikroorganismus zugesetzt wird.

Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Hydrolyse kann das Ausgangsmaterial dem Medium in Form einer wäßrigen Lösung oder Suspension oder in Form eines Pulvers, und zwar je nach seinen Eigenschaften, hauptsächlich in Abhängigkeit von seiner Löslichkeit in Wasser, während des Züchtens des Mikroorganismus, zu Beginn des Züchtens oder nach einem anfänglichen Wachsen des Mikroorganismus zugesetzt werden. Eine Konzentration von 0,01 bis 5 Gewichts-% des Ausgangsmaterials wird vorzugsweise eingesetzt, wobei dieses auf einmal oder in Portionen zugegeben werden kann.

Ein Produkt dieser Abbaureaktion, ein Tetrapeptid. und zwar L-Valyl^-amino^-hydroxy-ö-methylheptanoyl-L-alanyl^-amino-S-hydroxy-e-methvlheptansäure. kann nach einer der Methoden gewonnen werden, die gewöhnlich für die Isolierung und Reinigung von Oligopeptiden eingesetzt werden, beispielsweise durch Adsorption an Aktivkohle oder einem lonenaüi,-tauscherharz, Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, Chromatographie mit Kieselgel oder Aluminiumoxydgel, Gelfiltration oder dergleichen. Der folgende Versuch zeigt das Abbauverfahrc :>. unttr Verwendung von Bac. cereus ATCC 9534 sowie die Gewinnung eines kristallinen Produktes.

Versuch 5

Bac. cereus ATCC 9634 wird in der gleichen Weise wie in Versuch 1 gezüchtet. Gewaschene Zeilen werden in einem 0,01 m-Phosphatpuffer mit einem pH von 7.0 suspendiert und mit einer French-Presse aufgerissen.

Ii Ein zellfreier Extrakt wird durch Zentrifugieren bei 10 000 UpM während einer Zeitspanne von 20 Minuten erhalten. Eine Mischung aus 50 ml von 2 mg/ml n-Ca·

proyi-L-vaiyi-L-vaiyi-(4-amino-3-hydroxy-6-methyiheptanoyl)-L-alanyl-(4-amino-3-hydroxy-6-methyl-hep-

>o tansäure)-3uspension, 50 ml des zeüfreien Extraktes und 1 ml Toluol (um einen Schutz gegenüber einer mikrobiellen Kontamination zu gewährleisten) wird b;i 37⁰C während einer Zeitspanne von 15 Stunden inkubiert. Der Niederschlag, der beim Einstellen des pH-

r> Wertes auf 2 unter Verwendung von HCI ausfällt, wird durch Zentrifugieren entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wird auf eine mit Dowex® 50 (X4. H ^f-Typ) gefüllte Säule (0 = 2 χ 20 cm) aufgebracht. Die Säule wird mit Wasser gewaschen. Aktive Fraktionen, die mit

«ι 0,5 n-NH₄OH eluiert worden sind, werden gesammelt und mit einem gleichen Volumen n-Butanol extrahiert. Die Butanolschicht wird an einer Kieselgelsäule (0 = 2 χ 30 cm) adsorbiert.

Die F.luierung wird unter Einsatz eines Lösungs-

r> mittelsystems aus n-Biitanol/Essigsäure/HiO mit einem Volumenverhältnis von 4:1:1 durchgeführt. Nach der Konzentration wird die aktive Fraktion gesammelt und auf eine mit Sephad:x LH 20 gefüllte Säule (0 = 1 χ 50 cm) aufgebracht.

in Rohe kristalline L-Valyl-4-amino-3-hydrox>fc-me-

thylheptanoyl-L-alanyl-4-amino-3-hydroxy-6-ami"oheptansäure wird aus der aktiven Fraktion d:^r Gelfiltration erhalten. Eine Umkristallisation in Methanoi ergibt 45,2 mg farbloser Kristalle.

r> Der folgende Versuch zeigt die Wirkung des pH-Wertes auf die Abbauaktivität von Zellsuspensionen von Corynebacterium equi ATCC 6939 und Pseudomonas segnis ATCC 4358.

Versuch 6

Unter Einsatz von Corynebacterium equi ATCC 693^C> und Pseudomonas segnis ATCC 4358 wird die Wirkung des pH-Wertes auf die Abbauaktivität nach der in Versuch 1 beschriebenen Arbeitsweise untersucht. Die Er-

■ν. gebnisse gehen aus der obigen Tabelle I hervor.

Wie aus der Tabelle I zu entnehmen ist, ist die Aktivität hoch bei pH-Werten zwischen 5 und 8 sowie zwischen 5.5 und 9,0 im Falle von Corynebacterium equi ATCC 6939 bzw. Pseudomonas segnis ATCC 4 358.

W) Die Abbauaktiviiät ist unabhängig von der Art der Acyigruppe des Ausgangsmaterials.

Versuch 7

Unter Einsatz von Micrococcus ruben«; ATCC 186 to wird die Abb&uaktivitat gegenüber verschiedenen Ausgangsmaterialien in der gleichen Weise wie gemäß Versuch 2 untersucht. Die Ergebnisse gehen aus der obigen Tabelle It hervor.

Wie der Tabelle U zu entnehmen ist. wird praktisch die gleiche Aktivität gegenüber sämtlichen verschiedenen Verbindungen beobachtet

Versuche

Unter Einsatz von Escherichia coli ATCC 11303 werden die Konzentration des Ausgangsmaterials sowie die Reaktionszeit bei der Durchführung des Abbauverfahrens in der gleichen Weise wie in Versuch 6 untersucht Die Ergebnisse gehen aus der vorstehenden Tabelle III hervor.

Die Inhalte der Reagenzgläser 5, 6 und 7 werden langsam während der Inkubation gerührt, während in die Reagenzgläser 6 und 7 weitere 0,5 ml der Zellsuspension nach 24stündiger Inkubation eingefüllt werden. Wie aus der Tabelle III hervorgeht ähneln die Ergebnisse sehr stark denjenigen, die bei der Durchführung des Versuchs 3 ermittelt worden sind.

Versuch 9

20

Unter Einsatz von Arthrobacter ureafaciens ATCC 7562 wird die Wirkung der Temperatur auf di<*- Abbauaktivität in der gleichen Weise wie in Versuch & untersucht Die Ergebnisse gehen aus der obigen Tabelle IV hervor.

Wie der Tabelle IV zu entnehmen ist wird eine hohe Aktivität zwischen 30 und 70⁰C beobachtet. Die erfindungsgemäß bevorzugt eingehaltene Temperatur liegt zwischen 15 und 75° C, wie bereits erwähnt worden ist, da keine Enzymaktivität bei tieferen Tempera- jo türen trotz der geringen Reaktionsgeschwindigkeit verlorengeht.

Versuch 10

Isovaleryl-L-valyI-L-valyl-(4-amino-3-hydroxy-6-methyIheptanoyi)-L-alanyl-(4-amino-3-hydroxY-6-methylheptansäure) wird unter Verwendung einer Zellsuspension von Sarcina lutea ATCC 9341 abgebaut. Das Abbauprodukt wird in der gleichen Weise wie in Versuch 5 gewonnen. Farblose Kristalle (34 mg) werden erhalten.

Versuch 11

40

Es wird ähnlich wie gemäß Versuch 10 verfahren, wobei n-Caproyl-L-valyl-L-valyl^-amino-S-hydroxye-methylheptanoyl-L-alanyl^-amino-S-hydroxy-ö-me- thylheptansäure sowie Cellulomonas fimi ATCC 8183 verwendet werden. Man erhält 38 mg des Abbauproduktes in Form von farblosen Kristallen.

Der folgende Versuch mit Colletorichum sp. ATCC 20438 und Macrophomina phaseoli ATCC 20441 ist ein Beispiel für die Wirkung des pH-Wertes auf die Hydrolyse.

Versucht

Ein Medium, das 0.5% Stärke, 0,5% Glukose, 0,5% Sojabohnenmehl, 0,1% KH₂PO₄ und 0,05% MgSO₄ ■ 7 H₂O, jeweils bezogen auf das Gewicht, enthält, wird hergestellt, worauf 50 ml des Mediums in einen 500-rnl-Kolben gegossen und bei 12O⁰C während einer Zeitspanne von 20 Minuten sterilisiert werden, w Das Medium wird mit Colletotrichum sp. ATCC 20438 beimpft.

Nach einer Inkubation bei 28°C während einer Zeitspanne von 72 Stunden auf einem Rotationsschüttler (200 UpM) werden die Zellen durch Zentrifugieren bei (,-, 3000 UpM während einer Zeitspanne von 10 Minuten gewonnen. lsovaIeryl-L-valyl-L-valyl-(4-amino-3-hy droxy-6-methylheptanoyl)-L-alanyl-(4-amino-3-hy- droxy-6-methylheptansäure) und die Zellen werden be verschiedenen pH-Werten in der gleichen Weise wi bei der Durchführung des Versuchs 1 inkubiert Unte Verwendung von Macrophomina phaseoli ATCC 2044 wird die gleiche Methode durchgeführt, wobei ähnlich« Ergebnisse erhalten werden, wie aus Tabelle I hervor geht Es wird eine hohe Zersetzungsaktivität bei einen pH-Wert zwischen 5,5 und 8,5 mit Colletotrichum sp ATCC 20438 und bei einem pH-Wert zwischen 5,0 um 9,0 mit Macrophomina phaseoli ATCC 20441 beobach tet

Versuch 13

Die in der Tabelle Il zusammengefaßten verschiede nen Ausgangsmaterialien werden mit einer Zellsuspen sion von Colletotrichum sp. ATCC 20438, hergestell wie gemäß Versuch 12, umgesetzt worauf die Zer Setzungsaktivität untersucht wird. Es wird praktisch dii gleiche Aktivität gegenüber allen getesteten Verbin düngen beobachtet, und zwar unabhängig von Unter schieden bezüglich der Acylgruppe. Die in der Tabelli II gezeigten Ergebnisse sind praktisch die gleichen in Falle des Versuchs 13 sowie des Versuchs 2.

Versuch 14

Das gleiche Ausgangsmaterial, das gemäß Versuch Y. eingesetzt worden ist sowie eine Zellsuspension voi Kabatiella cauiivora ATCC 20439, hergestellt nach dei Methode gemäß Versuch 12, werden unter Einhaltung der in Tabelle III angegebenen verschiedenen Konzen trationen in der gleichen Weise wie bei der Durch führung des Versuchs 3 inkubiert Die in der Tabelle II zusammengefaßten Ergebnisse des Versuchs 14 ähnelt denjenigen, die bei der Durchführung des Versuchs 3 er mittelt worden sind.

