DE2813507B2

DE2813507B2 - Amastatine, Verfahren zu ihrer Gewinnung und diese enthaltende pharmazeutische Zubereitungen

Info

Publication number: DE2813507B2
Application number: DE2813507A
Authority: DE
Inventors: Takaaki Fujisawa Kanagawa Aoyagi; Masa Hoya Tokio Hamada; Tomio Tokio Takeuchi; Hamao Tokio Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1977-07-22
Filing date: 1978-03-29
Publication date: 1980-01-17
Also published as: JPS568829B2; ES468457A1; IT7867722A0; AU3470978A; AU511023B2; FR2398048B1; GB1553656A; IT1108029B; FR2398048A1; DE2813507A1; BE865565A; DE2813507C3; JPS5424845A

Description

CH-CH₃ (CH, )„ O

ι I I I " //

H₂N-CH-CH-C-NH-CH-C — NH—CH—C — NH—CH-C

OH O

in der die Aminosäurereste 2 bis 4 in L-Konfiguration aufweisen und die Bedeutungen wie folgt zuzuordnen sind:

21)

Amastatin

A,	CH₃	H	1	NH,
A,	CH₃	H	1	OH
Aj	CH₃	Il	2	OH
B₁	H	CH₃	2	NII,
B,	H	CH,	2	OH

deren Salze, Methylester, N-Acetyl- und N-Propionyl-Derivate sowie deren Methylester.

2. Verfahren zur Gewinnung der Amastatine gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces sp. ATCC 3Ϊ3Ί8 oder dessen natürliche oder künstliche Mutanten unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium bei 25 bis 35°C in einem pH-Bereich von 6,0 bis 9,5 züchtet, die Amastatine in an sich bekannter Weise aus der Kulturbrühe isoliert und gegebgnenfalls in die in Anspruch 1 genannten Derivate überführt.

3. Pharmazeutische Zubereitungen, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Verbindung gemäß Anspruch 1.

Die Erfindung betrifft als Amabiatine A,, A₂, A_s, B, und B₂ bezeichnete neue Tetrapeptide mit einer physiologischen Wirkung sowie deren Salze, Methylester, N-Acetyl- und N-Propionyl Derivate und deren Methylester. Diese Verbindungen vermögen eine inhibierende Wirkung auf Aminopeptidase A auszuüben und zeigen auch eine Stimulierung einer Antikörperbildung. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren z'ir Gewinnung dieser Verbindungen sowie pharmazeutische Zubereitungen, welche diese neuen Verbindungen enthalten und als Inhibierungsmittel für Aminopeptidase A sowie als Zubereitungen zur Erhöhung der Antikörperbildung eingesetzt werden können.

Einige physiologisch aktive Peptide oder N-acylierte Peptide wurden in Kulturbrühen gefunden. Diese Substanzen, beispielsweise Leupeptin, Antipain, Chymostatin und Pepstatin, inhibieren Trypsin, Papain. Chymotrypsin bzw. Pepsin, alle diese Inhibitoren üben jedoch ihre Wirkung auf Proteasen aus, die in einer Endotypreaktion wirken. Weitere Einzelheiten bezüglich dieser Enzyme findet man in »Enzyme Inhibitors of Microbiai Origin«, Hamao Umezawa, University of r, Tokyo Press (1972) in Kapitel IV, Inhibitors of Proteolytic Enzymes (Seiten 15 bis 52) an den folgenden Stellen:

Peptide

Seiten

Leupeptin
Antipain
Chymostatin
Pepstatin

15 29 32 34

Bestatin, das auch in einer mikroben Kulturbrühe gefunden wurde, inhibiert elin proteolytisches Enzym des Exotyps, d. h., Aminopeptidase B und Leucinaminopeptidase, es übt jedoch keinerlei inhibierende Wirkung cuf Aminopeptidase A aus (J. Antibiotics 29, S. 97 bis 103 und 600 bis 601 und US-PS 40 29 547).

Durch die Erfindung werden Amastatine Ai, A2, Aj, B, und B, der allgemeinen Formel

CH	Λ	-R¹	C	C	H,
CH I	— R²	O	C I	M- CM.,
I CH j	CU		I -Nil- c	H ■ (
11,N CW	(')H

CH, COOH

ι ' I

CH-CH, (CH₂)„ O

NH CH -C -NH-CH -C

O X

in der die Aminosäurereste 2 bis 4 die L-Konfiguration aufweisen und die Bedeutungen wie folgt zuzuordnen sind:

Amaslatin	R¹	R²	Il	X
A,	CH₃	H	I	Nil,
A₁	CH₃	H	1	OH
Ai	CH₃	H	2	OH
B₁	rf	CH₃	2	NH,
B₁	H	CH₃	2	OH

sowie deren Salze, Methylester, N-Acetyl- und N-Propionyl-Derivate sowie deren Methylester zur Verfügunggestellt.

Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung dieser Amastatine, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Streptomyces sp. ATCC 31318 oder dessen natürliche oder künstliche Mutanten unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium bei 25 bis 35°C in einem pH-Bereich von 6,0 bis 9,5 züchtet, die Amastatine in an sich bekannter Weise aus der Kulturbrühe isoliert und gegebenenfalls in die in Anspruch 1 genannten Derivate überführt.

Schließlich betrifft die Erfindung pharmazeutische Zubereitungen, die gekennzeichnet sind, durch eiinen Gehalt an einer der genannten neuen Verbindungen.

Die Erfindung wird durch die Zeichnungen näher erläutert Es zeigt

Fig. 1, 2, 3, 4, 5 die Infrarotabsorptionsspektren in KBr der Amastatine Ai, A₂, Aj, Bi bzw. B₂,

F i g. 6, 7, 8,9 und 10 die NMR-Spektren (100 MHz in D₂O) der Amastatine in der gleichen Reihenfolge wie sie vorstehend angegeben worden ist,

Fig. 11, 12, 13, 14 und 15 die Massenspektren von N-Acetylamastatindimethylestern der Amastatini: in der gleichen Reihenfolge, wie sie vorstehend angegeben worden ist

Die erfindungsgemäßen Amastatine Ai, A₂, A₃, Bi und B₂ sind strukturell miteinander verwandt. Sie weisen folgende ähnliche physikalische Eigenschaften auf: Schmelzpunkte, Elementaranalysenwerte, pKa-We:rte, Rf-Werte bei der Dünnschicht jmatographie sowie Wanderungswerte bei der Durchfüti: ung einer Hochspannungspapierelektrophorese. Diese Eigenschaften sind in der folgenden Tabelle I zusammengefaßt

Tabelle I

Physikalisch/chemische Eigenschaften von Amastatinen

	Amastatine	A 2	A3	Bl	196-200
	Al	202-205	196-200	195-197
F. C	200-203
Elementaranalysewerte					54.31
gefunden, %		53.00	54,30	54,00	7,98
C	53,06	7.91	8,01	8.40	11.21
H	8,32	27.17	11.16	23.02	2<j QQ
O	14,61	11.67	26.10	14.18
N	23,00				54.08
berechne!, %		53.15	54,08	54,19	8,25
C	53,26	8,07	8.25	8.48	11.47
H	8,30	11,81	11,47	22,97	26.20
O	14,79	26.98	26.20	14,36	C^lhnNaO.H
N	23,65	C; ι H-,,NjO,	C₂JH₄₁₁N₄O₈	C₂₂H₄₁N₅O₇	488
für	C₂₁Il₁₁₁N₅O-	474	488	487	3,0
Molekulargewicht	473	2.8	3.0	3.7	0.52
pKa	3,8	0,46	0.54	0,55	0.53
Rf-Wert*)	0,47	0,51	0.53	0.54
Rm-Wert**)	0,52

*) Die Dünnschichtchromatographie wird unter Verwendung einer Kieselgelplatte und eines Lösungsmitlclsysterns aUi n-Butanol, Essigsäure und Wasser (4:1:1) durchgeführt

*°) Relativer Wanderungsabstand in Richtung auf eine Kathode zu Ahnin mit einer Pufferlösung au¹· Ameisensäure. Essigsäure und Wasser (25 : 75 : 900) bei 3500 V während einer Zeitspanne von 15 Minuten.

