DE2813507C3

DE2813507C3 - Amastatine, Verfahren zu ihrer Gewinnung und diese enthaltende pharmazeutische Zubereitungen

Info

Publication number: DE2813507C3
Application number: DE2813507A
Authority: DE
Inventors: Takaaki Fujisawa Kanagawa Aoyagi; Masa Hoya Tokio Hamada; Tomio Tokio Takeuchi; Hamao Tokio Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1977-07-22
Filing date: 1978-03-29
Publication date: 1980-09-11
Also published as: ES468457A1; DE2813507A1; DE2813507B2; GB1553656A; JPS5424845A; BE865565A; FR2398048B1; AU511023B2; AU3470978A; JPS568829B2; IT1108029B; IT7867722A0; FR2398048A1

Description

(CH₂

-C —NH-CH-C —NH-CH-C —NH-CH-C

OH 0

in der die Aminosäurereste 2 bis 4 die L-Konfiguration aufweisen und die Bedeutungen wie folgt zuzuordnen sind:

Amastatin	R¹	R²	η	X
A₁	CH₃	H	1	NH₂
A₂	CH₃	H	I	OH 2i
A₁	CH₃	II	2	OH
B,	H	CH₃	2	NH₂
B₂	H	CH₃	2	OH

Die Erfindung betrifft als Amastatine Ai, A2, A3, Bi und B₂ bezeichnete neue Tetrapeptide mit einer physiologischen Wirkung sowie deren Salze, Methylester, N-Acetyl- und N-Propionyl-Derivate und deren Methylester. Diese Verbindungen vermögen eine inhibierende Wirkung auf Aminopeptidase A auszuüben und zeigen auch eine Stimu'ierung einer Antikörperbildung. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung dieser Verbindungen sowie pharmazeutische Zubereitungen, welche diese neuen Verbindungen enthalten und als Inhibierungsmittel für Aminopeptidase A sowie als Zubereitungen zur Erhöhung der Antikörperbildung eingesetzt werden können.

Einige physiologisch aktive Peptide oder N-acylierte Peptide wurden in Kulturbrühen gefunden. Diese Substanzen, beispielsweise Leupeptin, Antipain, Chymostatin und Pepstatin, inhibieren Trypsin, Papain, Chymotrypsin bzw. Pepsin; alle diese Inhibitoren üben jedoch ihre Wirkung auf Proteasen aus, die in einer Endotypreaktion wirken. Weitere Einzelheiten bezüglich dieser Enzyme findet man in »Enzyme Inhibitors of deren Salze, Methylester, N-Acetyl- und N-Propionyl-Derivate sowie deren Methylester.

2. Verfahren zur Gewinnung der Amastatine gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces sp. ATCC 31318 oder dessen natürliche oder künstliche Mutanten unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium bei 25 bis 35⁰C in einem pH-Bereich von 6,0 bis 9,5 züchtet, die Amastatine in an sich bekannter Weise aus der Kulturbrühe isoliert und gegebenenfalls in die in Anspruch 1 genannten Derivate überführt

3. Pharmazeutische Zubereitungen, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Verbindung gemäß Anspruch 1.

Microbial Origin«, Hamao Umezawa, University of j-, Tokyo Press (1972) in Kapitel IV, Inhibitors of Proteolytic Enzymes (Seiten 15 bis 52) an den folgenden Stellen:

Peptide Seiten

Leupeptin
Antipain
Chymostatin
Pepstatin

15
29
32
34

Bestatin, das auch in einer mikrobin Kulturbrühe gefunden wurde, inhibiert ein proteolytisches Enzym des Exotyps, d. h., Aminopeptidase B und Leucinaminopeptidase, es übt jedoch keinerlei inhibierende Wirkung auf Aminopeptidase A aus (J. Antibiotics 29, S. 97 bis 103 und 600 bis 601 und US-PS 40 29 547).

Durch die Erfindung werden Amastatine Ai, A₂, A₃, Bi und B₂ der allgemeinen Formel

CH₁
1

I
CH-

-R'

R²

CH₃
CH-CH₃

CH₃

CiI -CH.,

COOH

ICH,),, O

I " ■/
c

H,N-CH -CH - --C- -NH CH C-- NH -CH C-NH --CH

II! Il !I

OH O C) O X

Amastatin R

A,	CHj	H	1	NH₂
A₂	CH₃	H	j	OH
A₃	CH₃	H	2	OH
B₁	H	CH₃	2	NH₂
B₂	H	CHj	2	OH

sowie deren Salze, Methylsster, N-Acetyl- und N-Propionyl-Derivate sowie deren Methylester zur Verfügunggestellt

Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung dieser Amastatine, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Streptomyces sp. ATCC 31318 oder dessen natürliche oder künstliche Mutanten unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium bei 25 bis 35° C in einem pH-Bereich von 6,0 bis =),5 züchtet, die Amastatine in an sich bekannter Weise aus der Kulturbrühe isoliert und gegebenenfalls in die in Anspruch 1 genannten Derivate überführt

Schließlich betrifft die Erfindung pharmazeutische Zubereitungen, die gekennzeichnet sind, durch einen Gehalt an einer der genannten neuen Verbindungen.

Die Erfindung wird durch die Zeichnungen näher erläutert Es zeigt

Fig. 1, 2, 3, 4, 5 die Infrarotabsorptionsspektren in KBr der Amastatine A ι, A₂, Aj, B ι bzw. B₂,

F i g. 6, 7, 8,9 und 10 die NMR-Spektren (100 MHz in D₂O) der Amastatine in der gleichen Reihenfolge wie sie ι (ι vorstehend angegeben worden ist,

Fig. 11, 12, 13, 14 und 15 die Massenspektren von N-Acetylamastatindimethylestern der Amastatine in der gleichen Reihenfolge, wie sie vorstehend angegeben worden ist

Die erfindungsgemäßen Amastatine Ai, A₂, Aj, Bi und Bi sind strukturell miteinander verwandt Sie weisen folgende ähnliche physikalische Eigenschaften auf: Schmelzpunkte, Elementaranalysenwerte, pKa-Werte, Rf-Werte bei der Dünnschichtchromatographie sowie jo Wanderungswerte bei der Durchführung einer Hochspannungspapierelektrophorese. Diese Eigenschaften sind in der folgenden Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle 1

Phvsikalisch/chemische Eigenschaften von Amastatinen

	Amastatine	Ai	A3	B i	B2
	Al	202-20S	196-200	195-197	196-200
F. C	200-203
Elementaranalysewerte
gefunden, %		53,00	54,30	54,00	54,31
C	53,06	7,91	8,01	8,40	7,98
H	8,32	27,17	11,16	23,02	11,21
0	14,61	11,67	26,10	14,18	26,00
N	23,00
berechnet, %		53,15	54,08	54,19	54,08
C	53,26	8,07	8,25	8,48	8,25
H	8,30	11,81	11,47	22,97	11,47
0	14,79	26,98	26,20	14,36	26,20
N	23,65	C₃₁H₃₈N₄O₈	C₂₂H₄₀N₄O₈	C₂₂H₄₁N₅O₇	C₂₂H₄₀N₄O₈
für	C₂IH₁₉NsO₇	474	488	487	488
Molekulargewicht	473	2,8	3,0	3,7	3,0
pKa	3,8	0,46	0,54	0,55	0,52
Rf-Wert*)	0,47	0,51	0,53	0,54	0,53
Rm-Wert**)	0,52

*) Die Dünnschichtchromatographie wird unter Verwendung einer Kieselgelplatte und eines Lösungsmittelsystems aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser (4:1:1) durchgeführt.