Versuch 15

Die Wirkung der Temperatur auf die Abbauaktivitä wird untersucht wobei eine Zellsuspension voi Ascochyta phaseolorum ATCC 14728, hergestellt nacl der Methode gemäß der Versuch 12, verwende wird. Die Ergebnisse sind die gleichen wie be der Durchführung des Versuchs 4. Eine hohe Aktivitä wird, wie aus der obigen Tabelle IV zu ersehet ist, für andere Mikroorganismen bei Tempera türen zwischen 30 und 70⁰C erzielt. Wie im Falle voi Bakterien kann auch im Falle von Fungi Imperfecti eine Temperatur von 15 bis 75° C eingehalten werden.

Versuch 16

Stemphylium sarcinaeforme ATCC 20442 wird ge züchtet. Die Zellen werden gemäß Versuch 12 gewon nen. Ein zellfreier Extrakt wird in der Weise hergestellt daß die Zellen unter Verwendung einer French-Pressc aufgerissen werden, worauf das Material bei 10 0(K UpM während einer Zeitspanne von 20 Minuten zentri fugiert wird.

In ähnlicher Weise wie im Falle des Versuchs 5 wire n-Caproyl-L-valyl-L-valyl^-amino-S-hydroxy-e-methylheptanoyl-L-alanyl-4-amino-3-hydroxy-6-m_e}hy|-

heptansäure mit dem zellfreien Extrakt umgesetzt wobei 45,2 mg eines farblosen kristallinen Produktes er halten werden.

Das Enzym, das durch diese Mikroorganismen gebildet wird, kann aus den Kulturbrühen aus den Zeller isoliert und gereinigt werden, die durch Züchten der Mi kroorganisnien unter den vorstehend angegebenen Bedingungen sowie unter Einsatz der vorstehend be

schriebenen Medien erhalten werden. Eine kleine Menge des Substrats oder des Ausgangsmaterials des Abbauverfahrens kann dem Medium an einem entsprechenden Zeitpunkt zugesetzt werden, beispielsweise zu Beginn des Züchtens oder nach dem anfänglichen Wachstum, um die Bildung des Enzyms zu induzieren oder um eine stärkere Wirkung des Enzyms zu bewirken. Alle vorstehend angegebener. Mikroorganismen können verwendet werden, jedoch werden die Mikroorganismen, die zu dem Genus Bacillus gehören, zur Industriellen Produktion des Enzyms in bevorzugter Weise eingesetzt Das Züchten des Mikroorganismus kann in einer flüssigen oder festen Kultur durchgeführt werden, wobei jedoch eine Submerskultur Vorteile bei der Durchführung in industriellem Maßstäbe bietet. Gereinigtes Enzym wird aus der Kulturbrühe gewonnen. Das gereinigte Enzym besteht aus einem zellfreien Extrakt, der durch Extraktion mit Wasser oder einer Pufferlösung aus deh Zellen nach einem Aufbrechen mit einem Schaüosziüator, einer French-Presse oder einer Homogenisierungseinrichtung, unter Einsatz eines Lysozyms, eines organischen Lösungsmittels oder dergleichen durch Aussalzen unter Verwendung von Ammoniumsulfat, unter Einsatz einer O-(Diäthylaminoäthyl)-xellulose (DEAE-Zellulose)-Chromatographie, einer Sephadex· G-200-Gelfiltration sowie einer zweiten DÄAÄ-Zellulose-Chromatographie hergestellt wird. Eine Streptomycin-Behandlung kann erforderlichenfalls zur Entfernung von Nukleinsäuren durchgeführt werden. Eine Wärmebehandlung bei 60⁰C während einer Zeitspanne von 10 Minuten vor der ersten DEAE-Zellulose-Chromatographie kann ebenfalls durchgeführt werden und liefert zufriedenstellende Ergebnisse. In einigen Fällen kann das Ammoniumsulfat-Aussalzen weggelassen werden. Dies hängt von der anfänglich zur Durchführung der Reinigung eingesetzten Rohzubereitung ab.

Der folgende Versuch zeigt im Detail die Reinigungsmethode.

Versuch 17

Ein Medium, das die gleiche Zusammensetzung wie das Medium gemäß Versuch 1 aufweist, wird hegestellt, worauf 50 ml dieses Mediums in einen 500-ml-Kolben gegossen werden. Nach einer Sterilisation bei 120° C während einer Zeitspanne von 10 Minuten wird das Medium mit Bacillus sphaericus ATCC 14577 beimpft und in einer sich hin- und herbewegenden Schüttelvorrichtung (120 UpM) bei 30° C während einer Zeitspanne von 24 Stunden zur Gewinnung einer Impfkultur inkubiert. In einen 20-1-Gärungsbehälter werden 101 eines Mediums mit der gleichen Zusammensetzung gegeben, worauf dieses bei 120° C während einer Zeitspanne von 15 Minuten sterilisiert und mit der Impfkultui beimpft wird. Das Züchten erfolgt bei 30⁰C unter Rühren (300 UpM) und Belüftung (5 l/Minute). Nach einem 15stündigen Wachsenlassen wird Isovaleryl-L-valyl-L-valyl^amino-S-hydroxy-e-methylheptanoyl-L-alanyl-^amino-S-hydroxy-e-methylhep- tansäure der Kultur in einer Konzentration von 50mcg/ml zugesetzt, worauf das Züchten während einer Zeitspanne von weiteren 33 Stunden fortgesetzt wird. Die Zellen werden durch Zentrifugieren unter

ίο Einsatz einer Sharpless-Zentrifuge gesammelt, in 2 1 eines kalten 0,01 m-Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,0 suspendiert und durch eine Schallbehandlung bei 20 Kilohertz während einer Zeitspanne von 2 Minuten aufgebrochen. Diese sowie die folgenden Me thoden werden bei einer Temperatur von 4° C durchge führt. Die überstehende Flüssigkeit des bei des Schallbehandlung erhaltenen Produkts wird auf 60° C während einer Zeitspanne von 10 Minuten bei einem pH-Wert von 7 erhitzt Der erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt, worauf 3,8 g Sireptomycinsulfat zu 1,7 I der überstehenden Flüssigkeit zugesetzt werden. Ausgefällte Nukleinsäure wird durch Zentrifugieren entfernt Die auf diese Weise erhaltene überstehende Flüssigkeit wird gegen 0,01 m-tris-HCI-Puffer mit einem pH-Wert von 8,0 während einer Zeitspanne von 16 Stunden dialysiert. Die dialysierte überstehende Flüssigkeit wird an einer DEAE-Zellulosesäule (11), die zuvor mit einer 0,01 m-tris-HCI-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,0 ins Gleichgewicht gebracht worden ist, adsorbiert, worauf die Säule mit dem gleichen Puffer sowie mit 0,1 m-NaCl, gelöst in dem gleichen Puffer, aufeinanderfolgend gewaschen wird. Das Enzym wird mit 31 einer Lösung aus 0,3 m-NaCl in dem gleichen tris-Puffer eluiert Das aktive Eluat wird unter Einsatz einer Ultrafiltrationsvorrichtung konzentriert und einer Gelfiltration mit einer Sephadex^e-G-200-Säule (0 =5 χ 100 cm) unterzogen, die mit dem gleichen tris-Puffer, der 0,2 m-NaCl enthält, ins Gleichgewicht gebracht worden ist Die aktiven Fraktionen, die aus der Säule auslaufen, werden gesammelt und gegenüber einer 0,01 m-Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 6,5 während einer Zeitspanne von mehr als 6 Stunden dialysiert. Die dialysierte Lösung wird an einer DEAE-Zellulosesäule (50 ml) adsorbiert, die mit dem gleichen Phosphatpuffer ins Gleichgewicht gebracht (äquilibriert) worden ist Die Säule wird nacheinanderfolgend mit dem Puffer und mit 150 ml des gleichen Puffers, der 0,1 m-NaCl enthält, gewaschen. Das Enzym wird unter Einhaltung eines linearen Gradienten von 600 ml einer 0,1 m-NaCI-Lösung bis 600 ml einer 03 m-NaCI-Lösung in dem gleichen Phosphatpuffer eluiert.

Eine Zusammenfassung der Werte der Reinigung geht aus der Tabelle V hervor.

Tabelle V	Gesamt volumen.	Gesamt aktivität	Spezifische Aktivität	Aus beute
Reinigung des Enzyms	ml	Einheiten mg	Einheiten/ Protein	%
	1700	10 500	0,02	100
	520	7 392	0,11	70
Überstehende Flüssigkeit des schallbehandelten Materials	61	5 491	73	52
Erste DEAE-Zellulosebehandlung	28	1900	225	18
Sephadex· G-200
Zweite DEAE-Zellulosebehandlung

Die Enzymzubereitung, die aus einem aktiven Peak bei der Chromatographie erhalten wird, ergibt eine einzige Bande bei einer Scheibengelenktrophorese, einer Gelenktrofokusierung sowie bei einer Ultrazentrifugenbehandlung und weist die folgenden enzymatischen und physikochemischen Eigenschaften auf.

d)-l Wirkung und Substratspezifizität

Dieses Enzym ist sowohl bezüglich seiner Wirkung als auch seiner Substratspezifität einzigartig. Es wirkt auf

eine Verbindung der allgemeinen Formel R-VaI-VaI-X-AIa-X

zur Gewinnung eines Peptids (Val—X—Ala—X), einer organischen Säure (RCOOH) und L-Valin. Es hydrolysiert zwei

C—NH-Bindungen

Il ο

wie durch die Zahlen 1 und 2 in der folgenden Formel gezeigt wird:

/ CH

CH

NH C —X — AIa-X

Man nahm bisher an, daß die Wirkungen auf die zwei Bindungen auf verschiedene enzymatische Wirkungen zurückgehen, und zwar eine Aminoacylase-Wirkung © und eine Peptidasewirkung®, dieses Enzym übt jedoch beide Wirkungen aus. Ei.e noch interessantere und wichtigere Eigenschaf:, die nachfolgend noch näher beschrieben wird, besteht darin, c iß dieses besondere Enzym keine anderen C-N-Bindungen aufspaltet, beispielsweise die Bindung zwischen dem L-Valin und X, X

Tabelle VI Substratspezifität

und L-Alanin oder L-Alanin und X. Die Wirkung auf vei-schiedene Arten von N-Acylpeptiden, die in der Ta belle VI angegeben ist, zeigt eine sehr interessante Sub stratspezifität Diese Ergebnisse wurden bei der Durchführung einer 20 Stunden dauernden Reaktion unter den Bedingungen erhalten, die nachfolgend unter dem Abschnitt »Untersuchung der Aktivität« beschrieben werden.