Die Amastatine Ai, A₂, Aj, B. und B₂ sind in Wasser. Methanol, Essigsäure, Pyridin sowie Dimethylsulfoxid löslich, wenig löslich in n-Propanol und n-Bulanol und praktisch unlöslich in Äthyiacetat, Butylacetat. Diäthyläther η-Hexan, Petroläther, Benzol sowie Chloroform. Sie geben positive Ryclon-Smith , Ninhydrin und

Kaliumpermanganatreaktionen, jedoch negative !ehrlich- und Sakaguchi-Reaklionen. Ks wird keine charakteristische UV-Absorption festgestellt. Die Amastatine sind in neutralen, sauren und alkalischen Lösungen stabil. Die inhibierende Aktivität einer Aminopeptidase A wird nicht durch Erhitzen der wäßrigen Lösung mit einem pH von 2. 7 oder 9 bei 60°C während einer Zeitspanne von 30 Minuten herabgesetzt.

Nachfolgend werden die Strukturen der Amastatine beschrieben, soweit sie bisher aufgeklärt werden konnten.

Amastatin Ai

Das Infrarotabsorptionsspektrum (Fig. I) in Kaliumbromid weist folgende Absorptionspeaks auf: 3 300. 2980, 1710, 1665, 1635, 1550. 1470. !405, 1 355. 1225, 1150.

i\ r^v: - a .

AWIIIIU-M <1UI I. Cl 11 Π IJ H. Ul. 1 Λ (tu ι LIl

Hydrolysat«, der Verbindung in 6 η HCI bei 105 C während einer Zeitspanne von 18 Stunden ergibt Valin. Asparaginsäure sowie eine bisher unbekannte Aminosäure mit einem Molverhällnis von 2:1 : 1. Die neue Aminosäure wurde durch Harzchromatographie isoliert und gereinigt. Ihre Struktur wird durch das NMR-Spek trum, IR-Spektrum, die Elementraranalysc. den pKa-VVert. die Farbreaktionen sowie chemische Reaktionen ermittelt und durch die chemische Synthese als Struktur der folgenden Formel bestätigt:

Il OH

NIL C C COOH (IL 11
(Il

(IL (H,
3- Amino-2-hydro\y-'>-mcthylcapron^<,äurc

Das NMR-Spektrum (100 MHz in D ..O) von Amastatin A₁ (Fig. 6) zeigt Signale bei Λ I.I —1.4. Lb-2.1, 2.2-2.6, 3.0-3.2. 3.85-3.95 und 4.4-4.7. Zur weiteren Charakterisierung wurde das Peptid an dem N-Lnde acetyliert und der Dimcthylester von N-AceivL <i ma μ« im Ai ei ι ie ι iViassenaiiaiyse (r ig. i ι) umerzogen. Das Ergebnis zeigt, daß diese Aminosäuren durch Amidbindungen in der Reihenfolge N-acetylierte neue Aminosäure, L-Valin, L-Valin sowie !.-Asparaginsäure dimethylester. gerechnet von dem N-Endc, gebunden sind. Der vorstehend erwähnte pKa-Wert von 3,8 zeigt, daß die (-Carboxylgruppe der Asparaginsäure an dem C -Ende des Peptids frei ist und die anderen m-Carboxyl gruppen ein Säureamid bilden. Die Struktur von Amasta¹,;! A_; läßt sich daher wie folgt ermitteln:

Il OH Il Il Il

I
NIL C C COMl C CO\H C CONH C (ONH,

ι
CH, H (H ClI (IL

CH CIl, CIL (IL CIL COOH

CH, CU,

3 Amino^hydroxy-S-methylhexanoyl-L-valyl-L-valyl-L-asparaginsäure-a-amid

Amastatin A2

Das IR-Spektrum (KBr) (Fig. 2) zeigt folgende Peaks: 3400, 3250, 3030, 2930, 1700, 1650, 1620, 1530. 1465, i390. 1220. 1160, 1085 und 700 (cm¹). Die Aminosäureanalys: ergibt das gleiche Ergebnis wie im Falle von Amastatin Ai. Die neue Aminosäure wurde ebenfalls als die gleiche Aminosäure wie diejenige von Amastatin A₁ nach den vorstehend beschriebenen Methoden identifizier'.. In dem NMR-Spektrum von Amastatin A; (F i g. 7) wurden die Signale bei Λ 1,2— 1,5. 1.9-2,1. 2.3-2.7, 3,15-3.35. 3,85-4.15 4.5-4,8 und 4,9 — 5.1 beobachtet. Eine massenspektrometrische Analyse mit hoher Auflösung (Fig. 12) von N-Acetylamastatindimethylester zeigt die gleiche Aminosäuresequenz wie im Falle von Amastatin Ai. Die Elementaranalyse sowie die pKa-Werte von 2,8 und 4,0 zeigen jedoch, daß die zwei Carbonylgruppen von Asparaginsäure Carbonsäuregruppen sind. Die Struktur läßt sich wie folgt ermitteln:

H OH H H H

! I I I i

NH,-c C—CONH—C—CONH—C-CONH —C-COOH

I I ; i

CH, H CH CH CH,

CH CH₃ CH₃ CH₃ CH₃ COOH

CH, CH,

3-ATninf>-2-hydr<)xy-5-methylhexatiuy!-l.-valyl-L-valyl-I.-asparaginsäure

Amaslatin Αι

Das IR-Spektriim (KBr) (F-'ig. 3) der Verbindung weist folgende Peaks auf: 3430. 3280, 2950, 1710, 1660, 1630. '540, 1467. 1395. 1225. 1090, 960 und 700 (cm '). Die Arr.'inosaureanalysc des Säurehydrolysats ergibt Valin, Glutaminsäure sowie eine unbekannte Aminosäure Die neue Aminosäure wird als die gleiche Säure wie im I alle von \ und A. identifiziert. Das NMK Spektrum um Am.ist.itin A₁ (I ig. 8) zeigt Signale bei Λ 1.2-1,6. 2,3-2,7. 2,7-3,0, 3,1 -3,4, 3,8-4,4 und 4,4-4,9. Ein mit hoher Auflösung ermitteltes Massenspektrum (Fig. 13) von N-Acetylamastatin-Ai-dimethylester zeigt, daß N-acetylierte neue Aminosäure, Valin, Valin sowie Glutaminsäuredimethylester in der angegebenen Reihenfi)|ge. beginnend von der N-Endgruppe, unter Bildung von Amidbindur.gen gebunden sind. Die pKa-Werte von 3,0 und 4,2 lassen vermuten, daß die <x- und y-Carbenylgruppen der Glutaminsäure Carbonsäuregruppen sind. Aus diesen Ergebnissen läßt sieh die Struktur von Amastatin A , wie folgt ermitteln:

Il <>|| H H H

Ml, C C ( o\|| C COMI C (OMI C COOII

Ul: Il (Il CII (II,

(H CH₁ CH, CH₁ (II, (H,

(II, CII, (■()()(!