**) Relativer Wanderungsabs'rr'¹ in Richtung auf eine Kathode zu Alanin mit einer Pufferlösung aus Ameisensäure, Essigsäure und Wasser (25 :'..,. i«>; bei 3500 V während einer Zeitspanne von 15 Minuten.

Die Amastatine Ai, A₂, Aj, Bi und B₂ sind in Wasser, Methanol. Essigsäure, Pyridin sowie Dimethylsulfoxid löslich, wenig löslich in n-Propanol und n-Butanol und praktisch unlöslich in Äthylacetat, Butylacetat, Diäthyläther, η-Hexan, Petroläther, Benzol sowie Chloroform. Sie geben positive Rydon-Smith-, Ninhydrin und

Kaliumpermanganatreaktionen, jedoch negative Ehrlich- und Sakaguchi-Reaktionen. Es wird keine charakteristische UV-Absorption festgestellt. Die Amastatine sind in neutralen, sauren und alkalischen Lösungen stabil. Die inhibierende Aktivität einer Aminopeptidase A wird nicht durch Erhitzen der wäßrigen Lösung mit einem pH von 2, 7 oder 9 bei 60°C während einer Zeitspanne von 30 Minuten herabgesetzt.

Nachfolgend werden die Strukturen der Amastatine beschrieben, soweit sie bisher aufgeklärt werden konnten.

Amastatin Ai

Das Infrarotabsorptionsspektrum (F i g. 1) in Kaliumbromid weist folgende Absorptionspeaks auf: 3300, 2980, 1710, 1665,1635,1550, 1470, 1405,1355, 1225, 1150, 1090 und 700 (cm -'). Die Aminosäureanalyse des sauren Hydrolysats der Verbindung in 6 η HCl bei 105° C während einer Zeitspanne von 18 Stunden ergibt Valin, Asparaginsäure sowie eine bisher unbekannte Aminosäure mit einem Molverhältnis von 2:1 :1. Die neue Aminosäure wurde durch Harzchromatographie isoliert und gereinigt. Ihre Struktur wird durch das NMR-Spektrum, IR-Spektrum, die Elementraranalyse, den pKa-Wert, die Farbreaktionen sowie chemische Reaktionen ermittelt und durch die chemische Synthese als Struktur der folgenden Formel bestätigt:

OH

NH₂-C C-COOH

CH₂ H

CH

/ \
CH₃ CH₃

3-Amino-2-hydroxy-5-methylcapronsäure

Das NMR-Spektrum (100 MHz in D₂O) von Amastatin A, (Fig.6) zeigt Signale bei <5 1,1 — 1,4, i,6-2,i, 2,2—2,6, 3,0—3,2, 3,85—3,95 und 4,4-4,7. Zur weiteren Charakterisierung wurde das Peptid an dem N-Ende acetyliert und der Dimethylester von N-Acetylamastatin Ai einer Massenanalyse (Fig. 11) unterzogen. Das Ergebnis zeigt, daß diese Aminosäuren durch Amidbindungen in der Reihenfolge N-acetylierte neue Aminosäure, L-Valin, L-Valin sowie L-Asparaginsäuredimethylester, gerechnet von dem N-Ende, gebunden sind. Der vorstehend erwähnte pKa-Wert von 3,8 zeigt, daß die ^-Carboxylgruppe der Asparaginsäure an dem C-Ende des Peptids frei ist und die anderen «-Carboxylgruppen ein Säureamid bilden. Die Struktur von Amastatin Ai läßt sich daher wie folgt ermitteln:

H OH H H H

Il I I I

NH₂-C C-CONH-C-CONh-C-CONH-C-CONH₂

Il I I I

CH₂ H CH CH CH₂

CH CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ COOH

CH₃ CH₃

C₂₁H₃₉N₅O₇

S-Amino^-hydroxy-S-methylhexanoyl-L-valyl-

L-valyl-L-asparaginsäure-«-amid

Amastatin A₂

Das IR-Spektrum (KBr) (Fig.2) zeigt folgende Peaks: 3400, 3250, 3030, 2930, 1700, 1650, 1620, 1530, 1465, 1390, 1220, 1160, 1085 und 700 (cm-'). Die Aminosäureanalyse ergibt das gleiche Ergebnis wie im TaIIc von Amastaiin Ai. Die neue Aminosäure wurde ebenfalls als die gleiche Aminosäure wie diejenige von Amastatin A_t nach den vorstehend beschriebenen Methoden identifiziert In dem NMR-Spektrum von Amastatin A₂ (F i g. 7) wurden die Signale bei δ 1,2 — 1,5, 1,9-2,1, 23-2,7, 3,15-335, 3,85-4,15, 4,5-4,8 und 4,9—5,1 beobachtet Eine massenspektrometrische Analyse mit hoher Auflösung (Fig. 12) von N-Acetylamastatindimethylester zeigt die gleiche Aminosäuresequenz wie im Falle von Amastatin Ai. Die Elementaranalyse sowie die pKa-Werte von 2,8 und 4,0 zeigen jedoch, daß die zwei Carbonyigruppen von Asparaginsäure Carbonsäuregruppen sind. Die Struktur läßt sich wie folgt ermitteln:

H OH H H H

NH₂-C C—CONH—C—CONH—C—CONH—C —COOH

Il I I I

CH₂ H CH CH CH₂

CH CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ COOH CH₃ CH₃

C₂₁H₃₈N₄O₈

S-Amino^-hydroxy-S-methylhexanoyl-L-valyl-L-valyl-L-asparaginsäure

Amastatin A3

Das IR-Spektrum (KBr) (Fig. 3) der Verbindung weist folgende Peaks auf: 3430, 3280, 2950, 1710, 1660, 1630, 1540, 1467, 1395, 1225, 1090, 960 und 700 (cm-¹)· Die Aminosäureanalyse des Säurehydrolysats ergibt Valin, Glutaminsäure sowie eine unbekannte Aminosäure. Die neue Aminosäure wird als die gleiche Säure wie im Falle von Ai und A2 identifiziert. Das NMR-Spektrum von Amastatin A₃ (Fig.8) zeigt Signale bei ό

U)

1,2-1,6,2,3-2,7,2,7-3,0,3,1 -3,4,3,8-4,4 und 4,4-4,9. Ein mit hoher Auflösung ermitteltes Massenspektrum (Fig. 13) von N-Acetylamastatin-As-dimethylester zeigt, daß N-acetylierte neue Aminosäure, Valin, Valin sowie Glutaminsäuredimethylester in der angegebenen Reihenfolge, beginnend von der N-Endgruppe, unter Bildung von Amidbindungen gebunden sind. Die pK.a-Werte von 3,0 und 4,2 lassen vermuten, daß die tx- und y-Carbonylgruppen der Glutaminsäure Carbonsäuregruppen sind. Aus diesen Ergebnissen läßt sich die Struktur von Amastatin A3 wie folgt ermitteln:

H OH H H

ί ί ί ί

NH,-C C—CONH-C—CONH-C —

CH, H

CH

/ \
CH₃ CH₃

CH CH

CH₃ CH₃ CH₃ CH₃

C₂₂ H₄₀N₄O,,

ί
—C-COOH

CH₂

|_Hi

COOH

S-Amino^-hydroxy-S-methylhexanoyl-L-valyl-L-valyl-L-glutaminsäure

Amastatin Bi

In dem IR-Spektrum (Fig.4) werden folgende Absorptionsbanden ermittelt: 3340, 3000, 1710, 1665, 1640, 1550, 1475, 1405, 1315, 1230, 1160, 1090, 960 und 700 (cm-¹). Die Aminosäureanalyse des Säurehydrolysats von Amastatin B₁ in 6 η HCI bei 105⁰C während einer Zeitspanne von 18 Stunden ergibt Valin, jo Glutaminsäure sowie eine unbekannte Aminosäure in einem Mol verhältnis von 2:1 :1. Die neue Aminosäure wurde isoliert und gereinigt und durch NMR-Analyse charakterisiert. Die Struktur der Aminosäure wurde durch chemische Synthese wie folgt ermittelt:

H OH

NH₂-C C-COOH

H₁C-CH H

CH₂ CH₃

3-Amino-2-hydroxy-4-methylcapronsäure

Das NMR-Spektrum von Amastatin B_t (10^ MHz in D₂O) (Fig.9) zeigt Signale bei <5 0,6-1,0, 1,2-1,55, 1,6—23.. 2_:95-33_; 3_:8—4_;4_; 7.4 — 7,7 und 7,9-8,3. Die Analyse des mit hoher Auflösung ermittelten Massenspektrums (Fig. 14) von N-Acetylamastatin-Bi-dimethylester zeigt, daß N-acetylierte neue Aminosäure, Valin, Valin und Glutaminsäuredimethylester durch Amidbindungen in der erwähnten Sequenz gebunden sind. Durch den pKa-Wert von 3,7 wird die Vermutung nahegelegt, daß die y-Carbonylgruppe der Glutaminsäure, die an dem C-Ende gebunden ist. eine Carbonsäuregruppe ist und die andere a-Carbonylgruppe eine Säureamidgruppe darstellt. Daher läßt sich die Struktur von Amastatin Bi wie folgt ermitteln:

H OH H H H

Il I I I

NH,-C C— CONH — C—CONH — C—CONH — C — CONH,

I I I I i

H₃C-CH H CH CH CH,

CH₂ CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ CH₂

CH₃ COOH C₂₂H₄₁N₅O₇

S-Amino^-hydroxy^-methylhexanoyl-L-valyl-L-valyl-L-glutaminsäure-!X-amid

Amastatin B2

Das IR-Spektrum (Fig. 5) weist folgende Absorptionsmaxima auf: 3400,3260,2940,1700,1655,1625,1550, 1450,1400,1315,1225,1150,1090,950 und 700 (cm -'). Es werden die gleichen drei Aminosäuren wie im Falle von Amastatin B, festgestellt. Das NMR-Spektrum (100 MHz in D₂O) (Fig. 10) zeigt Signale bei ό 1,1-1,55,

10

2,1-2,35, 2,37-2.75, 2,8-3,2, 3,8-4,05, 4,45-4,7, 4,75—4,9 und 4,9—5,0. Eine Untersuchung des mit hoher Auflösung ermittelten Massenspektrums (Fig. 15) von N-acetyliertem Amastatin-B2-dimethylester zeigt, daß j die neue N-Acetylaminosäure, zwei Valine sowie Glutaminsäuredimethylester in dieser Reihenfolge durch Amidbindungen gebunden sind. Die pKa-Werte von 3,0 und 4,2 zeigen, daß die zwei Carbonylgruppen von Glutaminsäure Carbonsäuregruppen sind. Die 1» Struktur von Amastatin B: ist folgende:

NH,- C-

OH

-C—CONH—C—CONH—C-CONH — C-COOH

H₃C-CH H
CH,

CH,

CH CH

CH, CH, CH, CH,

C,, H*, N₄ Ο« I
CH,

CH,
COOH

S-Amino^-hydroxy^-methylhexanoyl-L-valyl-L-valyl-L-glutaminsäure

Amastatine enthalten eine Aminogruppe und eine jo Carboxylgruppe in den Fällen Ai und Bi und eine Aminogruppe und zwei Carboxylgruppen in den Fällen A₂, A3 und B₂, wobei diese Gruppen erfindungsgemäß in Salze, Methylester, N-Acetyl- und N-Propionyl-Derivate sowie deren Methylester nach herkömmlichen r. Methoden umgewandelt werden können.

Ein anderes Merkmal der Erfindung besteht in der Schaffung eines Verfahrens zur Gewinnung der Amastatine, das darin besteht, Streptomyces sp. ATCC 31318 oder dessen natürliche oder künstliche Mutanten, in einem geeigneten Medium, das Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen so lange zu züchten, bis erhebliche Mengen an Amastatinen in der Kulturbrühe erzeugt worden sind, und die auf diese Weise erzeugten Amastatine nach 4> herkömmlichen Methoden zu gewinnen.

Der zur Herstellung der Amastatine geeignete Mikroorganismus wurde taxonomisch als Streptomyces sp. ME98-M3 charakterisiert. Er wurde aus einem Boden als Stamm ME98-M3 isoliert und in dem « Fermentation Research Institute, Japan, mit der Hinterlegtingsnummer FERM P-3722 und in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, mit der Hinterlegungsnummer A.T.C.C. 31318 hinterlegt. In Frage kommen auch alle natürlichen und künstlichen Mutanten dieses Stammes. Die morphologischen Eigenschaften sowie die züchtungstechnischen Eigenschaften des Stammes werden nachfolgend angegeben:

60

1. Morphologie

Lufthyphen mit gekrümmten oder schlaufenförmigen Enden erstrecken sich von verzweigten Substrathyphen. Die reife Sporenkette weist 10 oder mehr Sporen auf, die eine Abmessung von 0,6 bis 0,8 χ 1,0 bis 1,2 μ besitzen und glatte Oberflächen aufweisen.

2. Wachsen auf verschiedenen Medien

Die Angaben in Klammern entsprechen dem Farbstandard »Color Harmony Manual«, veröffentlicht von der Container Corporation of America, USA.

a) Rohrzucker-Nitrat-Agar

Vegetatives Wachstum: Dunkelgelb (3 mc Amber). Kein lösliches Pigment.

Luftmyzeln: Weiß (a. White) bis hellgelblich braun (l'/2gc, Dusty Yellow).

b) Glucoseasparagin-Agar

Vegetatives Wachstum: Gelblichbraun (3ne, Topaz, Butterscotch). Kein lösliches Pigment.
Luftmyzeln: Leicht grau (3fe, Silver gray).

c) Glycerinasparagin-Agar (ISP Medium Nr. 5)
Vegetatives Wachstum: Gelblich braun (3ne, Topaz Butterscotch). Kein lösliches Pigment.
Luftmyzeln: Leicht grau (3fe, Silver gray).

d) Agar aus Stärke und anorganischen Salzen (ISP Medium Nr. 4)

Vegetatives Wachstum: Dunkelgelb, (2ne, Mustard Gold) bis hellgelb (2ne, Old Gold). Kein lösliches Pigment.