Substrat

Val-X-Ala-X Produkte Organische Säuren

L-Valin

IVA-VaI IVA-VaI-VaI

IVA-Val-VaI-X +·) I 1VA-Val-Val-X-Ser ++") IVA-Val-Val-X-Ala-X + + IVA-Vai-Val-X-Ala-Thr ++*") IVA-Val-Val-X-Ser-X ++"") Acetyl-Val-Val-X-Ala-X + + Propionyl-Val-Val-X-Ala-X + + II Isovaleryl-Val-Val-X-Ala-X + + Caproyl-Val-Val-X-Ala-X + ++ Isocaproyl—Val—Val—X—AIa—X -I- +

Acetyl-Val-X-Ala-X Isovaleryl—VaI—X—AIa—X ΓΗ Pälmitoyl-Väl-X-Ala-X Benzyl-Val-X-Ala-X 2-PhenoxypropionyI—Val—X—AIa-X

In der Tabelle besitzen die Symbole folgende Bedeutungen:

IVA: Isovaleryl,Ser:L-Serin,Thr:L-Threonin " VaI-X anstatt Val-X-Ala-X VaI-X-Ser anstatt Va!-X-AIa-X VaI-X-Ala-Thr anstatt Val-X-Ala-X Val-X-Ser-X anstatt Val-X-Ala-X

Der Gruppe I in der Tabelle ist die Empfindlichkeit von N-Isovalerylpeptiden gegenüber dem Enzym zu entnehmen. IVA-VaI sowie IVA-Val-Val, wobei IVA für Isovaleryl steht, werden nicht durch das Enzym gespalten. Die Hydrolyse erfolgt an den N-Acylpeptiden mit einer längeren Kette als sie IVA-Val-Val besitzt, wie beispielsweise IVA-VaI-VaI-X. Die Produkte dieser Reaktion sind Isovaleriansäure, L-Valin und VaI-X. IVA-VaI-VaI-X—Ser, wobei Ser für L-Serin steht,

IVA-Val-Val-X-Ala-X

mit mehr Aminosäureresten als die vorstehend angegebene Verbindung,

IVA-VaI-Val-X-AIa-Thr

mit L-Threonin an dem Ende eines Carboxylrestes, wobei Thr für L-Threonin steht, und

IVA-VaI-Val-X-Ser-X

mit einem L-Serinrest anstelle von L-Alanin sind jeweils gegenüber dem Enzym anfällig. In diesen Fällen bestehen die Reaktionsprodukte zusätzlich zu Isovaleriansäure und L-Valin aus

VaI-X, Val-X-Ser,

Val-X-Ala-X.Val-X-Ala-Thrbzw.

Val-X-Ser-X.

Die Gruppe II in der Tabelle gibt eine Beziehung zwischen der Art der Acylgruppe und der Empfindlichkeit bzw. Anfälligkeit wieder. Dieses Enzym ist ebenfalls gegenüber anderen Peptiden als Isovalerylpeptiden aktiv. Dies bedeutet, daß

Acetyl-Val-Val-X-Ala-X,
Propionyl-Val-Val-X-Ala-X,
Isovaleryl-Val-VaI-X-AIa-X,
n-Caproyl - VaI - VaI - X - AIa - X

Isocapropyl-Val-VaI-X-AIa-X
jeweils in organische Säuren, L-Valin und
VaI-X-AIa-X

gespalten werden. Kein N-Acylpeptid mit einer Acylgruppe an dem N-Ende des Valins in Nachbestellung zu dem X, wie beispielsweise N-Acyl —VaI-X—AIa-, ist gegenüber diesem Enzym anfällig, wie der Gruppe III zu entnehmen ist. Dieses besondere Enzym wirkt auf die Moleküle von N-Acylpeptiden der allgemeinen Formel R—VaI-VaI-X— zur Gewinnung von Peptiden (VaI-X-), organischen Säuren und L-Valin ein. Bisher war kein Enzym mit der vorstehend geschilderten Wirkung und Substratspezifität bekannt.

d)-2 Optimaler pH und pH-Stabilität

Der optimale pH-Wert der enzymatischen Reaktion beträgt 7,0.

Die Hydrolysereaktion kann auch bei einem schwach sauren oder schwach alkalischen pH-Wert erfolgen, wie aus F i g. 1 hervorgeht. Dieses Enzym ist bei einem pH-Wert zwischen 6 und 9 stabil, wie aus F i g. 2 hervorgeht.

d)-3 Untersuchung der Aktivität

Die cnzymatische Aktivität wird in der Weise untersucht, daß die organische Säure, die aus dem N-Acylpeptid freigesetzt wird, gaschromatographisch gemessen wird.

Die Aktivität wird erfindungsgemäß gemäß folgender Methode ermittelt: Eine Reaktionsmischung aus 5 mg/ml IVA-Val-Val-X-Ala-X, 0,05 m-Phosphatpuffer, pH 7,0 und Enzym in einem Gesamtvolumen von 1,0 ml wird bei 37° C während einer Zeitspanne von 30 Minuten inkubiert Gebildete Isovaleriansäure wird mit Äther extrahiert und gaschromatographisch mit n-Valeriansäure als Innenstandard untersucht Eine Aktivitätseinheit entspricht der Bildung von 1 n-Mol Isovaleriansäure pro Minute.

Die Enzymaktivität kann auch in der Weise untersucht werden, daß L-Valin oder Val-X—AIa-X mit einem Aminosäure-Autoanalysator gemessen werden oder eine Densitometrie auf einem Dünnschichtchromatogramm, das mit Ninhydrin behandelt worden ist, durchgeführt wird. Die in Versuch 1 beschriebene Methode kann ebenfalls angewendet werden.

d)-4 Optimale Temperatur Die optimale Temperatur beträgt 63° C. IVA-Val-Val-X-Ala-X

wird mit dem Enzym unter den Bedingungen inkubiert, die vorstehend unter dem Abschnitt »Untersuchung der Aktivität« beschrieben worden sind, mit der Ausnahme, daß verschiedene Temperaturen eingehalten werden. Die Ergebnisse gehen aus der F i g. 3 hervor. Der Temperaturbereich zur Erzielung der optimalen Aktivität beträgt 15 bis 70° C.

d)-5 Wärmestabilität

Das Enzym ist sehr wsrmestabil. Nach einer Behandlung bei 80°C während einer Zeitspanne von 10 Minuten bei einem pH-Wert von 7 sind noch 60% der ursprünglichen Aktivität vorhanden. Bei einem Erhitzen auf 90°C während einer Zeitspanne von 10 Minuten gehen 98% der Aktivität verloren. Die F i g. 4 gibt eine W-rmeinaktivierungskurve wieder.

d)-6 Inhibierung und Aktivierung

Die Inhibierung des Enzyms wird in Gegenwart von 2mM o-Phenanthrolin, p-Chlormercuribenzoat, 0-Merkaptoäthanol, Dithiothreit, N-Bromsuccinimid und HgCl2 beobachtet Die Zugabe von Co⁺⁺ hat eine Erhöhung der Aktivität um 34% bei 2 mM und 66% bei 10 mM zur Folge, während die Zugabe von Ca^{+ +} eine 29%ige Erhöhung der Aktivität bei 10 mM bewirkt. Die Tabelle VII zeigt die Wirkung von verschiedenen Rcagentien auf die Aktivität.

Tabelle VII

Wirkung von verschiedenen Inhibitoren und Metallionen

Inhibitoren und Metallionen	Konzen	Relative
	tration,	Aktivität
	mM
Äthylendiamintetraessigsäure	2	30
o-Phenanthrolin	2	0
p-Chlormercuribenzoat	2	2
Monojodessigsäure	2	84
Diisopropylphosphorfluoridat	10	100
j3-Merkaptoäthanol	2	0
Dithiothreit	2	0
NaN,	2	100

Fortsetzung

Inhibitoren und Melallioncn

Konzentration.
mM

Relative Aktivität

N-Bromsuccinimid
Bleiacetat

Quecksilber(II)-acetat
Kobaltchlorid

Kalziumchlorid

Zinkchlorid

Vergleich (keine Zugabe)

2
2
2
2

10
2

10

43

134

166

110

129

66

44

100

d)-7 Physikochemische Eigenschaften

Eine Scheibengelelektrophorese ergibt eine einzige Bande mit einem RepB-V/ert von 0,048 bei einem pH von 9,5 in einem 7,5%igen Acrylamidgel und von 0,232 in einem 5%igen Gel. Eine Gelelektrofokusierung ergibt eine einzige Bande eines isoelektrischen Punktes bei einem pH-Wert von 4,2. Das Molekulargewicht des Enzyms wird nach der Gelfiltrationsmethode berechnet, wobei ein Wert von 345 000 ermittelt wird. Der Sedimentationskoeffizient wird zu 14,5 S berechnet. Bei der Durchführung einer SDS-Gelelektrophorese wird eine einzige Bande beobachtet, deren Molekulargewicht zu 45 500 berechnet wird. Dies leg! das Vorliegen von Untereinheiten nahe.