J-'\minf)-2-hydri)xy-5-methylhexanoyl-l.-valvl-I. -ν« IyI-1. -glutaminsäure

Amastatin B

In dem IR-Spektrum (F ig. 4) «erden folgende Absorptmnsbandcn ermittelt: 3340. 3000. 1710. 1665, 1640. 1550. 1475. 1405. 1315. 1230. 1 160, 1090. 960 und 700 (cm '). Die Aminosäureanalyse des Säurehydrolv sats von Amastatin B; in 6 η HCl bei 105 C während einer Zeitspanne von 18 Stunden ergibt Valin, Glutaminsäure sowie eine unbekannte Aminosäure in einem Molverhältnis von 2:1:1. Die neue Aminosäure wurde isoliert und gereinigt und durch NMR-Analyse charakterisiert. Die Struktur der Aminosäure wurde durch chemische Synthese wie folgt ermittelt:

Il OH

Ml, C C ( OOII

H₁C (Ή Η

3-Amino-2-hydroxy-4-methylcapronsäure

Das NMR-Spektrum von Amastatin B, (100 MHz in D:O) (Fig. 9) zeigt Signale bei h 0,6-1,0, 1.2-1,55, 1,6-2,3, 2,95-33, 3,8-4,4, 7,4-7,7 und 7,9-8,3. Die Analyse des mit hoher Auflösung ermittelten Massenspektrums (Fig. 14) von N-Acetylamastatin-Bi-dimethylester zeigt, daß N-acetylierte neue Aminosäure. Valin. Valin und Glutaminsäuredimethylester durch Amidbindungen in der erwähnten Sequenz gebunden sind. Durch den pKa-Wert von 3,7 wird die Vermutung nahegelegt, daß die y-Carbonylgruppe der Glutaminsäure, die an dem C-Ende gebunden ist, eine Carbonsäuregruppe ist und die andere a-Carbonylgruppe eine Säureamidgruppe darstellt. Daher läßt sich die Struktur von Amastatin Bi wie folgt ermitteln:

H OH HHH

! 1 I I

NH-C C—CONH—C—CONH—C—CONH—C-CONH-,

I ! ! I I

H₁C-CH H CH CH CH,

CH. CH, CH, CH, CH, CH,

; ι

CH, COOH

C₂₂H₄₁N₅O-

S-Amino^-hydroxy^-methylhijxariuyl-L-valyl-L-valyl-L-glutaminsäure-flc-amid

Amastatin B^

Das IR-Spektrum (Fig. 5) weist folgende Absorptionsmaxima auf: 3400,3260,2940,1700,1655,1625,1550, 1450, 1400, 13'5, 1225. 1150, 1090,950 und 700(cm '). Es werden die gleichen drei Aminosäuren wie im Falle von Amastatin Bi festgestellt. Das NMR-Spektrum (100 MHz in D?O) (Fig. 10) zeigt Signale bei Λ 1,1 — 1,55.

10

2,1-2,35, 2,3, -2,75, 2,8-3,2, 3,8-4,05, 4,45-4,7. 4,75 — 4,9 und 4,9 — 5,0. Eine Untersuchung des mit hoher Auflösung ermittelten Massenspektrums (Fig. 15) von N-acetyliertem Amastatin-B2-dimethylester zeigt, daß

■-) die neue N-Aceiylaminosäiire, zwei Valine sowie Glutaminsäuredimethylester in dieser Reihenfolge durch Amidbindungen gebunden sind. Die pKa-Werte von 3,0 und 4,2 zeigen, daß die zwei Carbonylgruppen von Glutaminsäure Carbonsäuregruppen sind. Die

im Struktur von Amastatin B? ist folgende:

Il oll Il Il Il

I : i

Ml, C C CONII C CONII C CONH C COOH

i ι ^! . i

H₁C CH Il CII CH CW,

CH, CIl, CH, CM., CW, (H,

CH, COOlI

C₂₂H₄₁₁N₄O,

3-Amino-2-hydroxy■4-metrtylhe■xanoyl-L-valyl-L-valyl-L-glutamins;iure

Amastatine enthalten eine Aminogruppe und eine Carboxylgruppe in den Fällen A und Bi und eine Aminogruppe und zwei Carboxylgruppen in den Fällen Ai, Aj und B>, wobei diese Gruppen erfindungsgemäß in Salze, Methylester, N-Acetyl- und N-Propionyl-Derivate sowie deren Methylester nach herkömmlichen Methoden umgewandelt werden können.

Ein anderes Merkmal der Erfindung besteht in der Schaffung eines Verfahrens zur Gewinnung der Amastatine, das darin besteht, Streptomyces sp. ATCC 31318 oder dessen natürliche oder künstliche Mutanten, in einem geeigneten Medium, das Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen so lange zu züchten, bis erhebliche Mengen an Amastatinen in der Kulturbrühe erzeugt worden sind, und die auf diese Weise erzeugten Amastatine nach herkömmlichen Methoden zu gewinnen.

Der zur Herstellung der Amastatine geeignete Mikroorganismus wurde taxonomisch als Streptomyces sp. ME98-M3 charakterisiert. Er wurde aus einem Boden als Stamm ME98-M3 isoliert und in dem Fermentation Research Institute, Japan, mit der Hinterlegungsnummer FERM P-3722 und in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, mit der Hinterlegungsnummer A.T.C.C. 31318 hinterlegt. In Frage kommen auch alte natürlichen und künstlichen Mutanten dieses Stammes. Die morphologischen Eigenschaften sowie die züchtungstechnischen Eigenschaften des Stammes werden nachfolgend angegeben:

I.Morphologie

Lufthyphen mit gekrümmten oder schlaufenförnigen Enden erstrecken sich von verzweigten Substrathyphen. Die reife Sporenkette weist 10 oder mehr Sporen auf, die eine Abmessung von 0,6 bis 0,8 χ 1,0 bis 1,2 μ besitzen und glatte Oberflächen aufweisen.

2. Wachsen auf verschiedenen Medien

Die Angaben in Klammern entsprechen dem Farbstandard »Color Harmony Manual«, veröffentlicht von der Container Corporation of America, USA.

a) Rohrzucker-Nitrat-Agar

Vegetatives Wachstum: Dunkelgclb (3 nie Amber). Kein lösliches Pigment.

Luftmyzeln: Weiß (a, White) bis hellgelblich braun (l'/igc, Dusty Yellow).

b) Glucoseasparagin-Agar

Vegetatives Wachstum: Gelblichbraun (3ne. Topaz, Butterscotch). Kein lösliches Pigment.
Luftmyzeln: Leicht grau (3Fe, Silver grev).

c) Glycerinasparagin-Agar (ISP Medium Nr. 5)
Vegetatives Wachstum: Gelblich braun (3ne, Topaz Butterscotch). Kein lösliches Pigment.
Luftmyzeln: Leicht grau (3fe. Silver gray).

d) Agar aus Stärke und anorganischen Salzen (ISP Medium Nr. 4)

Vegetatives Wachstum: Dunkelgelb. (2ne, Mustard Gold) bis hellgelb (2ne, Old Gold). Kein lösliches Pigment.

Luftmyzeln: Gelblichgrau (2ea, Lt. Wheat to Lt.