Luftmyzeln: Gelblichgrau (2ea, Lt. Wheat to Ll Maze).

e) Tyrosin-Agar (ISP Medium Nr. 7)

Vegetatives Wachstum: Gräulichgelbbraun (3ni, Clove Brown). Kein lösliches Pigment.
Luftmyzeln: Gräulichweiß (b, Oyster White) bis gelblichgrau (2ca, Lt. Ivory).

f) Nährmittel-Agar

Vegetatives Wachstum: Hellgelblichbraun (3pe, Amber Topaz). Kein lösliches Pigment.
Luftmyzeln: Keine.

g) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP Medium Nr. 2) Vegetatives Wachstum: Dunkelgelblichorange (3pg, Golden Brown). Kein lösliches Pigment
Luftmyzeln: Weiß (a. White).

h) Weizenmehl-Agar (ISP Medium Nr. 3)

Vegetatives Wachstum: Dunkelgelb (2nc, Brite Goid to Nugget Gold). Kein lösliches Pigment
Luftmyzeln: Gelblichgrau (2ca, Ll Ivory).

i) Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP Medium Nr. 6)

Vegetatives Wachstum: Farblos bis hellgelblichbraun (2ga, Colonial Yellow, Maize). Kein lösliches Pigment.
Luftmyzeln: Keine

j) Calciummalat-Agar

Vegetatives Wachstum: Farblos bis hellgelb (1 '/21a. Sunlight Yellow, Daffodil, Forsythia Jonquil). Kein lösliches Pigment.
Luftmyzeln: Weiß (a. White).

Alle vorstehenden Beobachtungen wurden nach einer Inkubation bei 27°C durchgeführt.

Physiologische Eigenschaften

a) Wachstumstemperatur: Die optimale Temperatur für das Wachstum beträgt 24 bis 30⁰C auf Maltose-Hefeextrakt-Agar (Maltose 10,0 g, Hefeextrakt 4,0 g, Agar 17,0 g und entionisiertes Wasser 1000 ml, pH 7,0). Kein Wachstum unterhalb 15° C so wie oberhalb 45° C

b) Gelatineverflüssigung auf einem Glukose-Pepton-Gelatine-Medium bei 27° C: Eine Verflüssigung beginnt nach 5tägiger Inkubation und ist nach 21 Tagen beendet Schwache Verflüssigung.

c) Stärkehydrolyse auf einem Agar aus Stärke und anorganischen Salzen (ISP Medium Nr. 4) bei 27°C: Es beginnt eine sehr schwache Hydrolyse nach ungefähr 5tägiger Inkubation.

d) Peptonisierung und Koaguliening von Magermilch bei 37° C: Die Koaguliening ist nach 4tägiger Inkubation beendet worauf eine mäßige Peptonisierung beginnt

e) Melaninbildung auf einer Trypton-Hefeextrakt-Brühe (ISP Medium Nr. 1), einem Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar (ISP Medium Nr. 6) und einem Tyrosinagar (ISP Medium Nr. 7) bei 27°C: Negativ auf allen Medien.

f) Verbrauch von Kohlehydraten eines Pridham-Gottlieb-Agar bei 27° C: L-Arabinose, Xylose, Glukose, D-Fructose, Rohrzucker, Inosit und Raffinose: Gutes Wachstum; L-Rhamnose und Cellulose: Kein Wachstum.

g) Verflüssigung von Calciummalat auf einem Calciummalat-Agar bei 27° C: Negativ.

Auf der Grundlage der vorstehend beschriebenen Eigenschaften wird der Stamm ME 98-M3 als zu den genus Streptomyces gehörend identifiziert und als Streptomyces sp. ME 98-M3 bezeichnet

Amastatine können durch Züchten des Mikroorganismus auf einem geeigneten Medium sowie unter geeigneten Bedingungen erhalten werden. Die zum Züchten der erfindungsgemäßen Mikroorganismen eingesetzten Medien sind die Nährmedien, die zum Züchten von Schimmelpilzen (actinomycetes) als geeignet bekannt sind. Als Kohlenstoffquelle kann man beliebige Kohlenhydrate verwenden, wie sie normalerweise für die Fermentation eingesetzt werden, wie beispielsweise Glycerin, Glukose, Stärke, Dextrin, Lactose, Rohrzucker, Maltose, Melassen sowie Fett Der Stickstoff kann von jedem beliebigen der bekannten Materialien, die in herkömmlicher Weise eingesetzt werden, geliefert werden, beispielsweise von Pepton, Fleischextrakt Maisflüssigkeit, Baumwollsamenmehl, Nußmehl, Sojabohnenmehl, Hefeextrakt, Casaminosäure, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat sowie Ammoniumsulfat. Die Medien können Natriumchlorid, Phosphatsalze, Kalziumcarbonat sowie Magnesiumsulfat als anorganische Nährmittel enthalten. Andere Metallsalze können ebenfalls als Spurenelemente, falls erforderlich, zugesetzt werden. Das Züchten oder die Fermentierung können nach jeder aeroben Züchtungsmethode durchgeführt werden, beispielsweise durch Schütteln einer Kultur in einem Kolben oder als Tank-Fermentor-Kultur. Eine Submerskultur ist zur Herstellung in technischem Maßstabe zu bevorzugen. Die Fermentationstemperatur beträgt 25 bis 35° C. Die Fermentation wird im allgemeinen so lange fortgesetzt, bis eine erhebliche Menge an Amastatinen in der Kulturbrühe erzeugt worden ist.

Die Amastatinerzeugung läßt sich durch Messen der inhibierenden Wirkung auf Aminopeptidase A überprüfen. Die angewendete Überprüfungsmethode ist wie folgt: Die Aminopeptidase-A-Aktivität wird gemäß Nagatsu et al. (1. Nagatsu, T. Nagatsu, T. Yamarnoto und G. G. Glenner, Biochim. Biophys. Acta 198 255 — 70, 1970) mit einer Abänderung wie folgt gemessen: Eine Mischung aus 0,0007m Glutamyl-0-naphthylamid (1,0 ml), 0,01m CaCl₂ (0,2 ml) 0,1m tris-HCl-Puffer (Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan)-Lösung (pH 7,0, 0,6 ml) und einer Probelösung (0,1 ml) wird bei 37° C während einer Zeitspanne von 3 Minuten bebrütet. Eine Aminopeptidase-A-Lösung (0,1 ml, hergestellt durch Ammoniumsulfatfraktionierung nach der Nagatsu-Methode) wird der Mischung zugesetzt Die Bebrütung bei 37° C wird während einer Zeitspanne von weiteren 30 Minuten fortgesetzt, worauf eine 1,0 m Acetatpufferlösung mit einem pH von 4,2 (0,6 ml), die 0,1% Fast Garnet-GBC-Salz (o-Aminoazotoluoldiazoniumsalz) und 10% Tween 20 enthält, zugesetzt wird. Nach 15 Minuten wird bei Zimmertemperatur das Absorptionsvermögen (a) der Mischung bei 530 nm gemessen. Eine Mischung ohne Probe wird ebenfalls in der gleichen Weise als Vergleichsprobe (b) behandelt. Eine Inhibierungsrate (%) von Aminopeptidase A wird aus folgender Gleichung berechnet:

b-a

χ 100

Die Konzentrationen, die für 50% der Inhibierungsrate (ID50) bei dieser Untersuchung erforderlich sind, betragen 0,65 mcg/ml in Amastatin Ai, 0,54 mcg/ml in A2,1,0 mcg/ml in A3,1,5 mcg/ml in Bi bzw. 1,0 mcg/ml in B₂.