Wie vorstehend ausgeführt wurde, weist dieses besondere Enzym einige neue und einzigartige Eigenschaften auf. In erster Linie werden saure Proteaseinhibitoren, wie Pepstatine, restriktiv und spezifisch durch dieses Enzym hydrolysiert. Ferner weist dieses Enzym, das eine einzige Bande bei der Scheibengelelektrophorese, der Gelelektrofokusierung sowie beim Ultrazentrifugieren ergibt, sowohl eine Acylase- als auch Peptidaseaktivität auf. Ferner zeigt es einzigartige Substratspezifität. Nur N-Acyl-valyl-valyM-amino-S-hydroxy-6-methylheptanoyI-Verbindungen sind gegenüber diesem Enzym empfindlich. N-Acylvalin, N-Acylvalylvalin und N-Acylvalyl^-amino-S-hydroxy-e-methylheptanoyl-Verbindungen werden nicht angegriffen. Die Bindung, die gegenüber diesem Enzym anfällig ist, ist eine Bindung zwischen einer Acylgruppe und L-Valin sowie eine Bindung zwischen L-Valin und L-Valin. Eine Bindung zwischen L-Valin und X sowie andere Bindungen werden nicht aufgespalten. Kein Enzym mit den vorstehend geschilderten Eigenschaften ist bisher gefunden worden. Dieses Enzym eignet sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, d.h. zur Herstellung des neuen physiologisch aktiven Peptids sowie seiner N-Acylderivate. Ferner kann das Enzym auch auf andere Verfahren angewendet werden, beispielsweise auf eine Modifizierung von Antibiotika, Hormonen sowie Enzyminhibitoren sowie zur Herstellung von neuen physiologisch aktiven Substanzen durch eine Kombination aus enzymatischer Reaktion und chemischer Synthese.

e) Identifizierung des Hydrolyseproduktes
Das Produkt des er.zyrnatischen Abbaus von

R-Val-Val-X-Ala-X
ist eine neue Verbindung, wie vorstehend erwähnt

wurde. Die Identifizierung sowie die Eigenschaften der Verbindung werden nachfolgend angegeben:

Die Verbindung wird in Form von farblosen Kristallen mit einem F. von 171 bis 172°C (verfärbt bei 168°C) und [«];' = -51,0 (1 Gewichts-% in Methanol) erhalten. Die F i g. 5 zeigt das UV-Spektrum. Das IR-Spektrum geht aus F i g. 6 hervor, wobei die folgenden Banden beobachtet werden: 3320, 3090, 2955, 1660, 1545, 1470, 1450, 1390, 1300, 1260, 1178, 1080, 938, 890. 860, 760 und 650 cm-'. Eine Aminosäureanalyse des Hydrolysats der Kristalle in 6 n-HCI bei 105⁰C während einer Zeitspanne von 15 bis 24 Stunden ergibt L-Valin, L-Alanin sowie 4-Amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure in einem Verhältnis von 1 :1 :1,6 bis 1,9. Es wird keine organische Säure bei Einsatz eines Ätherextraktes des Hydrolysats auf gaschromatographischem Wege festgestellt. Die Elementaranalyse ergibt folgende Werte: C —57,37, H —9,!6, N — !! 20 und O = 22 27 woraus sich die Formel

C₂₄H₄₆O₇N₄

ableitet. Nimmt man an, daß die Verbindung das Hydrolyseprodukt von R-Val-Val-X-Ala-X ist, dann kann man von folgender Verbindung ausgehen: L-Valyl^-amino-S-hydroxy-e-methylheptanoyl-L-alanyl-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure. Das Massenspehtrum einer acetylierten Verbindung des Produktes gibt ebenfalls diese Struktur wieder. Daher kann die Struktur des Produktes der Hydrolyse von

R-Val-Val-X-Ala-X,

die durch das vorstehend genannte Enzym bewirkt wird, als bestimmt angesehen werden.

Das Produkt ist in Methanol, Äthanol, Pyridin und Essigsäure löslich, leicht löslich in n-Propanol, n-Butanol, η-Amylalkohol und Azeton, jedoch unlöslich in Äther, Äthylacetat und Butylacetat. Es liefert positive Thionylchlorid-, Hydroxaminsäure/Eisen(III)-chIorid-, Kaliumpermanganat-, Rydon-Smith- und Ninhydrin-Reaktionen, jedoch negative Ehrlich-, Sakaguchi-, Naphthoresorcin- sowie Anisaldehyd/Schwefelsäure-Reaktionen.

Die folgenden Rf-Werte dieser Verbindung werden bei einer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer Kieselgelplatte festgestellt: 0,57, 0,15 und 0,23 in Lösungsmittelsystemen aus n-ButünoI, Essigsäure und Wasser (4:1 :1, bezogen auf das Volumen), n-Butanol, Butylacetat, Essigsäure und Wasser (4:1 :1 :1, bezogen auf das Volumen) bzw. wäßrigem n-Butanol. Das Produkt wandert in Richtun^ auf die Kathoden als Kation bei der Durchführung einer Hochspannungspapierelektrophorese bei 3500V während einer Zeitspanne von 15 Minuten sowie unter Verwendung einer Pufferlösung aus Ameisensäure, Essigsäure und Wasser (25 :75 :900, bezogen auf das Volumen).

f) Acylierung

Eine Acylierung des Peptids VaI—X—Ala— X, das durch Hydrolyse von R—VaI-Val—X—Ala—X mit den verschiedenen Enzymzubereitungen gemäß a) bis

d) erhalten worden ist, wird an der Aminogruppe des Valins nach üblichen Methoden durchgeführt Jedes geeignete Acylierungsmittel, das die in die

ö5 ArainogTüppc einzuführende gewünschte Gruppe R' besitzt, kann verwendet werden. Geeignete Beispiele sind Carbonsäurehalogenide, Carbonsäureanhydride oder gemischte Anhydride, Thiocarbonsäuren. Diese

Mittel können jede Gruppe /?', die mit der Aminogruppe des Peptids verbunden werden soll, aufweisen.

Nachfolgend v/erden Beispiele für derartige Acylierungsmittel angegeben: Carbonsäurehalogenide, Carbonsäureanhydride oder gemischte Anhydride, Thiocarbonsäureanaloga, die eine Acetyl, Propionyl-, Butyryl-, isobutyryl-, Valeryl-, Isovaleryl-, Caproyl-, Isocaproyl, Heptanoyl-, Capryloyl-, Capryl-, Lauroyl-, My-

ristoyl-, Palmitoyl-, Stearoyl-, Arachidoyl-, Oleoyl-, Linolenoyl-, Oxalyl-, Malonyl-, Benzoyl-, Cinnamoyl-, Phthaloyl-, Acryloyl-, Phenoxyacetyl- oder Phenoxypropionylgruppe tragen.

Zur Durchführung der Acylierungsreaktion können geeignete Bedingungen der üblichen Methoden eingehalten werden. Das N-acylierte Peptid wird durch die folgende Reaktion gebildet:

H₁C

CH₃

CH

Acylierung

H₃C CH₃

\ /
CH

H₂N-HC-CO-X —Ala—X

ftlprpn Sal7R nrip.r F.stp.ri

Acyl— Ν — HC- CO — X — Ala— X
H

Werden Ester des Peptids zur Durchführung der Reaktion verwendet, dann kann freies N-Acylpeptid durch Verseifung des veresterten Produktes erhalten werden. Wie bereits erwähnt wurde, sind die auf diese Weise erhaltenen N-Acylpeptide neue und wertvolle

Verbindungen, die verschiedene physiologische Aktivitäten besitzen. Die Verbindungen lassen sich auf dem Gebiet der Medizin, Biochemie oder dergleichen einsetzen.

gjAntiprotease-Aktivität und Toxizität

Als Beispiel für eine der physiologischen Aktivitäten schrieben worden ist und in »The Journal of Antides Peptids sowie von seinen N-Acylderivaten, die er- biotics« 25, 689 (1972) geschildert wird. Die Antiprofindungsgemäß erhalten werden, sei die Antipepsin- tease-Aktivitäten des Peptids sowie seiner N-Acylderisowie die Antikathepsin D-Aktivität erwähnt. Diese vate sind extrem hoch. Verwendet man Mäuse zur BeAktivitäten sind ebenso wie die akute Toxizität in der 35 Stimmung der Toxizität, so stellt man fest, daß sie sehr Tabelle VIII zusammengefaßt. Die Aktivitäten (ID») niedrig ist.
werden nach der Methode ermittelt, die vorstehend be

Tabelle VIU

Antiprotease-Aktivität und akute Toxizität

Tetrapeptid und N-Acylpeptide	IDso(mcg/ml)	Kathepsin D	Akute Toxizität.
	Pepsin	6,5	mg/kg
VaI-X-AIa-X	9,98	0,42	LD₀ 5000 oder mehr
Acetyl - VaI - X - AIa - X	0,031	0,28	LD₀ 4000 oder mehr
Isobutyryl-VaI-X- AIa-X	0,021	0,045	—
Isovaleryl - VaI - X - AIa - X	0,01	0,05	LD₀ 3000 oder mehr
Benzoyl-Val-X-Ala-X	0,031	0,008	LD₅₀ 1350
Phenoxyacetyl—Val—X—AIa-X	0,02	0,01	LD₅₀ 1500
2-Phenoxypropionyl—VaI—X—AIa—X	0,02	1,1	LD502IOO
Palmitoyl -VaI-X-AIa-X	0,45	0,01
Pepstatin A	0,01	0,0003	LD₅₀1090
Pepstatin B	0,01	LD₅₀ 666

Bemerkung: Die akute Toxizität wird in der Weise untersucht daß die Verbindungen an Mäuse durch abdominale Injektion verabreicht werden.

Pepstatin und dergleichen sind bekannte physiologisch aktive N-Acylpeptide mit einer außergewöhnlich niedrigen Löslichkeit in Wasser. Ihre Verwendung als Arzneimittel sowie als Reagens sind aufgrund dieser geringen Löslichkeit sehr eingeschränkt Demgegenüber besitzen die N-Acylpeptide gemäß vorliegender Erfindung eine hohe Löslichkeit in Wasser, so daß sie sich als Arzneimittel und als Reagenzien in hervorragender Weise eignen. Die Löslichkeiten in Wasser der bekannten Verbindungen Pepstatin A und B sowie der erfindungsgemäßen N-Acylpeptide gehen aus der Tabelle IX hervor:

Tabelle IX
Löslichkeit in Wasser

Peptid und
N-Acylpeptid

Löslichkeit in

Wasser

(20°C,mcg/ml)

VaI-X-AIa-X > 50,000

Acetyl-VaI-X-AIa-X > 10,000

Isovaleryl-Val-X-Ala-X > 5,000

Phenoxyacetyl-Val-X-Ala-X > 20,000
Phenoxypropionyl-Val-X-Ala-X > 15,000

Pepstatin A <200

PepstaiinB <100

Die erfindungsgemäßen N-Acyltetrapeptide besitzen folgendeH^⁰C-Werte CC= 0,5% Methanol)

N-Acetyltetrapeptid -81,8°

N-Propionyltetrapeptid -86,5°

N-Butyryltetrapeptid -85,9°

N-Isobutyryltetrapeptid -87,2°

N-Valeryltetrapeptid -89,2°

N-Isovaleryltetrapeptid -88,6°

N-Caproyltetrapeptid -89,3°

N-Isocaproyltetrapeptid -89,2°

N-Heptanoyltetrapeptid -89,8°

N-Capryloyltetrapeptid -90,0°

N-Capryltetrapeptid -90,3"

N-Lauroyltetrapeptid -90,1°

N-Myristoyltetrapeptid -91,3°

N-Palmitoyltetrapeptid -92,3°

N-Stearoyltetrapeptid -91,8°

N-Arachidoyltetrapeptid -92,5°

N-OleoyltetrapeptH -92,2°

N-Linolenoyltetrapepticl -92,8°

N-Oxalyltetrapeptid - 39,0°

N-Malonyltetrapeptid -42,6°

N-Benzoyltetrapeptid -60,4°

N-Cinnamoyltetrapeptid —76,5°

N-Phthaloyltetra_Hoptid -40,3°

N-Acryloyltetrapeptid -80,1°

N-Phenoxyacetyltetrapeptid - 54,0°

N-2- Phenoxypropionyltetrapeptid — 67,8°

Die folgenden Beispiele erläutern Methoden zur Durchführung der Erfindung.