Maze).

e) Tyrosin-Agar (ISP Medium Nr. 7)

Vegetatives Wachstum: Gräulichgelbbraun (3ni. Clove Brown). Kein lösliches Pigment.
Luftmyzeln: Gräulichweiß (b, Oyster White) bis gelblichgrau (2ca, Lt. Ivory).

f) Nährmittel-Agar

Vegetatives Wachstum: Hellgelblichbraun (3pe, Amber Topaz). Kein lösliches Pigment.
Luftmyzeln: Keine.

g) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar(ISP Medium Nr. 2) Vegetatives Wachstum: Dunkelgelblichorange (3pg, Golden Brown). Kein lösliches Pigment.
Luftmyzeln: Weiß (a, White).

h) Weizenmehl-Agar (ISP Medium Nr. 3)

Vegetatives Wachstum: Dunkelgelb (2nc, Brite Gold to Nugget Gold). Kein lösliches Pigment.
Luftmyzeln: Gelblichgrau (2ca, Lt. Ivory).

i) Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISF' Medium NrO)

Vegetatives Wachstum: Farblos bis hellgelbüchbraun (2ga, Colonial Yellow, Maize). Keiii lösliches Pigment.

Luftmyzeln: Keine
j) Calciummalat-Agar

Vegetatives Wachstum: Farblos bis hellgelb (1 '/21a, Sunlight Yellow, Daffodil, Forsythia Jonquil). Kein lösliches Pigment.

Luftmyzeln: Weiß(a, White).

Alle vorstehenden Beobachtungen wurden nach einer Inkubation b°i 27" C durchgeführt.

Physiologische Eigenschaften

λ\ Warhctiimctpmnpra tiir· Dip nnlimalp I pmnpraiiir Γ^η

re, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat sowie Ammoniumsulfat. Die Medien können Natriumchlorid, Phosphatsalze, Kaliumcarbonat sowie Magnesiumsulfat als anorganische Nährmittel enthalten. Andere Metallsalze -> können ebenfalls als Spurenelemente, falls erforderlich, zugesetzt werden. Das Züchten oder die Fermentierung können nach jeder aeroben Züchtungsmethode durchgeführt werden, beispielsweise durch Schütteln einet Kultur in einem Kolben oder als Tank-Fermentor-Kultür. Tine SubmcrskuHur ist /ur Herstellung in technischem Maßstabe zu bevorzugen. Die Fermentationstemperatur beträgt 25 bis 35 C. Die Fermentation wird im allgemeinen so lange fortgesetzt, bis eine erhebliche Menge an Amastatinen in der Kulturbrühc , erzeugt worden ist

Die Amastatinerzeugung läßt sich durch Messen der inhibierenden Wirkung au^f Aminopeptidase A überprü-

für das Wachstum beträgt 24 bis 30⁰C auf Maltou.'-Hefeextrakt-Agar (Maltose 10,0 g, Hefeextrakt 4,0 g. Agar 17,0 g und entionisiertes Wasser 1000 ml, pH 7,0). Kein Wachstum unterhalb 15° C sowie oberhalb 45" C.

b) Gelatineverflüssigung auf einem Glukose-Pepton-Gelatine-Medium bei 27 C: Eine Verflüssigung beginnt nach 5tägiger Inkubation und ist nach 21 Tagen beendet. Schwache Verflüssigung.

c) Stärkehydrolyse auf einen Agar aus Stärke und anorganischen Salzen (ISP Medium Nr. 4)bei 27°C: Es beginnt eine sehr schwache Hydrolyse nach ungefähr Stägiger Inkubation.

d) Peptonisierung und Koagulierung von Magermilch bei 37°C: Die Koagulierung ist nach 4tägiger Inkubation beendet, worauf eine mäßige Peptoni- !.ierung beginnt.

e) Melaninbildung auf einer Trypton-Hefcextrakt-Brühe (ISP Medium Nr. I). einem Pepton-1 lefeextrakt-Eisenagar (ISP Medium Nr. 6) und einem Tyrosinagar (ISP Medium Nr. 7) bei 27°C: Negativ auf allen Medien.

f) Verbrauch von Kohlehydraten eines Pridham-Gottlieb-Agar bei 27°C: L-Arabinose, Xylose, Glukose, D-Fructose, Rohrzucker, Inosit und Raffinose: Gutes Wachstum; L-Rhamnose und Cellulose: Kein Wachstum.

g) Verflüssigung von Calciummalat auf einem Calciummalat-Agar bei 27°C: Negativ.

Auf der Grundlage der vorstehend beschriebenen Eigenschaften wird der Stamm ME 9C-M3 als zu den genus Streptomyces gehörend identifiziert und als Streptomyces sp. ME 98-M3 bezeichnet

Amastatine können durch Züchten des Mikroorganismus auf einem geeigneten Medium sowie unter geeigneten Bedingungen erhalten werden. Die zum Züchten der erfindungsgemäßen Mikroorganismen eingesetzten Medien sind die Nährmedien, die zum Züchten von Schimmelpilzen (actinomycetes) als geeignet bekannt sind. Als Kohlenstoffquelle kann man beliebige Kohlenhydrate verwenden, wie sie normalerweise für die Fermentation eingesetzt werden, wie beispielsweise Glycerin, Glukose, Stärke, Dextrin. Lactose, Rohrzucker, Maltose, Melassen sowie Fett Der Stickstoff kann von jedem beliebigen der bekannten Materialien, die in herkömmlicher Weise eingesetzt werden, geliefert werden, beispielsweise von Pepton, Fleischextrakt, Maisflüssigkeit, Baumwollsamenmehl, Nußmehl, Sojabohnenmehl, Hefeextrakt, Casaminosih;

Λ Γ 1V-. "' f

folgt: Die Aminopeptidase-A-AVtivitäi wird gemäß

Ji Nagatsu e; al. (I. Nagatsu, T. Nagatsu, T. Yamamoto und G. G. Glenner, Biochim. Biophys. Ada 198 255-70, 1970) mit einer Abänderung wie folgt gemessen: Eine Mischung aus 0,0007m Glutamyl/i-naphthylamid (1.0 ml), 0,01m CaCI₂ (0,2 ml) 0,1m tris-HCI-Puffer (Tris-(hy-

.--, droxymethyl)-aminomethan)-Lösiing (pH 7,0, 0.6 ml) und einer Probelösung (0,1 ml) wird bei 37C während einer Zeitspanne von 3 Minuten bebrütet. Eine Aminopeptidase-A-Lösung (0,i ml, hergestellt durch Ammoniumsulla'.fraktionierung nach dei Nagatsu-Mcthode) wird der Mischung zugesetzt. Die Bebrütung bei 37"C wird während einer Zeitspanne von weiteren 30 Minuten fortgesetzt, worauf eine 1,0 m Acetatpuffcrlösung mit einem pH von 4.2 (0,6 ml), die 0,1% Fast G ame 1 -G BC-SaIz (o-Aminoazotoluoldiazoniumsalz)

>,\ und 10% Tween 20 enthält, zugesetzt wird. Nach 15 Minuten wird bei Zimmertemperatur das Absorptionsvermögen (a) der Mischung bei 530 nm gemessen. Emc Mischung ohne Probe wrd ebenfalls in der gleichen Weise als Vergleichsprobe (b) behandelt. Eine Inhibie-

■■' rungsraie (%) von Aminopeptidase A wird aus folgender Gleichung berechnet:

KK)

Die Konzentrat-:!·..· lie für 50% der Inhibierungsrate (IDs») bei diese: ; itersuchung erforderlich sind. betragen 0,65 πκ>- ml in Amastatin A_;. 0.54 mcg/ml in A:, 1.0 mcg/ml in \ . 1.5 mcg-ml in B- bzw. !.0 mcg/ml in B₂.