Beispielsweise wird ein Medium, das 2% Glycerin, 2% Dexirose, i% Bactosoyton (Difco), 0,3% Hefeextrakt, 0,2% (NH₄);-SO* und 02% CaCO₃ bei einem pH von 7,4 enthält, in einem Autoklaven behandelt und mit Sporen und/oder Myzeln beimpft, die von einer Schrägkultur von Streptomyces sp. ME98-M3 erhalten worden sind. Alle Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht pro Volumen, sofern nichts anderes angegeben ist Eine Anreicherung von Amastatinen wird nach 3 bis 7 Tage dauerndem aeroben Züchten unter Schütteln bei 27°C festgestellt.

Die Tabelle 11 zeigt die Herstellung von Amastatinen in Schüttelkulturen mit verschiedenen Medien. Die Fermentation wird unter Einsatz von 100 ml des Mediums in einem 500-ml-Kolben auf einem Rotationsschüttler (180 Upm) bei 29°C durchgeführt. 0,5 ml der Brühe werden zur Untersuchung als Probe entnommen.

14

Tabelle II

Amastatinerzeugung in verschiedenen Kulturmedien

Zusammensetzung
des Mediums

Anfangs- Amastatinerzeugung
pH

Inhibierung (%)

2

1.	Stärke	1,0
	Glukose	1,0
	Sojabohnenmehl	2,0
	Hefeextrakt	0,5
2.	Sojabohnenöl	2,0
	Stärke	0,5
	Glukose	0,5
	Sojabohnenmehl	2,5
3.	Glycerin	2,5
	Fleischextrakt	0,5
	Polypepton	0,5
4.	Maltose	2,0
	Fleischextrakt	0,5
	Polypepton	0,5
	Hefeextrakt	0,3
5.	Stärke	2,0
	Glukose	1,0
	Hefeextrakt	0,5
	Casaminosäure	0,5
6.	Lactose	2,5
	Hefeextrakt	0,5
	Fleischextrakt	0,5
	Polypepton	0.75
7.	Rohrzucker	4,0
	Proteinhydrolysat	2,5
8.	Glycerin	2,0
	Dextrin	2,0
	Soypeptone*)	1,0
	Hefeextrakt	0,3
9.	Stärke	2,0
	Baumwollsamenmehl	2,0
	Maisflüssigkeit	1,0
10.	Glycerin	3,0
	Fischmehl	2,0

6,7

7,1

7,0

7,8

7,1 26,2 31,6 35,3

7,8

7,9

6,9 40,0 52,7 52,7

7,1 38,5 45,7 47,5

7,2

*) Soypeptone ist ein enzymatisches Verarbeitungsprodukt von Sojabohnenmchl.

33,5

50,2

40,3

31,5
26,9

23,2
17,6

46,2
26,0

22,2
49,1

48,3
19,5

End-PH

Die Tabelle III zeigt auch die Amastatinerzeugung in verschiedenen Medien. Die in der Tabelle angegebenen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen werden einem Grundmedium zugesetzt, das 0,1% Hefeextrakt, 0,1% NaCI, 0,05% K₂HPO₄ und 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O enthält. Die Fermentation wird mit einem 50-ml-Medium in einem 500-ml-Kolben auf einem Rotationsschüttler (200 UpM) bei 28°C durchgeführt. Die inhibierende Aktivität wird mit 0,02 ml der Brühe ermittelt.

Tabelle HI

Amastatinproduktion in verschiedenen Medien

Nr.	Zusammensetzung	Jes Mediums (%)	StickstoiTquelle	2,0	Amastatinproduktion	Inhibierung
	KohlenstofTquelle			2,0	nach 4tägiger Bebrütung	18,0
			Sojabohnenmehl	4,0	PH	23,0
A	Stärke	3,0	Trockene Hefe	2,0	6,7	41,3
B		3,0		4,0	6,1	25,9
C		6,0	Baumwollsamenmehl	2,0	6,8	58,6
D		3,0		2,0	6,5	15,2
E		6,0	Sojabohnenmehl	2,0	6,5	16,0
F	Glycerin	3,0	Trockene Hefe	2,0	8,4	17,1
G		3,0	Baumwollsamenmehl	4,0	8,2	43,1
H		3,0	Sojabohnenmehl	2,0	8,3	55,1
I	Sojabohnenöl	3,0		4,0	7,4	36,6
J		6,0	Trockene Hefe	2,0	6,8	46,1
K		3,0		4,0	7,4	30,4
L		6,0	Baumwollsamenmehl		6,9	57,1
M		3,0	Trockene Hefe	4,0	6,4
N	Stärke	4,5		4,0 0,2	6,4	61,8
	Sojabohnenmehl	1,5	Baumwollsamenmehl	Essigsäure oder		64,3
O			Baumwollsamenmehl	6,5	Pyridin, extrahiert wird. Bei
P	Stärke	6,0	Ajinomoto .. £«·_	6,0
	Sojabohnenmehl:	»Es-san meat«,

Co.

Baumwollsamenmehl: »Pharmamedia«, Traders Oil Mill Co.

Diese Ergebnisse zeigen, daß die Amasta'snerzeugung in Abhängigkeit von dem Medium und der Bebrütungszeit schwankt. Bevorzugte Bestandteile des Mediums für die Amastatinerzeugung sind Glycerin, Glukose, Stärke, Sojabohnenöl, Soypeptone, Baumwollsamenmehl, Maisflüssigkeit, Sojabohnenmehl, Hefe, Casaminosäure sowie Ammoniumsulfat.

Gefäß- und Tankfermentatoren ermöglichen ebenfalls eine gute Erzeugung von Amastatin. Beispielsweise wurde eine Submerskultur in einem Tank unter Einsatz von 1001 des Mediums P gemäß Tabelle III in einem 200-1-Fermentator gezüchtet. Nach 96stündiger Bebrütung mit einer Belüftung von 100 l/Minute und einem Rühren mit 200 UpM wurde die größte Amastatinmenge erhalten. 0,1 ml der Brühe ergaben zu diesem Zeitpunkt eine 50%ige Inhibierung bei der Durchführung der vorstehend beschriebenen Untersuchungsmethode. Die Amastatine Ai, A2, A3, B| und B₂ werden gewöhnlich gleichzeitig in der Fermentationsbrühe erzeugt. Die Menge eines jeden Amastatins in der Brühe hängt von dem Mikroorganismenstamm, dem Medium, den Züchtungsbedingungen ab.

Auf diese Weise in der Fermentationsbrühe erzeugte Amastatine können nach jeder Methode gewonnen werden, die zur Isolierung und Reinigung von Peptiden angewendet wird und an sich bekannt ist. Für eine Isolierung in kleinem Maßstabe wird das Brühenfiltrat im Vakuum zur Trockne eingedampft, worauf der Rückstand mit einem Lösungsmittel, welches Peptide aufzulösen vermag, wie Methanol, Äthanol, Dimethyl-

ne aus dem 3rühenfiltrat mit einem Lösungsmittel extrahiert, das Peptide aufzulösen vermag und mit Wasser nicht mischbar ist, wie beispielsweise n-Butanol. Ein Konzentrieren der Extrakte liefert rohe Amastatinpulver.