Beispiel 1

Ein Medium, das aus 1 % Pepton, 0,7% Fleischextrakt, 0,5% Glukose und 03% NaCl, jeweils bezogen auf das Gewicht, besteht und einen pH-Wert von 7 besitzt, wird hergestellt Das Medium (50 mI/500-ml-Kolben) wird bei 120° C während einer Zeitspanne von 10 Minuten sterilisiert und mit einer Kultur von Bacillus sphaericus ATCC 14577 beimpft Nach einer Inkubation auf einem sich hin- und herbewegenden Schüttler (120UpM) bei 30° C während einer Zeitspanne von 48 Stunden werden durch Zentrifugieren mit 10 000 UpM die Zellen gesammelt und in einem 0,01 m-Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) (ODeio=35) suspendiert Eine Mischung aus 50 ml der Zellsuspension, 50 ml von 2 mg/ml Isovaleryl-L-vaIyl-L-valyl-(4-amino-3-hydroxy-6-methylhepta- noyi)-L-a{anyl-(4-amiriO-3-hydroxy-6-meihy!heptansäure) und 04 ml Toluol wird bei 37° C während einer Zeitspanne von 24 Stunden inkubiert Die überstehende Flüssigkeit, die durch Zentrifugieren der inkubierten Mischung nacj. einer pH-Einstellung auf einen Wert von 2 mit HCl erhalten wird, wird auf eine mit Dowex® 50 (H+) gefüllte Säule (0=3 χ 5 cm) aufgebracht. Die Siiule wird mit H₂O gewaschen. Mit 0,5 η NH₄OH > eluierte aktive Fraktionen werden vereinigt und mit einem gleichen Volumen n-Butanol extrahiert. Die Chromatographie des Extraktes wird unter Einsatz einer Kieselgelsäule (0=2 χ30cm) durchgeführt, wobei ein Lösungsmittelsystem aus n-Butanol, Essigsäure

ίο und H2O (4:1: 1, bezogen auf das Volumen) verwendet wird. Die aktive Fraktion wird auf eine mit Sephadex LIH-20 gefüllte Säule (0 = 1 χ 50 cm) zur Durchführung einer Gelfiltration aufgebracht. Durch Konzentration der aktiven Fraktion aus der Sephadex-Säule werden Kristalle erhalten. Eine Umkristallisation aus Methanol liefert 45,3 mg kristalliner L-Valyl-4-amino-3-hydroxyö-methylheptanoyl-L-alanyl^-amino-S-hydroxy-e-msthylheptansäure (VaI-X- AIa-X).

Unter Verwendung von Escherichia coli ATCC 11303

2(i in genau der gleichen Weise wird das gleiche Ausgangsmaterial hydrolysiert, wobei 36,5 mg eines kristallinen Vnl —X —Ala —X erhalten werden.

Beispiel 2

2'. Bacillus megaterium NRRL B 938 (ATCC 13639) wird in einer Weise gezüchtet, die der in Beispiel 1 beschriebenen ähnlich ist. Die Zellen werden entfernt.

Zu 200 ml des Brühenfiltrats werden 100 mg n-Caproyl-L-valyl-L-valyl-4-amino-3-hydroxy-6-methyl-

jo lieptanoyl-L-alanyl^-amino-S-hydroxy-ö-methylheptansäure gegeben. Die Mischung wird bei 37⁰C unter leichtem Rühren während einer Zeitspanne von 24 Stunden inkubiert. Nach einer Methode, die der in Beispiel 1 beschriebenen ähnlich ist, werden 42,8 mg eines kristallinenVaI-X-AIa-Xerhalten.

Die vorstehend beschriebene Arbeitsweise wird unter Einsatz von Staphylococcus epidermidis ATCC 155 wiederholt. Man erhält 29 mg eines kristallinen VnI-X-AIa-X.

Beispiel 3

Bacillus sphaericus ATCC 14577 wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 gezüchtet, mit der Ausnahme, daß die Inkubation während einer Zeitspanne von 20 Stunden durchgeführt wird. Die Kultur wird aseptisch in einer Menge von 5 ml pro 100 ml der Gärbrühe von Pepstatin zugesetzt, das während einer Zeitspanne von 96 Stunden gezüchtet worden ist, und zwar gemäß dem Beispiel der US-PS 37 40319.

ίο Die Gärung bei 27⁰C wird während einer Zeitspanne von weiteren 35 Stunden fortgesetzt Nach der gleichen Arbeitsweise wie in Beispiel 1 werden 38,8 mg eines kristallinen Val—X—AIa-X von 11 des Brühenfiltrats gewonnen.

Verwendet man Brevibacterium ammoniagenes ATCC 68711 in der gleichen Weise, dann erhält man 25,7 mg eines kristallinen VaI—X—Ala— X.

Beispiel 4

μ Bacillus sphaericus ATCC 14577 wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 wachsen gelassen. Nach einem lfistündigen Wachstum wird ein feines Pulver des gleichen Ausgangsmaterials, das gemäß Beispiel 1 verwendet worden ist, aseptisch der Kultur zugesetzt, wobei eine Endkonzentration von 2 mg/ml eingestellt wird. Nach einem weiteren Züchten während einer Zeitspanne von 30 Stunden werden 39,5 mg eines kristallinen Val—X—Ala—X aus 50 ml des Brühen

filtrats nach der in Beispiel I beschriebenen Methode abgetrennt.

Nach der gleichen Methode werden unter Einsatz von Microbacterium lacticum ATCC 8180 3? mg eines kristallinen VaI-X — AIa-X erhalten.

Beispiel 5

Eine Zellsuspension von Bacillus megaterium NRRL B 938 (ATCC 13639), hergestellt nach der Methode gemäß Beispiel 1, wird gefriergetrocknet. Zu 50 ml der gleichen Lösung des Ausgangsmaterials, das gemäß Beispiel 1 verwendet worden ist, werden 0,7 g der gefriergetrockneten Zellzubereitung sowie Wasser zur Einstellung eines Gesamtvolumens von 100 ml zugesetzt. Der pH wird auf 7,0 eingestellt. Die Mischung wird bei 37°C während einer Zeitspanne von 24 Sekunden inkubiert. Nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise werden 45,4 mg eines kristallinen VaI — X — Ah—X gewonnen.

Verfähr* man in der vorstehend beschriebenen Weise unter Einsatz von Enterobacter aerogenes ATCC 8329, dann erhält man 30,2 mg eines kristallinen VaI-X-AIa-X.

Beispiel 6

Eine Zellsuspension von Bacillus circulans ATCC 13403 wird nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode hergestellt. Die Suspension wird mit einer French-Presse behandelt. Durch Zentrifugieren mit 10 000 UpM während einer Zeitspanne von 20 Minuten erhält man einen zellfreien Extrakt. 30 g Ammoniumsulfat werden zu 50 ml des Extrakts zugesetzt. Der Niederschlag wird in einer kleinen Menge eines 0,01 m-Phosphatpuffers (pH 7,2) aufgelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Die dialysierte Lösung wird an einer DÄAÄ-Zellulosesäule (0=3 χ 30 cm), die mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist, adsorbiert. Die Säule wird mit dem gleicher. Puffer gewaschen, worauf das Enzym mit dem gleichen Puffer, der 0,3 m NaCl enthält, eluiert wird. Eine Mischung aus 50 ml der partiell gereinigten Enzymlösung (OD2so = 25) und 50 ml der gleichen Lösung des Ausgangsmaterials, das gemäß Beispiel 1 verwendet worden ist, wird bei 37° C während einer Zeitspanne von 5 Stunden inkubiert. Nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise werden 49 mg eines kristallinen VaI — X — Ala — X aus der Reaktionsmischung erhalten.

In ähnlicher Weise werden bei Einsatz von Alcaligenes faecalis ATCC 8750 36 mg eines kristallinen VaI-X-AIa-X erhalten.

Beispiel 7

Ein Medium, das ?us 1 Teil Weizenkleie und 1 Teil einer 0,2gewichts-%igen Hefeextraktlösung besteht, wird bei 120⁰C während einer Zeitspanne von 10 Minuten sterilisiert und dann mit einer Kultur von Bacillus subtilis NRRL B 543 (ATCC 10783) beimpft. Das Züchten wird bei 30⁰C während einer Zeitspanne von 96 Stunden durchgeführt. Das Enzym wird mit einem 5fachen Volumen eines 0,01 m-Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7 extrahiert Eine Mischung aus 200 ml des Extrakts und 100 mg eines feinen Pulvers des gleichen Ausgangsmaterials, das gemäß Beispiel 1 eingesetzt worden ist, wird unter leichtem Rühren bei 37° C während einer Zeitspanne von 20 Stunden inkubiert Unter Einhaltung der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise liefert die Inkubationsmischung 43.2 mar eines kristallinen Val—X—Ala—X.

Beispiel 8

Ein Medium, das 200 ml Kartoffelextraktlösung, 5 g Glukose, 15 g Glyzerin, 30 g Hefeextrakt, 5 g Fleisch-

-, extrakt, 2 ml Äthanol sowie 20 g CaCCh in einem Gesamtvolumen von 1 I enthält und einen pH-Wert von 7,0 aufweist, wird hergestellt. Das Medium wird in einen Roux-Kolben in einer Tiefe von 5 mm eingefüllt, be^: 120⁰C während einer Zeitspanne von 15 Minuten steri-

Ki lisiert und mit einer Kultur von Acetobacter rancens NRRL B 65 (ATCC 7839) beimpft. Das Züchten wird bei 30^cC während einer Zeitspanne von 72 Stunden durchgeführt. Die Zellen werden anschließend gesammelt. Verwendet man die Zellen in der gleichen Weise wie in

ii Beispiel 1, dann erhält man 27 mg eines kristallinen VaI-X-AIa-X.