Beispielsweise wird ein Medium, das 2^o/o Glycerin, 2% Dextrose. I °/o Bactosoyton (Difco). 0,3% Hefeextrakt, 0.2% (NH^-SCh und 0,2% CaCO₃ bei einem pH von 7.4 enthält, in einem Autoklaven behandelt und mit Sporen und/oder Myzeln beimpft, die von einer Schrägkultur von Streptomyces sp. ME98-M3 erhalten worden sind. Alle Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht pro Volumen, sofern nichts anderes angegeben ist. Eine Anreicherung von Amastatinen wird nach 3 bis 7 Tage dauerndem aeroben Züchten unter Schütteln bei 27= C festgestellt.

Die Tabelle I! zeigt die Herstellung von Amastatinen in Schüttelkultureri mii verschiedenen Medien. Die Fermentation wird unter Einsatz von 100 ml des Mediums in einem 500-mi-Kolben auf einem Rotationsschüttler (180 L^:pm) bei 29⁼C durchgeführt. 0.5 mi der Brühe werden zur Untersuchung als Probe entnommer..

13

14

Tabelle II

Amastalinerzeugung in verschiedenen Kulturmedien

Zusammensetzung
des Mediums

Anfangs- Amasiatinerzeugung pH

Inhibierung (%)

I 2 3

Tag End-PH

Stärke	1,0
Glukose	1,0
Sojabohnenmehl	2,0
Hefcextrakt	0,5
Sojabohnenöl	2,0
Stärke	0.5
/""* 1 1 VJIUKU3C	0,5
Sojabohnenmehl	2,5
Glycerin	2,5
Fleiscnextrakt	0.5
Polypepton	0,5
Maltose	2,0
Fleischextrakt	0,5
Polypepton	0.5
Hefeextrakt	0.3
Stärke	2,(J
Glukose	1,0
Hefeextrakt	0.5
Casaminosäure	0.5
Lactose	2.5
Hefeextrakt	0.5
Fleischextrakt	0.5
Polypepton	0.75
Rohrzucker	4.0
Proteinhydrolysat	2.5
Glycerin	2.0
Dextrin	2,0
Soypeptonc*)	1,0
llefecxtrakt	0,3
Stärke	2.0
Baumwollsamenmehl	2,0
Maisllüssigkeil	1.0
Glycerin	3.0
Fischmehl	2.0

6,7

7.1

7.0

7.8

7,1

7.8

7.9

6.9

7.1

7,2

26.2

31,6

40.0

38.5

52,7

45,7

50.2

40,3

31,5
26,9

23,2
17.6

46,2
26.0

22.2
49.1

48.3

8,6

9,0

9,3 8.1 9,4

9.5

8.2

8.9

·) Soypeptonc ist ein en/ymatisches Verarbeitungsprodukt von Sojabohncnmchl.

Die Tabelle III zeigt auch die Amasiatinerzeugung in enthält. Die Fermentation wird mit einem 50-ml-Medi-

verschiedenen Medien. Die in der Tahdle angegebenen h-, um in einem MO-ml-Kolben auf einem Rotationsschiitt

Kohlenstoff- und Stickstoffqucllen werden einem ler (200 UpM) bei 28"C durchgeführt. Die inhibierende

Grundmedium zugesetzt, das 0.1% Hefeextrakt. 0,1% Aktivität wird mit 0,02 ml der Brühe ermittelt.
NaCI, 0,05% K.HPO, und 0.05% MgSO* ■ 7 H..O

Tabelle III

Amastatinproduktion in verschiedenen Medien

Nr. Zusammensetzung des Mediums (%)

Kohlenstoffquelle

Stickstoffquelle

Amastatinproduktion	4tägiger Bebrütung
nach	Inhibierung
pH	18,0
6,7	23,0
6,1	41,3
6,8	25,9
6,5	58,6
6,5	15,2
8,4	16,0
8,2	17,1
8,3	43,1
7,4	55,1
6,8	36,6
7,4	46,1
6,9	30,4
6,4	57,1
6.4	61,8
6,5	64.3
6.0

A	Stärke	3,0
B		3,0
C		6,0
D		3,0
E		6,0
F	Glycerin	3,0
G		3,0
H		3,0
I	Sojabohnenöi	3,U
J		6,0
K		3,0
L		6,0
M		3.0
N	Stärke	4,5
	Sojabohnenmehl	1,5
O
P	Stärke	6,0
	Sojabohnenmehl:	»Es-san

Sojabohnenmehl	2,0
Trockene Hefe	2,0
	4,0
Baumwoüsamenmehl	2,0
	4,0
Sojabohnenmehl	2,0
Trockene Hefe	2,0
Baumwollsamenmehl	2,0
Sojabohnenmehl	2,0
	4.0
Trockene Hefe	2,0
	4,0
Baumwollsamenmehl	2,0
Trockene Hefe	4.0
Baumwollsamenmehl	4,0
Baumwollsamenmehl	4,0
(NH₄J₂SO₄	0,2

Co.

Baumwollsamenmehl: »Pharmamedia«. Traders OiIMiIlCo.

Diese Ergebnisse zeigen, daß die Amastatinerzeugung in Abhängigkeit von dem Medium und der Bebriitungszeit schwankt. Bevorzugte Bestandteile des Mediums für die Amastatinerzeugung sind Glycerin, Glukose, Stärke, Sojabohnenöi, Soypeptone, Baumwollsamenmehl. Maisflüssigkeit, Sojabohnenmehl, Hefe, Casaminosäure sowie Ammoniumsulfat.

Gefäß- und Tankfermentatoren ermöglichen ebenfalls eine gute Erzeugung von Amastatin. Beispielsweise wurde eine Submerskultur in einem Tank unter Einsatz von 100 1 des Mediums P gemäß Tabelle III in einem 200-l-Fermentator gezüchtet. Nach 96stündiger Bebrütung mit einer Belüftung von 100 l/Minute und einem Rühren mit 200 UpM wurde die größte Amastatinmenge erhalten. 0.1 ml der Brühe ergaben zu diesem Zeitpunkt eine 50%ige Inhibierung bei der Durchführung der vorstehend beschriebenen Untersuchungsmethode. Die Amastatine Ai. A?. A;, Bi und B? werden gewöhnlich gleichzeitig in der Fermeniationsbrühe erzeugt. Die Menge eines jeden Amastatins in der Brühe hängt von dem Mikroorganismenstamm, dem Medium, den Züchtungsbedingungen ab.

Auf diese Weise in der Fermentationsbrühe erzeugte Amastatine können nach jeder Methode gewonnen werden, die zur Isolierung und Reinigung von Peptiden angewendet wird und an sich bekannt ist. Für eine Isolierung in kleinem Maßstäbe wird das Brühenfiltrat im Vakuum zur Trockne eingedampft, worauf der Rückstand mit einem Lösungsmittel, welches Peptide aufzulösen vermag, wie Methanol. Äthanol, Dimethyisulfoxid, Essigsäure oder Pyridin, extrahiert wird. Bei einem Arbeiten in großem Maßstabe werden Amastatine aus dem Brühen' trat mit einem Lösungsmittel extrahiert, das Peptide aufzulösen vermag und mit Wasser nicht mischbar ist, wie beispielsweise n-Butanol. Ein Konzentrieren der Extrakte liefert rohe Amastatinpulver.