Amastatine lassen sich in zufriedenstellender Weise durch Adsorption an einem herkömmlichen Adsorbens, wie Aktivkohle, einem organischen Adsorbens, wie Amberlite ® XAD-4 sowie Cellulose, Ionenaustauschern oder Kieselgel, isolieren. Beispielsweise wurde Aktivkohle dem Brühenfiltrat (2%) zur Adsorption der Peptide zugesetzt. Die Aktivkohle wurde abfiltriert und dann mit Wasser und anschließend zweimal mit 20 bis 25 Volumina Methanol mit 40⁰C gewaschen. Mehr als 70% Amastatin in der Brühe werden durch die Methanoleluierung erhalten. Gleichzeitig erzeugte Amastatinanaloga wurden auf diese Weise als Rohpulver aus ihren Mischungen isoliert. Jedes Amastatinanalogon kann in wirksamer Weise durch Chromatographie fraktioniert und gereinigt werden. Für diesen Zweck wird Cellulose mit einer Mischung aus Äthylacetat, Äthanol und Ammoniak (17 : 2 :1) als bevorzugtes Lösungsmittelsystem verwendet. Die Isolierung und Reinigung von Amastatinen sind auch unter Einsatz von Ionenaustauscherharzen mit sauren und basischen funktionellen Gruppen möglich. Stark basische oder stark saure Ionenaustauscherharze werden bevorzugt.

Die Erfindung sieht ferner ein Verfahren zur Herstellung von Amastatinderivaten vor. Metallsalze von Amastatinen lassen sich leicht durch Neutralisation erhalten. Eine andere Salzform von Amastatin wird durch Kristallisation nach Zugabe von anorganischer Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, erhalten, da Amasta-

tine eine freie Aminogruppe aufweisen. N-Acetyl- und N-Propionyl-Derivate lassen sich durch die Behandlung mit einem Anhydrid oder Halogenid der Essigsäure oder Propionsäure unter geeigneten Bedingungen erhalten. Amastatine A₂, A₃ und B₂ (22 mg, 20 mg bzw. 20 mg) wurden in Wasser aufgelöst Acetylchlorid wurde der Lösung bei einem pH von 8,5 zugesetzt, um die freie Aminogruppe zu acetylieren. Die N-Acetylamastatine A₂, A3 und B₂ wurden in Ausbeuten von 13 mg, 11 mg bzw. 10 mg erhalten. Die NMR- und IR-Spektren bestätigten, daß die Produkte N-acetylierte Amastatine sind. N-Acetylamastatin-Dimethylester können wie folgt hergestellt werden:

Zu N-Acetylamastatinen A₂, A₃ und B₅ (9 mg, 8 mg bzw. 8 mg) wurde eine Mischung aus 0,5 ml Thionylchlorid und 4 ml Methanol in einem Eisbad zugesetzt Die Reaktionsmischung wurde in dem Eis während einer Zeitspanne von 30 Minuten und dann bei Zimmertemperatur über Nacht gehalten. Ein Eindampfen· im Vakuum zur Trockne ergab N-Acetylamastatindimethylester (10 mg von A₂,9 mg von A₃ bzw. 9 mg von B₂). Die NMR- und Massenspektren bestätigten, daß die Produkte die Dimethylester von N-Acetylamastatin Ai, A₃ bzw. B₂ sind.

Die erfindungsgemäßen Amastatine besitzen eine starke inhibierende Aktivität auf Aminopeptidase A, wie vorstehend bereits dargelegt worden ist. Die Inhibierungsaktivität gegenüber Aminopeptidase A ist so spezifisch, daß andere Aminopeptidasen, wie Aminopeptidase B, nicht durch die Amastatine inhibiert werden. Die Tabelle IV zeigt IDso-Werte von Amastatinen im Falle von Aminopeptidase A und B.

Tabelle IV

Inhibierung von Aminopeptidase A und B durch Amastatine

Amastatine	ID₅₀ (mcg/ml)	Aminopeptidase B
	Aminopeptidase A	>100
A,	0,65	>100
A₂	0,54	>100
A₃	1,0	>100
B,	1,5	>100
B₂	1,0

Aminopeptidase A wird bei einer Konzentration von 0,5 bis 1,5 mcg/ml inhibiert, während Aminopeptidase B sogar in Gegenwart von 100 mcg/ml Amastatin nicht beeinflußt wird.

Zusätzlich zu der Inhibierungsaktivität zeigen die neuen Tetrapeptide gemäß vorliegender Erfindung eine Stimulierung humoraler Antikörperbildung.

Mäuse (dd/Y) werden durch intravenöse Injektion von 10⁸ roten Schafblutzellen (SRBC) immunisiert. Amastatine in Salzlösung werden intraperitoneal oder oral an die Mäuse verabreicht. 4 Tage danach wird die Anzahl der Plättchenbildungszellen (PFC) in der Milz nach der homolytischen Plättchenmethode von Jerne (N. K. Jerne, A. A. Nordin und C. Henry: The agar plaque technique for recognizing antibody-producing cells, Cellbond Antibodies. B. Amos und H. Koprowskied, Seiten 109-122, Wister Institute Press, Philadelphia. 1963; N. K. (erne und A. A. Nordine, Plaque Formation

in Agar by Single Antibody-Producing Cells, Science, 140, Seite 405,1963) ermittelt

Wie aus der Tabelle V hervorgeht, führt die intraperitoneale Injektion von 1 bis 1000 mcg/Maus oder die orale Verabreichung von 10 bis 1000 mcg/Maus an Amastatin A₂ zu einer Erhöhung der Zahl der nlättchenbildenden Zellen (PFC) um das ungefähr Zweioder Dreifache im Vergleich zu der Anzahl an PFC in dem Antigen allein.

Tabelle V

Wirkung von Amastatin auf die Antikörperbildung zu SRBC (I) in Mäusen

Amastatin A₂ Amastatin, verabreicht
Dosis/Maus*) i. p. oral

PFC/Milz

10^s SRBC
10^s SRBC
10⁸ SRBC
10⁸ SRBC
10⁸ SRBC

1000 ag
100
10
1

149 000
235 000
283 000
504 000
264 800

125 000
153 000
192 800
286 400
102 700

*) i. p. injiziert zum Zeitpunkt der Immunisation.

Nachdem Amastatin A₂ intraperitoneal einmal pro Tag während einer Zeitspanne von 4 Tagen in Mäuse injiziert worden ist, werden die Mäuse durch intravenöse Injektion von 10⁸ SRBC immunisiert. Vier Tage nach der Immunisation wird die Anzahl der antikörperbildenden Zellen in der Milz der Maus ermittelt Dabei wird festgestellt, daß die intraperitoneale Injektion von 100 bis 1000 mcg/Maus/Tag an Amastatin A₂ die Anzahl der PFC um ungefähr das 2- oder 3fache im Vergleich zu der Anzahl von PFC in dem Antigen allein erhöht.

Tabelle VI

Wirkung von Amastatin auf die Antikörperbildung
zu SRBC (II) in Mäusen

Dosis in
;xg/Maus*)

SRBC")

PFC/Milz

*) Tage -4 ~
**) TagO, Lv.

10^s SRBC
10^l! SRBC
10⁸ SRBC
10^l! SRBC
10^s SRBC

76 000
121000
138 000
196 000

58 000

-1, i.p.

Die Wirkung von Amastatin auf die primäre Antikörperbildung gegenüber SRBC in dissoziierten Milzzellenkulturen wird nach den Methoden von Mishell und Dutton untersucht. Alle Milzkulturen (1,5 χ 10⁷) werden aus den Milzen von CDF_rMäusen präpariert und mit 10⁶ SRBC als Antigen während einer Zeitspanne von 4 Tagen bei 37°C in einer 7%igen CO₂-Atmosphäre gezüchtet. Amastatin wird in dem Medium aufgelöst. Jede Amastatinkonzentration zwi-

sehen 0,0001 μg und 1 μg pro Kultur wird zum Zeitpunkt der Immunisation (Stunde 0) sowie 24, 48 oder 72 Stunden nach dem Start der Kulturen zugesetzt Vier Tage nach dem Start der Kulturen wird die Antikörperbildung einer jeden Kultur durch Zählen der PFC unter Anwendung der von Cuningham et a^!- beschriebenen

Tabelle VII

Methode ermittelt.