Beispiel 9

Ein Medium, das 200 ml Kartoffelextraktlösung, 20 g Glukose, 1 g Hefeextrakt und 20 g Agar in einem Gesamtvolumen von 1 I enthält und einen pH-Wert zwischen 6,5 und 7,0 aufweist, wird hergestellt. Das Medium wird in einen Roux-Kolben in einer Tiefe von 5 mm eingefüllt, bei 120⁰C während einer Zeitspanne von 15 Mi- >> nuten sterilisiert und mit Xanthomonas campestris NRRL B 1459 (ATCC 13951) beimpft. Der Kolbeninhalt wird bei 30° C während einer Zeitspanne von 72 Stunden inkubiert. Die Zellen werden von der Agarkultur geerntet. Unter Einsatz der Zellen nach der in Beispiel 1 in beschriebenen Arbeitsweise erhält man 37 mg eines kristallinen VaI-X-AIa-X.

Beispiel 10

Ein Medium mit der in Beispiel 1 angegebenen Zur, sammensetzung, das 2 Gewichts-% Agar enthält, wird hergestellt und in eine Roux-Flasche in einer Tiefe von 5 mm eingefüllt. Das Medium wird bei 120⁰C während einer Zeitspanne von 10 Minuten sterilisiert und mit Agrobacterium radiobacter ATCC 4718 beimpft. Nach to einer Inkubation bei 30⁰C während einer Zeilspanne von 72 Stunden werden die Zellen von der Agarkultur abgeerntet. Unter Verwendung der Zellen werden nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise 32.5 mg eines kristallinen Val —X —Ala —X erhalten.

Beispiel 11

Unter Verwendung von Aeromonas hydrophila NRRL B 909 (IAM 1018) nach der in Beispiel 1 be-"io schriebenen Arbeitsweise ergibt die Hydrolyse 25 mg eines kristallinen Val — X — AIa-X.

Beispiel 12

Unter Einsatz von Protaminobacter ruber NRRL B 1048 (ATCC 8457) liefert die Zersetzung nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise 24,9 mg eines kristallinen VAL-X-Ala—X.

Beispiel 13

6C Unter Verwendung von Microcyclus flavus ATCC 23276 Hefen die Hydrolyse gemäß Beispiel 1 22,5 mg eines kristallinen VA L-X-AIa-X.

Beispiel 14

Unter Einsatz von Citrobacter freundii ATCC 8090 liefert die Hydrolyse gemäß Beispiel 1 28 mg eines kristallinen VAL—X—AIa-X.

Beispiel 15

Ein Medium, das 2% Glukose, 1% Pepton, 0,001% NaCl, 0,05% KH₂PO₄, 0,05% JC₂HFO₄, 0,02% MgSO« · 7 H₂O, 0,001% MnSO₄ · 5 H₂O und 0,001% FeSO₄ · 7 H₂O, jeweils bezogen auf das Gewicht, enthält und einen pH-Wert von 6,8 besitzt, wird hergestellt und bei 120⁰C während einer Zeitspanne von 10 Minuten sterilisiert. Das sterilisierte Medium wird aseptisch in einen sterilisierten 500-ml-K.olben bis zu dem Kolbenhals eingefüllt und mit einer Impfkultur von Clostridium butyricum ATCC 6014, hergestellt durch Züchten in einem 5gewichtsprozentigen Maismedium, beimpft. Der Kolben wird bei 37" C während einer Zeitspanne von 48 Stunden inkubiert Nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise unter Einsatz der von der Kultur abgeernteten Zellen liefert die Hydrolyse 32,2 mg eines kristallinen VaI—X—Ala—X.

Beispiel 16

Ein Medium, das 0,55% Hefeextrakt, l,25<!'a Pepton, 1,1% Glukose, 1% CH₃COONa · 3 H₂O, 0,01% MgSO₄-7 H₂O. 0,005% MnSO₄ · 5 H₂O, 0,0005% FeSO₄ · 7 H₂0,0,025% KH₂PO₄,0,025% K₂HPO₄,20% Leberextraktlösung und 03% CaCOi jeweils bezogen auf das Gewicht, enthält und einen pH-Wert von 7,0 besiut, wird hergestellt und bei 120° C während einer Zeitspanne von 10 Minuten sterilisiert Das Medium wird in einen sterilisierten 500-ml-Kolben bis zu dem Kolbenhals eingefüllt und mit Streptococcus faecalis ATCC 8043 beimpft Der Kolben wird bei 37° C während einer Zeitspanne von 48 Stunden inkubiert

Nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise unter Verwendung der von der Kultur abgeernteten Zellen ergibt die Hydrolyse 17,5 mg eines kristallinen VaI-X-AIa-X.

Beispiel 17

Unter Verwendung von Leuconostoc mesenteroides NRRL B 1299 (ATCC 11449) nach der in Beispiel 16 beschriebenen Arbeitsweise liefert der Abbau 15,8 mg eines kristallinen VaI-X—AIa-X.

Beispiel 18 Unter Verwendung von Lactobacillus

brevis durchgeführt. Die Kulturbrühe wird mit der 5fachen Wassermenge verdünnt und nach der Einstellung des pH-Wertes auf 2,0 filtriert

Kristallines VaI-X—Ala—X wird in einer Menge von 70,1 mg aus 50 ml des Filtrats nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode erhalten.

Beispiel 21

ίο Ein Medium, das 0,5% Glukose, 0,5% Stärke, 0,5% Sojabohnenmehl, 0,1% KH₂PO₄ und 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O, jeweils bezogen auf das Gewicht, enthält, wird hergestellt Das Medium (50 mg in einem 500-ml-Kolben) wird bei 120⁰C während einer Zeit spanne von 10 Minuten sterilisiert und mit Kabatiella caulivora ATCC 20439 beimpft Der Kolben wird auf einem Rotationsschüttler (220 UpM) bei 28°C während einer Zeitspanne von 72 Stunden inkubiert Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 3000 UpM abgeerntet und in einem 0,01 m-Phosphatpuffer (ODuq=55) suspendiert Unter Einsatz der Zellen wird nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise verfahren. Die Hydrolyse liefert 43 mg eines kristalliner Val-X-Ala-X.

ATCC 8287 nach der in Beispiel 16 beschriebenen Methode liefert der Abbau 15,9 mg eines kristallinen VaI-X-AIa-X.

Beispiel 19

Unter Einsatz von Propionibaclerium shermanii ATCC 13673 nach der in Beispiel 16 beschriebenen Arbeitsweise liefert die Hydrolyse 14 mg eines kristallinen VaI-X-Ala-X.

Beispiel 20

Ein Medium mit der in Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung wird hergestellt und bei 120° C während einer Zeitspanne von 10 Minuten sterilisiert, n-Caproyl-L-valyl-L-valyl^-amino-S-hydroxye-methylheptanoyl-L-alanyl^-amino-S-hydroxy-6-methylheptansäure wird in einer solchen Menge aseptisch dem Medium zugegeben, daß eine Konzentration von 5 mg/ml eingestellt wird. Das Medium, das n-Caproyl-VaI-VaI-X-Ala-X enthält, wird mit Bacillus megaterium NRRL B 938 (ATCC 13639) beimpft. Das Züchten wird nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise während einer Zeitspanne von 48 Stunden

Beispiel 22

Fusarium sp. ATCC 20440 wird in ähnlicher Weis« wie in Beispiel 21 gezüchtet, wobei ein Brühenfiltrai hergestellt wird. Zu 200 ml des Filtrats werden 100 mg einer feinpulverisierten n-Caproyl-L-valyl-L-valyl-

4-amino-3-hydΓoxy-6-methyIheptanoyl-L-alanyl-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure gegeben. Die Reaktionsmischung wird bei 37°C unter leichtem Rühren während einer Zeitspanne von 24 Stunden inkubiert Nach der in Beispiel 21 beschriebener Arbeitsweise werden 44 mg eines kristalliner Val-X-Ala-X erhalten.

Beispiel 23

Stemphylium sarcinaeforme ATCC 20442 wire während einer Zeitspanne von 48 Stunden nach dei in Beispiel 22 beschriebenen Methode wachsen ge lassen. Die Kultur wird aseptisch einer Pepstatingär brühe zugesetzt, die während einer Zeitspanne vor 96 Stunden gezüchtet worden ist (vgl. die in Beispiel 2 beschriebene Arbeitsweise). Die Zugabe erfolgt ir einem volumetrischen Verhältnis von 1 :5. Di« Gärung wird während einer weiteren Zeitspanne vor 35 Stunden bei 28° C fortgesetzt Von 11 de! Brühenfiltrats des Gärungsverfahrens werden 36 mj eines kristallinen VaI—X — Ala—X nach einer Method« gewonnen, die der in Beispiel 21 beschriebener ähnlich ist.

Beispiel 24

Rhizoctonia sp. ATCC 20443 wird während einei Zeitspanne von 48 Stunden nach der in Beispiel 21 beschriebenen Methode gezüchtet. Es wird das gleiche Ausgangsmaterial wie in Beispiel 21 aseptisch dei Kultur zur Einstellung einer Endkonzentration vor 2 mg/ml zugesetzt. Das Züchten wird während einei Zeitspanne von weiteren 48 Stunden fortgesetzt. Nach einer Methode, die der in Beispiel 1 beschriebener ähnlich ist, werden 30,5 mg eines kristalliner VaI-X —Ala —X aus 50 ml des Kulturfiltrats gewon nen.

Beispiel 25

Eine Zellsuspension von Colletotrichurn sp. ATCC 20438, hergestellt nach der in Beispiel 21 beschriebenen Arbeitsweise, wird gefriergetrocknet. Eine Reaktionsmischung, die 1,1 g der gefriergetrockneten Zellen sowie 50 ml der gleichen Lösung des Ausgangsmaterials wie in Beispiel 1 in einem Gesamtvolumen von 100 ml enthält und einen pH-Wert von 7 aufweist, wird bei 37° C während einer Zeitspanne von 24 Stunden , inkubieit Unter Einhaltung einer Arbeitsweise, die der in Beispiel 1 beschriebenen ähnlich ist, werden 43 mg eines kristallinen Val—X—Ala—X erhalten.