Amastatine lassen sich in zufriedenstellender Weise durch Adsorption an einem herkömmlichen Adsorbens, wie Aktivkohle, einem organischen Adsorbens, wie Amberlite ® XAD-4 sowie Cellulose, Ionenaustauschern oder Kieselgel, isolieren. Beispielsweise wurde Aktivkohle dem Brühenfiltrat (2%) zur Adsorption der Peptide zugesetzt. Die Aktivkohle wurde abfiltriert und dann mit Wasser und anst hließend zweimal mit 20 bis 25 Volumina Methanol mit 40⁰C gewaschen. Mehr als 70% Amastatin in der Brühe werden durch die Methanolcluierun<* erhalten. Gleichzeitig erzeugte Amastatinanaloga wurden auf di'-se Weise als Rohpulver aus ihren Mischungen isoliert. Jedes Amastatinanalogon kann in wirksamer Weise durch Chromatographie fraktioniert und gereinigt werden. Für diesen Zweck wird Cellulose mit einer Mischung aus Äthylacetat, Äthanol und Ammoniak (17 : 2 : I) als bevorzugtes Lösungsmittelsystem verwendet. Die Isolierung und Reinigung von Amastatinen sind auch unter Einsatz von lonenaustauscherharzen mit sauren und basischen funktionellen Gruppen möglich. Stark basische oder stark saure Ionenaustauscherharze werden bevorzugt.

Die Erfindung sieht ferner ein Verfahren zur Herstellung von Amastatinderivaten vor. Metallsalze von Amastatinen lassen sich leicht durch Neutralisation erhalten. Eine andere Salzform von Amastatin wird durch Kristallisation nach Zugabe von anorganischer Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, erhalten, da Amasta-

tine eine freie Aminogruppe aufv/eisen. N-Acetyl- und N-Propionyl-Derivate lassen sich durch die Behandlung mit einem Anhydrid oder Halogenid der Essigsäure oder Propionsäure unter geeigneten Bedingungen erhalten. Amastatine A₂, A₃ und B₃ (22 mg, 20 mg bzw. 20 mg) wurden in Wasser aufgelöst Acetylchlorid wurde der Lösung bei einem pH von 8,5 zugesetzt, um die freie Aminogruppe zu acetylieren. Die N-Acetylamastatine A₂, A₃ und B₂ wurden in Ausbeuten von 13 mg, 11 mg bzw. 10 mg erhalten. Die NMR- und IR-Spektren bestätigten, daß die Produkte N-acetylierte Amastatine sind. N-Acetylamastatin-Dimethylester können wie folgt hergestellt werden:

Zu N-Acetylamastatinen A₂, A₃ und B₂ (9 mg, 8 mg bzw. 8 mg) wurde eine Mischung aus 0,5 ml Thionylchlorid und 4 ml Methanol in einem Eisbad zugesetzt Die Reaktionsmischung wurde in dem Eis während einer Zeitspanne von 30 Minuten und dann bei Zimmertemperatur über Nacht gehalten. Ein Eindampfen im Vakuum, zur Trockne ergab N-Acetylamastatindimethylester (f0 mg von A₂,9 mg von A₃ bzw. 9 mg von B₂). Die NMR- und Massenspektren bestätigten, daß die Produkte die Dimethylester von N-Acetylamastatin A₂, A₃ bzw. B₂ sind.

Die erfindungsgemäßen Amastatine besitzen eine starke inhibierende Aktivität auf Aminopeptidase A, wie vorstehend bereits dargelegt worden ist. Die Inhibierungsaktivität gegenüber Aminopeptidase A ist so spezifisch, daß andere Aminopeptidasen, wie Aminopeptidase B, nicht durch die Amastatine inhibiert werden. Die Tabelle IV zeigt IDm-Werte von Amastatinen im Falle von Aminopeptidase A und B.

Tabelle IV

Inhibierung von Aminopeptidase A und B durch Amastatine

Amastatine ID50 (mcg/ml)

Aminopeptidase A Aminopeptidase B

A,
Aj
A3
Β,
B;

0,65

0,54

1,0

1,5

1,0

>100
>100
>100
>100
>100

in Agar by Single Antibody-Producing Cells, Science, 140, Seite 405,1963) ermittelt.

Wie aus der Tabelle V hervorgeht, führt die intraperitoneale Injektion von 1 bis 1000 mcg/Maus oder die orale Verabreichung von 10 bis 1000 mcg/Maus an Amastatin A₂ zu einer Erhöhung der Zahl der plättchenbildenden Zellen (PFC) um das ungefähr Zweioder Dreifache im Vergleich zu der Anzahl an PFC in dem Antigen allein.

Tabelle V

Wirkung von Amastatin auf die Antikörperbildung zu SRBC (I) in Mäusen

Amastatin A₂ Amastatin, verabreicht
Dosis/Maus*) i. p. oral

	SRBC	0	149 000	PFC/Milz
10^s	SRBC	1000 ag	235 000	125 000
10^s	SRBC	100	283 000	153 000
10^s	SRBC	10	504 000	192 800
10^ä	SRBC	1	264 800	286 400
ΙΟ⁸			102 700

*) i. p. injiziert zum Zeitpunkt der Immunisation.

Nachdem Amastatin A₂ intraperitoneal einmal pro Tag während einer Zeitspanne von 4 Tagen in Mäuse injiziert worden ist, werden die Mäuse durch intravenöse Injektion von 10^s SRBC immunisiert. Vier Tage nach der Immunisation wird die Anzahl der antikörperbildenden Zellen in der Milz der Maus ermittelt. Dabei wird festgestellt, daß die intraperitoneale Injektion von 100 bis 1000 mcg/Maus/Tag an Amastatin A₂ die Anzahl der PFC um ungefähr das 2- oder 3facho im Vergleich zu der Anzahl von PFC in dem Antigen allein erhöht.

Tabelle VI

Wirkung von Amastatin auf die Antikörperbildung
zu SRBC (II) in Mäusen

Dosis in
■ig/Maus*)

SRBC**)

PFC/Milz

Aminopeptidase A wird bei einer Konzentration von 0,5 bis 1,5 mcg/ml inhibiert, während Aminopeptidase B sogar in Gegenwart von 100 mcg/ml Amastatin nicht beeinflußt wird.

Zusätzlich zu der Inhibierungsaktivität zeigen die neuen Tetrapeptide gemäß vorliegender Erfindung eine Stimulierung humoraler Antikörperbildung.

Mäuse (dd/Y) werden durch intravenöse Injektion von 10« roten Schafblutzellen (SRBC) immunisiert. Amastatine in Salzlösung werden intraperitoneal oder oral an die Mäuse verabreicht. 4 Tage danach wird die Anzahl der Plättchenbildungszellen (PFC) in der Milz nach der homolytischen Plättchenmethode von Jiirne (N. K. lerne, A. A. Nordin und C. Henry: The agar plaque technique for recognizing antibody-producing cells, Cellbond Antibodies. B. Amos und H. Koprowskied, Seiten 109-122, Wister Institute Press, Philadelphia, 1963; N. K. (erne und Λ. A. Nordine, Plaque Formation

*) Tage -4 I, i.p.

**) Tag 0, i.v.

10^s SRBC
10^s SRBC
10⁸ SRBC
10⁸ SRBC
10* SRBC

76 000
121000
138 000
196 000

58 000

Die Wirkung von Amastatin auf die primäre Antikörperbildung gegenüber SRBC in dissoziierten Milzzellenkulturen wird nach den Methoden von Mishell und Dutton uniersucht. Alle Milzkulturen (1,5 χ 10') werden aus den Milzen von CDFi-Mäusen präpariert und mit 10* SRBC als Antigen während einer Zeitspanne von 4 Tagen bei 37°C in einer 7°/oigen COrAtmosphäre gezüchtet. Amastatin wird in dem Medium aufgelöst. Jede Amastatinkonzentration zwi-

sehen 0,0001 (ig und 1 Hg pro Kultur wird zum Zeitpunkt der Immunisation (Stunde 0) sowie 24, 48 oder 72 Stunden nach dem Start der Kulturen zugesetzL Vier Tage nach dem Start der Kulturen wird die Antikörperbildung einer jeden Kultur durch Zählen der PFC unter 5 Erhöhung der PFC-Anzahl zur Folge. Anwendung der von Cuningham et al beschriebenen

Methode ermittelt.