Wie aus der Tabelle VII hervorgeht, hat die Zugabe von 0,01 bis 1 μg Amastatin A₂ zu Milzzellenkulturen 0 oder 24 Stunden nach dem Start der Kulturen eine Erhöhung der PFC-Anzahl zur Folge.

Amastatin Zugabe von Amastatin, Stunden nach dem Start der iCultur 24 48

10⁶ SRBC	0	2920	-	-
10⁶ SRBC	1	4420	3100	2280
10⁶ SRBC	0,01	4200	2960	2380
10⁶ SRBC	0,0001	2900	3080	2940

Ferner erhöht Amastatin die Einstellung einer verzögerten Hypersensitivität (DTH) gegenüber SRBC. Weibliche dd/Y-Mäuse werden durch Injektion von 10⁸ SRBC in 0,05 ml einer Salzlösung in die rechte hintere Pfote immunisiert Vier Tage danach wird die Reaktion durch Injektion von 10⁸ SRBC in die linke hintere Pfote ausgelöst und die Zunahme der Dicke der linken hinteren Pfote 24 Stunden später gemessen.

Amastatin A2 wird intraperitoneai einmal pro Tag in Mäuse während einer Zeitspanne von vier Tagen vor der Immunisation durch 10⁸ SRBC injiziert Wie aus der Tabelle VIII hervorgeht, erhöht Amastatin A2 in einer Menge von 0,1 bis 10 mcg/Maus/Tag das Ansprechen der Pfote, die Injektion von 100 mcg/Maus/Tag zeigt jedoch keine Wirkung bezüglich des Ansprechens der Pfote. Eine intraperitoneale Injektion von 1 bis 1000 mcg/Maus an Amastatin A2 zum Zeitpunkt der Immunisation erhöht ebenfalls nicht das Ansprechen der Pfote.

Tabelle VIII

Einfluß von Amastatin auf die Einstellung einer verzögerten Hypersensitivität gegenüber SRBC in Mäusen

Dosis in

Amastatin, injiziert an den Tagen oder am Tag

-4~-l 0*)

0,1

Zunahme der Pfotendicke

10.2 9,0 8,1

10.0 7,8

14.3 8,1

14.1 8,4 13,8

*) Zum Zeitpunkt der Immunisation.

Die Tatsache, daß Amastatine, die Antikörperbildung erhöhen und eine verzögerte · "vpersensitivität ermöglichen, zeigt, daß die Peptide zur Potenzierung des Wirtsabwehrsystems gegenüber bakteriellen und viralen Infektionen sowie gegenüber Krebs verwendet werden können. Aminopeptidase A ist eine der Angiotensinasen. Eine starke Inhibierung der Enzymaktivität verursacht eine Inhibierung der Angiotensin-II-Zersetzung zur Aufrechterhaltung einer bestimmten Konzentration an Angiotensin sowie zur Erhöhung des Blutdrucks. Amastatine lassen sich möglicherweise für diesen Zweck auch zur Potenzierung der Aldosteronaktivität einsetzen.

Die erfindungsgemäßen Amastatine besitzen eine sehr niedrige Toxizität. Herkömmliche Aminopeptidase-A-Inhibitoren sind stark toxische Substanzen, bei-

3(i spielsweise Metallchelierungsmittel, wie Äthylendiamintetraessigsäure oder o-Phenanthrolin oder Protein-modifizierende Mittel. Amastatine zeigen eine inhibierende Wirkung bei niedrigen Konzentrationen und sind wesentlich weniger toxisch als die herkömmli-

Ji chen Inhibitoren. In der Tabelle IX ist die akute Toxizität von Amastatin in Mäusen bei einer intraperitonealen Verabreichung angegeben.

Tabelle IX

Toxizität von Amastatinen

55

Amastatine

Dosis
(mg/kg, i.p.)

Toxizität

A₁

A;

A₃ Bi
B₂

125
125
125
125
125

keine keine keine keine keine

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die zur Durchführung dieser Beispiele eingesetzten Chromatographiemittel bzw. Gelbfiltrationsmittel lassen sich wie folgt definieren:

Amberlite® XAD ist ein Warenzeichen für ein makroretikulares vernetztes Styrolpolymeres.

Dowex® 50 ist ein Warenzeichen für eine Polystyrolkernsulfonsäure.

In DEAE-Sephadex® (Warenzeichen) steht DEAE für Diäthylaminoäthylzellulose, während Sephadex® ein vv.rnetztes Dextrangel darstellt

Dowex® 1 ist ein Warenzeichen für ein synthetisches stark basisches Anionenaustauscherharz.

Beispiel 1

Ein Medium (1001), das 6,0% lösliche Stärke, 4,0% Baumwollsamenmehl, 0,2% (NH₄J₂SO₄, 0,1% Hefeextrakt, 0,2% CaCO₃, 0,05% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄-7 H₂U, 0,1% NaCl und 0,01% eines Antischaummittel:, enthält, wird in einem Fermentationsgefäß aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 200 I bei 120⁰C während einer Zeitspanne von 30 Minuten sterilisiert und mit einer Saatkultur (5 I) von Streptomyces sp. ME98-M3 (FERM P-3722), hergestellt unter Verwendung des gleichen Mediums durch Züchten in einem Kolben, beimpft. Eine Submerskultur wird bei 27° C während einer Zeitspanne von 96 Stunden bei einer Belüftung von 200 1/Minutc und bei π 200 UpM durchgeführt Aus zwei Chargen, die bei der Fermentation anfallen, werden 200 1 einer filtrierten Brühe erhalten.

Das Filtrat mit einem IDso-Wert von 0,1 ml wird auf eine 3-1-Säule, die mit Amberlite® XAD(-4) gefüllt ist, aufgebracht. Amastatine werden mit 301 50%igen Methanols eluiert. Die Konzentrierung des Eluats im Vakuum bei 6O⁰C liefert ein rohes Amastatinpulver in einer Menge von 390 g. Der IDso-Wert des Pulvers beträgt 250 mcg/ml.

390 g des Pulvers werden in 3,9 1 Wasser aufgelöst, wobei der pH auf 8,2 mit 1 η NaOH eingestellt wird. Die Lösung wird auf eine mit Dowex® 1 (X 4) gefüllte Säule aufgebracht (Acetat-Form; 3,5 1). Die Eluierung mit 10 1 einer 0,1 η Essigsäure ergibt nach einem Waschen mit 101 Wasser 110 g des aktiven Pulvers (ID50 = 100 mcg/ml). Dieses Pulver wird in 1,1 10,3 m Pyridin/Essigsäure-Pufferlösung (pH 6,0) aufgelöst und auf eine mit DEAE-Sephadex® A25 gefüllte Säule (600 ml), die zuvor mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist, aufgebracht Ein durch Eluierung mit dem gleichen Puffer erhaltener aktiver Peak wird im Vakuum konzentriert wobei man 30,6 g des aktiven Pulvers (ID50 = 40 mcg/ml) erhält.