Beispiel 26

Eine Zellsuspension von Ascochyta phaseolorum ATCC 14728, hergestellt nach der in Beispiel 21 beschriebenen Arbeitsweise, wird mit einer French-Presse behandelt Ein zellfreier Extrakt wird durch Zentrifugieren mit 10 000 UpM während einer Zeitspanne von 20 Minuten erhalten. Nach der in Beispiel 16 beschriebenen Arbeitsweise unter Verwendung des zellfreien Extrakts liefert der Abbau 50,8 mg eines kristallinen VaI-X-AIa-X.

Beispiel 27

Ein Medium, das aus 1 Teil Weizenkleie und 1 Teil einer 0,2gewichtsprozentigen Hefeextraktlösung besteht, wird hergestellt und bei 120⁰C während einer Zeitspanne von 10 Minuten sterilisiert Das Medium wird mit Kabatiella caulivora ATCC 20439 beimpft und bei 28°C während einer Zeitspanne von 120 Stunden inkubiert. Das Enzym wird mit dem 5fachen Volumen eines 0,01 m-Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7 extrahiert. Das gleiche Substrat, das gemäß Beispiel 1 verwendet worden ist, wird unter leichtem Rühren bei 37° C während einer Zeitspanne von 20 Stunden inkubiert. Unter Einhaltung einer Arbeitsweise, die der in Beispiel 1 beschriebenen ähnlich ist, werden 45 mg eines kristallinen Val—X—Ala—X aus der Inkubationsmischung gewonnen.

Beispiel 28

Ein Medium, das 0,5% Glukose, 0,7% Fleischextrakt, 1% Pepton und 03% NaCl, jeweils bezogen auf das Gewicht, enthält und einen pH-Wert von 7 besitzt, wird hergestellt. Das Medium (101) wird in ein 20-l-Gärgefäß eingefüllt und bei 120° C während einer Zeitspanne von 10 Minuten sterilisiert. Zur Herstellung einer Impfkultur werden 50 ml des gleichen Mediums in einen 500-ml-K.olben eingefüllt und mit Bacillus circulans ATCC 13403 beimpft Der Kolben wird auf einem sich hin- und herbewegenden Schüttler (120 UpM) bei 30⁰C während einer Zeitspanne von 24 Stunden inkubiert. Dem Gärungsgefäß werden 100 ml der Impfkultur zugesetzt, worauf das Züchten durch Rühren mit 300UpM sowie unter Belüftung (5 l/Minute) bei 30° C während einer Zeitspanne von 48 Stunden durchgeführt wird. Toluol wird der Kulturbrühe bei einem pH-Wert von 7,0 zur Einstellung einer Endkonzentration von 2 Volumen-% zugesetzt. Die Mischung wird unter leichtem Rühren bei 30°C während einer Zeitspanne von weiteren 2 Stunden inkubiert und anschließend filtriert. Die Enzymaktivität des klaren Filtrats (8,7 I) beträgt 0,8 Einheiten/ml. Dem Filtrat werden 5,3 kg (NH₄J₂SO₄ unter Kühlen und Rühren zur Gewinnung eines Niederschlags zugesetzt. Eine Hälfte des Niederschlags wird gefriergetrocknet. Die Aktivität des gefriergetrockneten Pulvers (5,45 g) beträgt 520 Einheiten/g. Die andere Hälfte des Niederschlags wird in 11 Wasser aufgelöst und gegenüber Ammoniumsulfat dialysiert und anschließend gefriergetrocknet Eine rohe Enzymzubereitung wird in einer Menge von 3,78 g mit einer Aktivität von 625 Einheiten/g erhalten. Die Ausbeuten betragen 81,4% bzw. 67,8%.

Beispiel 29 Eine Reaktionsmischung, die 100 mg Isovaleryl-L-

vaIyl-L-va!yl-4-amino-3-hydroxy-6-methyIheptanoyI-

L-alanyl-4-amino-3-hydroxy-6-methyIheptansäure,

250 Einheiten eines gereinigten Enzyms, hergestellt

nach der in Beispiel 17 beschriebenen Arbeitsweise,

is sowie einen 0,05 m-Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,2 in einem Gesamtvolumen von 100;"'.· enthält, wird bei 37° C während einer Zeitspanne von 20 Stunden inkubiert Unter Einhaltung einer Arbeitsweise, die der in Beispiel 1 beschriebenen ähnlich ist erhältman6l,8 mg eines kristaüinen Vai—X—Aia—X.

Beispiel 30

Zu 51 mg L-VaI-X-L-AIa-X, gelöst in 15 ml H₂O bei einem pH-Wert von 8,5, wird ImI Acetylchlorid tropfenweise unter Rühren bei Zimmertemperatur zugesetzt wobei der pH-Wert der Reaktionsmischung auf 8,5 unter Einsatz von 1 n-NaOH sowie unter Verwendung eines den pH-Wert steuernden Geräts gehalten wird. Nachdem die Reak tion beendet ist, wird der pH-Wert auf 1,8 unter Verwendung von 6 n-HCI eingestellt Die erhaltene Lösung wird mit 4x5ml n-Butanol extrahiert. Die Butanolschicht wird mit 3 ml Wasser dreimal gewaschen und dann eingedampft Der erhaltene Rück- stand wird in 0,5 rr>> Methanol aufgelöst worauf 30 ml H₂O zugesetzt werfen.

Die Lösung wird durch eine mit Dowex (50 χ 8) gefüllte Säule (50 bis 100 mesh, H⁺, 10 ml) geschickt Die Säule wird dann mit 20 ml H₂O gewaschen. Der Ablauf und das Waschwasser werden gesammelt, vereinigt und eingedampft. Nach dem Trocknen erhält man 45 mg eines weißen Pulvers, bei dem es sich um N-Acetyl—VaI-X-AIa-X handelt. Die Ausbeute beträgt 81%.

Analyse für C₂₆H₄₈N₄O₈:

Berechnet: C 57,33, H 8,88, N 10,29, 0 23,50; gefunden: C 57,29, H 8,91, N10.P5, 0 23,83.

Beispiel 31

^K

Unter Einhaltung einer Arbeitsweise, die der in Beispiel 30 beschriebenen ähnlich ist, wobei Isobutyrylchlorid verwendet wird, liefert die Acylierung von 50 mg Val—X—Ala—X 32 mg eines weißen Pulvers aus N — Isobutyryl—Val—X—AIa-X in einer 50%igen Ausbeute.

Analyse für C₂₈H₅₂N₄O₈:

Berechnet: C 58,72, H 9,15, N 9,78, 0 22,35; gefunden: C 58,95, H 9,16, N 9,56, O 22,12.

Beispiel 32

Unter Einhaltung einer Arbeitsweise, die der in Beispiel 30 beschriebenen ähnlich ist, wobei Isovalerylchlorid eingesetzt wird, liefert die Acylierung von 50 mg Val-X-Ala —X 28 mg eines weißen Pulvers, bei dem es sich um N-Isovaleryl-Val —X-AIa- handelt, das in einer 48%igen Ausbeute erhalten wird.

Beispiel 33

Zu 100 mg VaI-X-AIa-X, gelöst in 5 ml Methanol, werden 54,2 mg Benzoesäureanhydrid tropfenweise unter Rühren und Kühlen in einem Eisbad zugesetzt Die Lösung wird über Nacht bei 5 bis 7° C gerührt, worauf 5 ml H₂O zugesetzt werden. Nach einem Eindampfen zur Entfernung des Methanols wird die erhaltene Lösung mit Äther extrahiert Dabei erhält man einen weißen Niederschlag zwischen der Äther- und der Wasserschicht. Der Niederschlag wird gesammelt und getrocknet Der Rückstand wird mit Äther gewaschen und in einem kleinen Volumen Methanol aufgelöst Dann wird die Lösung auf eine mit Sephadex® LH-20 in Methanol gepackte Säule (0 = 14 χ 80 cm) aufgegeben. Der Ablauf wird gesammelt und eingedampft Dabei erhält man 32 mg N—Benzoyl—Val—X—Ala—X in Form eines weißen Pulvers in euer Ausbeute von 32%.

Beispiel 34

Zu 50 mg Val—X—Ala—X, suspendiert in 3 ml Dioxan, werden 42,9 mg Phenoxyessigsäureanhydrid, gelöst in 3 ml Dioxan,' tropfenweise unter Rühren bei Zimmertemperatur zugesetzt Die Lösung wird über Nacht gerührt worauf 10 ml H2O zugesetzt werden. Dioxan wird durch Eindampfen entfernt Die erhaltene Lösung wird mit Benzol zweimal gewaschen und mit Äthylacetat extrahiert Die Äthylacetatschicht wird eingedampft, worauf der Rückstand in einem kleinen Volumen Methanol aufgelöst wird. Eine Gelfiltration mit einer Sephaciex® LH-20-Säule liefert 22 mg eines weißen Pulvers, bei dem es uch um N —Phenoxyacetyl - Val - X- Ala- X handelt (Ausbeute 44%).

Beispiel 35

Zu 50 mg VaI-X-AIa-X, gelöst in 4 ml H₂O (pH-Wert 8,5) werden 20,2 mg 2-Phenoxypropionylchlorid, gelöst in 1 ml Azeton, tropfenweise bei Zimmertemperatur unter Rühren zugesetzt, wobei der pH-Wert auf 8,5 unter Verwendung von 1 n-NaOH sowie unter Einsatz eines den pH-Wert konstant haltenden Gerätes gehalten wird. Die Lösung wird während einer Zeitspanne von 1 Stunde bei Zimmertemperatur gerührt und eingedampft. Der Rückstand wird mit einem Volumen Methanol extrahiert. Eine Sephadex® LH-20-Gelfiltration liefert 49 mg N-2-Phenoxypropionyl—Val—X—AIa-X in Form eines weißen Pulvers in 75%iger Ausbeute.

Beispiel 36

Unter Einhaltung einer Methode, die der Methode gemäß Beispiel 35 ähnlich ist, wobei Oxalylchlorid verwendet wird, liefert die Acylierung von 50 mg VaI-X-AIa-X 39 mg N-Oxalyl-VaI-X-AIa-X in einer 68%igen Ausbeute.

Beispiel 37

Unter Einhaltung einer Methode, die der in Beispiel 35 beschriebenen ähnlich ist, wobei Malonylchlorid verwendet wird, liefert die Acylierung von 50 mg Val-X-Ala-X25,1 mg

N-Malonyl-VaI-X-AIa-X
in einer 43%igen Ausbeute.