Wie aus der Tabelle VII hervorgeht, hat die Zugabe von 0,01 bis 1 μg Amastatin A₃ zu Milzzellenkulturen 0 oder 24 Stunden nach dem Start der Kulturen eine

Tabelle VII

Amastatin

Zugabe von Amastatin, Stunden nach dem Start der Kultur
24 48

10⁶ SRBC	0	2920	-	-	-
10⁶ SRBC	1	4420	3100	2280	2520
10⁶ SRBC	0,01	4200	2960	2380	3160
10⁶ SRBC	0,0001	2900	3080	2940	3080

Ferner erhöht Amastatin die Einstellung einer verzögerten Hypersensitivität (DTH) gegenüber SRBC. Weibliche dd/Y-Mäuse werden durch Injektion von 10⁸ SRBC in 0,05 ml einer Salzlösung in die rechte hintere Pfote immunisiert. Vier Tage danach wird die Reaktion durch Injektion von 10⁸ SRBC in die linke hintere Pfote ausgelöst und die Zunahme der Dicke der linken hinteren Pfote 24 Stunden später gemessen.

Amastatin A2 wird intraperitoneal einmal pro Tag in Mäuse während einer Zeitspanne von vier Tagen vor der Immunisation durch 10⁸ SRBC injiziert. Wie aus der Tabelle VIII hervorgeht, erhöht Amastatin A2 in einer Menge von 0_rt bis 10 mcg/Maus/Tag das Ansprechen der Pfote, die Injektion von 100 mcg/Maus/Tag zeigt jedoch keine Wirkung bezüglich des Ansprechens der Pfote. Eine intraperitoneale Injektion von 1 bis 1000 mcg/Maus an Amastatin A2 zum Zeitpunkt der Immunisation erhöht ebenfalls nicht das Ansprechen der Pfote.

Tabelle VIII

Einfluß von Amastatin auf die Einstellung einer verzögerten Hypersensitivität gegenüber SRBC in Mäusen

Dosis in ug/Maus

0,1

Amaslatin, injiziert an den Tagen oder am Tag

-4 1

0*)

Zunahme der Pfotendicke

10.2 9,0 8,1

10.0 7,8

14.3 8,1

14.1 8,4 13,8

tivität verursacht eine inhibierung aer Angioiensin-ii-Zersetzung zur Aufrechterhaltung einer bestimmten Konzentration an Angiotensin sowie zur Erhöhung des Blutdrucks. Amastatine lassen sich möglicherweise für diesen Zweck auch zur Potenzierung der Aldosteronaktivität einsetzen.

Die erfindungsgemäßen Amastatine besitzen eine sehr niedrige Toxizität. Herkömmliche Aminopeptidase-A-Inhibitoren sind stark toxische Substanzen, beispielsweise Metallchelierungsmitte!, wie Äthylendiamintetraessigsäure oder o-Phenanthrolin oder Protein-modifizierende Mittel. Amastatine zeigen eine inhibierende Wirkung bei niedrigen Konzentrationen und sind wesentlich weniger toxisch als die herkömmli-

r> chen Inhibitoren. In der Tabelle IX ist die akute Toxizität von Amastatin in Mäusen bei einer intraperitonealen Verabreichung angegeben.

40 Tabelle IX	Amastatinen
Toxizität von	Dosis
AimsLiline	(mg/kg, i.p.)
	125
A₁	125
A₂	125
""' A,	125
B,	125
B,

*) Zum Zeitpunkt der Immunisation.

Die Tatsache, daß Amastatine, die Antikörperbildung erhöhen und eine verzögerte Hypersensitivität ermöglichen, zeigt, daß die Peptide zur F'otenzierung des Wirtsabwehrsystems gegenüber bakteriellen und vira en Infektionen sowie gegenüber Krebs verwendet werden können. Am, iopeptidase A ist eine der Angioiensinasen. Eine starke inhibiemng der Enzymak-Toxizität

keine
keine
keine
keine

keine

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Di; zur Durchführung dieser Beispiele eingesetzten Chromatographiemittel bzw. Gelbfiltrationsmittel lassen sicli wie folgt definier_n:

Amberike® XAD ist ein Warenzeichen für ein makroretikulares vernetztes Styrolpolymeres.

Dowex® 50 ist ein Warenzeichen für eine Polystyrolkernsulfonsäure.

In DEAE-Sephadex® (Warenzeichen) steht DEAE für Diäthylaminoäthyl/.ellulose, während Sephadex* ein vernetztes Dextrangel darstellt.

Dowex® I ist ein Warenzeichen für ein synthetisches stark basisches Anionenaustauscherharz.

Beispiel 1

Ein Medium (1001), das 6,0% lösliche Stärke, 4,0% Baumwollsamenmehl, 0,2% (NHj)₂SO₁, 0,1% Hefeextrakt, 0,2% CaCO₁, 0,05% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄-7 H₂O, 0,1% NaCI und 0,01% eines Antischaummittels enthält, wird in einem Fermentationsgefäß aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 2001 bei 120⁰C während einer Zeitspanne von 30 Minuten sterilisiert und mit einer Saatkultur (5 I) von Streptomyces sp. ME98-M3 (FERM P 3722). hergestellt unter Verwendung des gleichen Mediums durch Züchten in einem Kolben, beimpft. Eine .Submerskultur wird bei 27"C während einer Zeitspanne von 96 Stunden bei einer Belüftung von 200 l/Minute und bei 200 UpM durchgeführt. Aus zwei Chargen, die bei der Fermentation anfallen, werden 200 ! einer filtrierten Brühe erhalten.

Das Fiitrat mit einem iD_w-Wert von O.i mi wird aiii eine 3-l-Säule, die mit Amberlite® XAD(-4) gefüllt ist. aufgebracht. Amastatine werden mit JOI W/oigen Methanols eluicrt. Die Konzentrierung des l.hiats im Vakuum bei 60"C liefert ein rohes Amastatinpulver in einer Menge von 390 g. Der IDw-Wert des Pulvers beträgt 250 mcg/ml.

390 g des Pulvers werden in 3,9 I Wasser aufgelöst. wobei der pH auf 8.2 mit 1 η NaOH eingestellt wird. Die Lösung wird auf eine mit Dowex® 1 (X 4) gefüllte Säule aufgebracht (Acetat-Form; 3,5 I). Die Eluierung mit 10 I einer 0,1 η Essigsäure ergibt nach einem Waschen mit 10 1 Wasser 110 g des aktiven Pulvers (ID-,,, = 100 mcg/ml). Dieses Pulver wird in I.I I 0.3 m Pyridin/Essigsäure-Pufferlösung (pH 6,0) aufgelöst und auf eine mit DEAE-Sephadcx® A25 gefüllte Säule (bOO ml), die zuvor mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist, aufgebracht. Ein durch Eluierung mit dem gleichen Puffer erhaltener aktiver Peak wird im Vakuum konzentriert, wobei man 30.6 g des aktiven Pulvers (ID™ = 40 mcg/ml) erhält.