Eine Lösung des aktiven Pulvers in 400 ml 0,05 m Pyridin/Ameisensäure-Pufferlösung (pH 2,9) wird auf eine mit Dowex® 50 (X4) gefüllte Säule (310 ml), die zuvor mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist aufgebracht Ein aktiver Peak wird durch die Eluierung mit einer Pyridin/Ameisensäure-Pufferlösung (2 1) mit einem linearen Gradienten von 0,05 m, pH 2,9, bis 0,2 m, pH 3,1, erhalten. Die Konzentrierung des Peaks im Vakuum ergibt 5,1 g des aktiven Pulvers (I D_w = 8,5 mcg/ml).

Das Pulver wird weiter durch Kieselgelchromatographie mit einem Lösur.gsir.itte'.system aus r.-Buty!acetat n-Butanol, Essigsäure und Wasser (12 :4 :1 :1) gereinigt 0,8 g eines hochaktiven Pulvers werden erhalten (ID50 = 2,5 mcg/ml). Zur Fraktionierung des aktiven Pulvers zur Gewinnung eines jeden Amastatinanalogons wird die vorstehend beschriebene Dowex® 50-Säulenchromatographie erneut durchgeführt Amastatine A₂, A₃ und B₂ werden voneinander durch die Rechromatographie abgetrennt. Jedes durch Konzentrieren der aktiven Fraktion erhaltene Pulver wird durch Adsorption an Dovex® 50 (X4) (H+-Typ) sowie durch Eluierung mit 0,2 η NH₄OH entsalzt Die nachfolgend angegebenen im wesentlichen reinen Amastatine werden erhalten:

A₂: 30 mg (ID50 0,54 mcg/ml)
A₃: 47 mg (ID501,0 mcg/ml) und
B₂: 20 mg (ID501,0 mcg/ml)

Diese Präparate besitzen die vorstehend erwähnten physikalisch-chemischen Eigenschaften.

Beispiel 2

Ein Medium (125 ml), das 2% Kartoffelstärke, 2% Baumwollsamenmehl, 1% Maisflüssigkeit und 0,32% CaCO₃ enthält, wird in einem 50-ml-Kolben bei 120⁰C während einer Zeitspanne von 20 Minuten sterilisiert, mit Streptomyces sp. ME98-M3 (FERM P-3722) beimpft und bei 27°C unter Hin- und Herschütteln mit 130 UpM während einer Zeitspanne von 2 Tagen bebrütet. Diese Kultur wird als Impfmaterial verwendet.

Ein Medium (15 1), das 2% Glycerin, 2% Dextrin, 1% Bactosoytone (Difco Co.), 03% Hefeextrakt, 0,2% (NH₄J₂SO₄ und 0,2% CaCO₃ enthält, wird in einem 30-1-Fermentationsgefäß sterilisiert, mit 1 1 der Impfkultur, die in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellt worden ist, beimpft und bei einer Belüftung von 15 l/Minute sowie unter Rühren (200 UpM) bei 27°C während einer Zeitspanne von 4 Tagen bebrütet. Ein Brühenfiltrat (501) mit einem IDso-Wert von 0,14 ml wird aus vier Chargen der Kultur erhalten.

Das Filtrat wird nach im wesentlichen der in Beispiel 1 beschriebenen Methode gereinigt Die Rechromatographie des aktiven Pulvers, das durch die Silikagelbehandlung und durch die Entsalzung durch Dowex® 50 erhalten worden ist, liefert 25 mg im wesentlichen reines Amastatin Ai (ID50 = 0,65 mcg/ml) und 35 mg im wesentlichen reines Amastatin Bi (ID50 = 1,50 mcg/ml). Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Präparate stimmen gut mit den vorstehend erwähnten Eigenschaften überein.

Beispiel 3

3 mg Amastatin Ai wird in 0,5 ml 0,1 η HCl aufgelöst und bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 1 Stunde stehengelassen. Die Konzentrierung der Lösung im Vakuum sowie das Abdampfen der überschüssigen Chlorwasserstoffsäure ergibt das Hydrochlorid von Amastatin Ai. Salze anderer Amastatine werden nach der gleichen Methode erhalten. Diese Salze besitzen die folgenden Eigenschaften:

A1 - Hydrochlorid:
F₁
iR-Spektrum

ID₅₀

ArHydrochlorid:
F.
IR-Spektrum

ID₅₀
ArHydrochlorid:

F.
IR-Spektrum

ID₅₀

165-170⁰C

3400,327Ö, 295Ö, i 7 i 0, i 66ö,
1640,1540,1470,1390,1285,
1230,1180,1090 (cm-¹)
0.75 mcg/ml

158-162°C

3300,2950,2600,1725,1660,
1640,1535,1470,1395,1280,
1230,1180,1090, 930(cm-')
0.6 mcg/ml

148—153°C

3250,2930,2600,1710,1650,
1635,1530,1465,1390,1220,
1113, 930(Cm-¹)
1.1 mcg/ml

23

Bi-Hydrochlorid:
F.
IR-Spektrum

IDso

Eb-Hydrochlorid:
F.
IR-Spektrum

ID₅,

160-165°C

3400,3270,2950,1710,1655,

1635,1540,1470,1390,1290,

1230,1170,1070(Cm-¹)

1.8mcg/ml

145-150⁰C

3400,3250,2900,1720,1690,

1625,1535,1435,1385,1275,

1220,1175,1155,1105,1085,

1010, 985, 925, 790(cm-')

1.1 mcg/ml

Beispiel 4

mg Amastatin A2 werden in 10 ml Wasser aufgelöst. 0,5 ml Acetylchlorid werden viermal in lOminütigen Intervallen unter Rühren bei Zimmertemperatur und unter Aufrechterhaltung eines pH von 8,5 unter Einsatz von 1 η NaOH zugesetzt. Nach 2 Stunden wird der pH auf 2,0 unter Verwendung von konzentrierter HCl eingestellt, worauf die Mischung mit 20 ml Äthylacetat zweimal extrahiert wird. Die Konzentrierung der Lösungsmittelschicht im Vakuum ergibt 13 mg des Produkts.

F.: 160-164⁰C
ID50: 450 mcg/m!

Das IR- und das NMR-Spektrum bestätigen, das das Produkt aus N-Acetylamastatin A2 besteht.

N-Acetylamastatine Ai, A3, Bi und B2 werden nach der gleichen Methode erhalten.

Beispiel 5

30 mg Amastatin A2 werden in 2 ml absolutem Methanol aufgelöst. Eine Mischung aus 1 ml Thionylchlorid und 2 ml absolutem Methanol wird unter Eiskühlung zugesetzt. Die Mischung wird unter Kühlung während einer Zeitspanne von 30 Minuten und dann bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Die Konzentrierung der Mischung im Vakuum ergibt 31 mg des Reaktionsproduktes.

F.: ID50:

148-153⁰C
17 mcg/ml

Das IR- und das NMR-Spektrum bestätigen, daß das Produkt aus Amastatin-A2-dimethylester besteht.

Dimethylester von Amastatin A3 und B2 werden nach der gleichen Methode erhalten. N-Acetylamastatine A2, A3 und B2 ergeben Dimethylester eines jeweiligen Amastatins unter Anwendung der gleichen Methode.

Monomethylester von Amastatin Ai und Bi werden ebenfalls nach der gleichen Methode erhalten.

Hierzu 1 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

I. Amastatine A₁, A₂, A₃, B₁ und B₂ der allgemeinen Formel CH₃

CH₃ CH₃

CH-CH₃ CH-CH₃

CH-R¹

CH-R²

Η,Ν—CH- CH

COOH