Beispiel 38

Unter Einhaltung einer Arbeitsweise, die der in Beispiel 35 beschriebenen ähnlich ist, wobei Palmitoylchlorid eingesetzt wird, liefert die Acylierung von 50 mg Val—X—Ala—X 57,5 mg N-Palmitoyl—Val—X—Ala—X in einer 78%igen Ausbeute.

B e i s ρ i e 1 39

Eine Rückflußbehandlung von 100 mg VaI-X-AIa-X, gelöst in 10 ml HCl/Methanol, bei 6O⁰C während einer Zeitspanne von 2 Stunden sowie ein Eindampfen der Mischung liefert den Methylester von Val—X—AIa-X. Der Ester (Rückstand) wird in 10 ml Methanol aufgelöst und mit Triäthylamin neutralisiert Der Lösung wird die 5fache Molmenge an Essigsäureanhydrid tropfenweise unter Rühren zugesetzt Die Reaktion wird unter Rühren über Nacht fortgesetzt und durch Dünnschichtchromatographie sowie unter Anwendung der Ninhydrinreaktion überwacht. Die erhaltene Mischung wird eingedampft Der Rückstand wird in 5 ml H₂O aufgelöst und dann mit 3x5 ml Äthylacetat extrahiert Die organische Schicht wird eingedampft Dabei wird der Methylester von N—Acetyl—VaI-X- Ala—X erhalten. Das Material wird in 3 ml Methanol aufgelöst, worauf 3 ml einer 1 n-NaOH-Lösung zugesetzt werden. Die Verseifung des Esters erfolgt durch Rückflußbehandlung der Mischung bei 6O⁰C während einer Zeitspanne von 3 Stunden. Die erhaltene Lösung wird mit HCl neutralisiert Eine Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex® .LH-20 ergibt 70,4 mg N—Acetyl—Val—X—Ala—X in Form eines weißen Pulvers in einer 65%igen Ausbeute.

Das erfindungsgemäße Peptid Val—X—AIa-X sowie seine N-Acylderivate besitzen eine geringe Toxizität Mäuse, Hunde, Ratten und Kaninchen tolerieren eine orale Verabreichung von mehr als 2000 mg/kg der Verbindungen. Die LD50 der Verbindüngen gegenüber Tieren gehen aus der Tabelle VIII hervor (intraperitoneale Injektionen). Eine tägliche orale Verabreichung von 250 mg/kg einer jeden der Verbindungen an Ratten während einer Zeitspanne von 90 Tagen hat keine Toxizität zur Folge. Die Ratten wachsen mit der normalen Wachstumsgeschwindigkeit. Vor der Auffindung von Pepstatin gemäß den US-PS 37 40 319 und 38 40 516 sowie der analogen Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung war kein starker Pepsininhibitor bekannt. Wenn auch Polysacchariden) Schwefelsäureester dafür bekannt sind, daß sie Pepsin inhibieren, so ist ihre Wirkung sehr gering, wobei außerdem die Blutkoagulierung inhibiert wird. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind starke Pepsininhibitoren, wie anhand der 5O°/oigen Inhibierungskonzentration, die weiter oben geschildert worden ist, hervorgeht, wobei die Verbindungen keine Wirkung auf die Blutkoagulierung ausüben. Die starke Pepsininhibierende Wirkung zeigt an, daß diese Verbindungen wirksam zur Bekämpfung von Magengeschwüren sind. Dies

bo wurde durch klinische Untersuchungen, wie sie in den USPS 37 40 319 und 38 40 516 beschrieben werden, bestätigt.

Magengeschwüre von Ratten, die nach der Methode erzeugt werden, welche von Takagi et al. in »Japanese

M Journal of Pharmacology«, 18, 9—19 p, 1968 beschrieben wird, wobei männliche Ratten in einen Käfig während einer Zeitspanne von 22 Stunden bei einer Temperatur von 23°C eingesperrt werden, können

35

durch die Verbindungen therapeutisch behandelt werden, wobei die Ratten auch durch diese Verbindungen geschützt werden. 50 mg/kg Pepstatin sowie die erfindungsgemäßen Verbindungen werden oral 30 Minuten vor dem Streß verabreicht Die Ratten werden 48 Stunden nach dem Streß getötet Das Heilungsverhältnis der Magengeschwüre beträgt 60 bis 75%. Beträft die Dosis 10 mg/kg, dann beträgt der Prozentsatz der Inhibierung der Geschwüre 50 bis 60%. bis 200 mg/kg der Verbindung werden sofoit nach

dem Streß sowie einmal täglich während einer Zeitspanne von 4 Tagen verabreicht, worauf die Ratten getötet werden. Die schnelle Heilung von Geschwüren ist im Falle von Ratten festzustellen, die mit Pepstatin sowie den analogen Verbindungen behandelt worden sind.

Die folgende Tabelle X zeigt, daß die erfindungsgemäßen N-Acylpeptide praktisch die gleiche stark schützende und heilende Wirkung gegenüber Rattenmagengeschwüren ausüben wie das bekannte Pepstatin.

Tabelle X

Inhibrierung einer Geschwürbildung:

N-Acylpeptid

Dosis

(mg/kg) (p.o.) Anzahl der
Ratten

Hemmung einer
Geschwürbildung*)

(mittlerer Wert, %)

Acetyl-Val-X-Ala-X
Isobutyl-Val-X-Ala-X
Isovaieryl-VaI-X-Ala-X Benzoyl-Val-X-Ala-X
Phenoxyacetyl—Val—X—Ala—X Phenoxypropionyl—VaI—X—AIa—X Pepstatin A
Vergleich

50 10 50 10 50 10 50 10 50 10 50 10 50 10

iO	6i
5	55
5	72
5	57
5	65
5	58
5	75
5	51
5	77
5	61
5	68
5	60
5	77
5	58
10	(0)

·) Die schützende und heilende Wirkung gegenüber Magengeschwüren läßt sich anhand der foigenden Formel berechnen, die auf der Geschwür fläche basiert, die sich auf dem Magen der Ratte gebildet hat:

schützende und
heilende Wirkung
(in %) gegenüber
Magengeschwür

A
B

A-B

X 100

= Geschwürfläche der Vergleichsratte (ohne verabreichten Wirkstoff). ■ Geschwürfläche der Ratte, an die der Wirkstoff verabreicht worden ist.

Eine Wirkung gegenüber Magengeschwüren von Ratten, die durch ein Abschnüren des Magenausgangs erzeugt werden, kann ebenfalls nachgewiesen werden, -,n Das von Watanabe und Kasuya in »Chemical Pharmaceutical Bulletin«, 11, 1282, 1963 beschriebene Verfahren wird angewendet. In Ratten, denen 2 bis 10 mg/kg oder größere Dosen 30 Minuten sowie 14 Stunden nach dem Zuschnüren des Magenausgangs verabreicht 55 worden sind, werden keine Geschwüre festgestellt. Die 50%ige Inhibierungsdosis beträgt 0,5 bis 3 mg/kg.

Die Pepsinaktivität im Magensaft liegt bei weniger als 10% derjenigen der Vergleichsprobe oder ist t.ichi feststellbar. Die erfindungsgemäßen Verbindungen üben daher eine ausgeprägt schützende und heilende Wirkung gegenüber Magengeschwüren von Ratten aus.

Hierzu 4 BIuIt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:
l.Tetrapeptid der Formel:

Val—X—Ala—X CD

worin sich VaI von L-Valin, X von 4-Amino-3-hydroxy-6-methyIheptansäure und AIa von L-Alanin ableiten, sowie dessen N-Acyl-Derivate der allgemeinen Formel:

R'—Val—X—Ala—X

worin R' Acetyl, Propionyl, Butyryl, Isobutyryl, Valeryl, Isovaleryl, Caproyl, Isocaproyl, Heptanoyl, Capryloyl, Capryl, Lauroyl, Myristoyl, Palmitoyl, Stearoyl, Arachidoyl, Oleoyl, Linolenoyl, Oxalyl, Malonyl, Benzoyl, Cinnamoyl, Phthaloyl, Acryloyl, Phenoxytcstyl oder Phenoxypropionyl bedeutet
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein N-Acylpentapeptid der allgemeinen Formel:

R —Val —Val —X--Ala—X

(DT)

worin R eine Acylgruppe oder Halogenacylgruppe mit jeweils 2 bis 8 Kohlenstoffatomen bedeutet und Val, X und AIa die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen LJoen, an einem Enzym hydrolysiert, das von Bacillus megatprium MRRL B 938 (ATCC 13639), Bac circulans ATCC 13403, Bac. sphaericus ATCC 14577, Bac. cereus ATCC 9634, Bac. subtilis NRRL B 543 (ATCC 10783), Clostridium butyricum ATCC 6014, Pseudomonas segnis ATCC 4358, Xanthomonas campestris NRRL B 1459 (ATCC 13951), Acetobacter rancens NRRL B 65 (ATCC 7839), Aeromonas hydrophila NRRL B 909, Protaminobacter ruber NRRL B 1048 (AZCC 8457), Microcyclus flavus ATCC 23276, Agrobacterium radiobacter ATCC 4718, Alcaligenes faecalis ATCC 8750, Escherichia coli ATCC 11303, Citrobacter freundii ATCC 8090, Micrococcus rubens ATCC 186, Staphylococcus epidermis ATCC 155, Sarcina lutea ATCC 9341, Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871, Streptococcus faecalis ATCC 8043, Leuconostoc mesenteroides NRRL B 1299 (ATCC 11449), Lactobacillus brevis ATCC 8287, Propionibacterium shernianii ATCC 13673, Corynebacterium equi ATCC 6939, Microbacterium lacticum ATCC 8180, Cellulomonas fimi ATCC 8183, Arthrobacter ureafaciens ATCC 7562, Macrophomina phaseole ATCC 20441, Ascochyta phaseolorum ATCC 14728, Colletotrichum sp. ATCC 20438, Kabatiella caulivora ATCC 20439, Stemphylium sarcinae forme ATCC 20442, Rhizoctonia sp. ATCC 20443 und Fusarium sp. ATCC 20440 erzeugt worden ist, und das Tetrapeptid gegebenenfalls in an sich bekannter Weise in ein N-Acyl-Derivat gemäß Anspruch 1 überführt.

Es ist bekannt, daß bestimmte Peptide physiologische Aktivitäten aufweisen. Insbesondere N-terminale-Acylpeptide, zeigen eine interessante Aktivität. Von sauren Proteasen wurde beispielsweise berichtet, daß sie in spezifischer Weise durch N-Acylpeptide, d.h. Pepstatine, der allgemeinen Formel;