Eine Lösung des aktiven Pulvers in 400 ml 0.05 m Pyridin/Amciscnsäure-Pufferlösung (pH 2.9) wird auf eine mit Dowex® 50 (X4) gefüllte Säule (310 ml), die zuvor mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist, aufgebracht. Ein aktiver Peak wird durch die Eluierung mit einer Pyridin/Ameisensäure-Pufferlösung (2 I) mit einem linearen Gradienten von 0,05 m, pH 2,9, bis 0.2 m. pH 3,1, erhalten. Die Konzentrierung des Peaks im Vakuum ergibt 5,1 g des aktiven Pulvers(IDy, = 8,5 mcg/ml).

Das Pulver wird weiter durch Kieselgelchromatographie mit einem LCungsmittelsystem aus n-Butylacetat, n-Butanol, Essigsäure und Wasser (12:4:1 : 1) gereinigt 0,8 g eines hochaktiven Pulvers werden erhalten (IDso = 2,5 mcg/ml). Zur Fraktionierung des aktiven Pulvers zur Gewinnung eines jeden Amastatinanalogons wird die vorstehend beschriebene Dowex® 50-SäuIenchromatographie erneut durchgeführt. Amastatine A₂, A3 und B2 werden voneinander durch die Rechromatographie abgetrennt. Jedes durch Konzentrieren der aktiven Fraktion erhaltene Pulver wird durch Adsorption an Do vex® 50 (X4) (H+ -Typ) sowie durch Eluierung mit 0,2 η NH₄OH entsalzt. Die nachfolgend angegebenen im wesentlichen reinen Amastatine werden erhalten:

A₂: 30 mg (I D₅₀ 0,54 mcg/ml)
Aj: 47mg(IDso 1,0mcg/ml)und
B₂: 20mg(ID₅₀l,0mcg/m!)

Diese Präparate besitzen die vorstehend erwähnten physikalisch-chemischen Eigenschaften.

Beispiel 2

Ein Medium (125 ml), das 2% Kartoffelstärke, 2% Baumwollsamenmehl, 1% Maisflüssigkeit und 0,32% CaCOj enthält, wird in einem 50-ml-Kolben bei 120⁰C während einer Zeitspanne von 20 Minuten sterilisiert mit Streptomyces sp. ME98-M3 (FERM P- 3722) beimpft und bei 27°C unter Hin- und llerschütteln mit 130 UpM während einer Zeitspanne von 2 Tagen bebrütet. Diese Kultur wird als Impfmaterial verwendet.

Ein Medium (15 I), das 2% Glycerin. 2°/» Dextrin, 1% Bactosoytone (Difco Co.), 0,3% Hefeextrakt. 0.2% (NH₄J₂SO₄ und 0,2% CaCO, enthalt, wird in em<m jö-i-Fermentaiionsgefaü sterilisiert, mit 1 1 der Implkultür. die in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellt worden ist, beimpft und bei einer Belüftung von 15 l/Minute sowie unter Rühren (200 UpM) bei 27°C während einer Zeitspanne von 4 Tagen bebrütet Ein Brühenfiltrat (50 I) mit einem ID-„,-Wcrt von 0.14 ml wird aus vier Chargen der Kultur erhalten.

Das Fiitrat wird nach im wesentlichen der in Beispiel 1 beschriebenen Methode gereinigt. Die Rechromatographie ^t's aktiven Pulvers, das durch die Silikagelbehandlung und durch die Entsalzung durch Dowex ^x 50 erhalten worden ist, liefert 25 mg im wesentlichen reines Amastatin Ai (ID50 = 0,65 mcg/ml) und 35 mg im wesentlichen reines Amastatin Bi (IDv, = 1.50 mcg'ml). Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Präparate stimmen gut mit den vorstehend erwähnten Eigenschaften überein.

Beispiel 3

3 mg Amastatin Λ; wird in 0,5 ml 0,1 η HCI aufgelöst ur.-l bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 1 Stunde stehengelassen. Die Konzentrierung der Lösung im Vakuum sowie das Abdampfen der überschüssigen Chlorwasserstoffsäure ergibt das Hydrochlorid von Amastatin Ai. Salze anderer Amastatine werden nach der gleichen Methode erhalten. Diese Salze besitzen die folgenden Eigenschaften:

ArHydrochlorid:
F.
!R-Spektrum

ID₅₀

A₂- Hydrochlorid:
F.
I R-Spektrum

A3-Hydrochlorid:
F.
IR-Spektrum

ID₅₀

165-170⁰C

3400,3270,2950.1710,1660.
1640,1540,1470,1390,1285.
1230,1180,1090(Cm-¹)
0.75 mcg/ml

158-162°C

3300,2950,2600,1725.1660,

1640,1535,1470,1395,1280,

1230,1180,1090, 930(cm-')

0.6 mcg/ml

148-153°C

3250,2930,2600,! 7! 0.! 650.

1635,1530,1465,1390,1220,

1113, 930(cm-i)

1.1 mcg/ml

23

Bi-Hydrochlorid:

F.
IR-Spektrurn

ID»

BrH/Jrochlorid:
F.
IR-Spektrum

16O-I65°C

3400,3270,2950,1710,1655, 1635,1540,1470,1390,1290, 1230,1170,1070 (cm ') 1.8mcg/m!

145-150⁰C

3400,3250,2900, 1720,1690, 1625, 1535,1435, 1385, 1275, 1220, 1175,1155, 1105, 1085, 1010, 985, 925, 790 (cm ') 1.1 mcg/ml

F) e i s ρ i e I 4

mg Amastatin A? werden in 10 ml Wasser aufgelöst. 0,5 ml Acetylchlorid werden viermal in lOminütigen Intervallen unter Rühren bei Zimmertemperatur und unter Aufrechterhaltung eines pH von 8,5 unter Einsatz von 1 η NaOH zugesetzt. Nach 2 Stunden wird der pH auf 2,0 unter Verwendung von konzentrierter HCI eingestellt, worauf die Mischung mit 20 ml Äthylacetat zweimal extrahiert wird. Die Konzentrierung der Lösungsmittelschicht im Vakuum ergibt 13 mg des Produkts.

F.:

160-164°C
450 mcg/ml

Das IR- und das NMR-Spektrum bestätigen, das das Produkt aus N-Acetylamastatin A2 besteht.

N-Acetylamastatine A|,A}, Β, und B₂ werden nach der gleichen Methode erhalten.

Beispiel 5

30 mg Amastatin A? werden in 2 ml absolutem Methanol aufgelöst. Eine Mischung aus I ,71I Thionylchlorid und 2 ml absolutem Methanol wird unter Eiskühlung zugesetzt. Die Mischung wird unter Kühlung während einer Zeitspanne von 30 Minuten und dann bei Zimmertemperatur übe- Nacht gerührt. Die Konzentrierung der Mischung im Vakuum ergibt 31 mg des Reaktionsproduktes.

Γ7 . 1.IO ΙΟΟΓ

■ .. ι -το — r Jj \^

ID_W: I7nicg/ml

Das IR- und das NMR-Spektrum bestätigen, daß das Produkt aus Amastatin-Ai-dimethylester besteht.

Dimethylester von Amastatin A) und B₂ werden nach der gleichen Methode erhalten. N-Acetylamastatine Ai, A) und B2 ergeben Dimethylester eines jeweiligen Amastatins unter Anwendung der gleichen Methode.

Monomethylester von Amastatin Ai und Bi werden ebenfalls nach der gleichen Methode erhalten.

Hier/u Il lihi

Claims

Patentansprüche:

I. Amastatine A₁, A₂, A₃, IB, und B₂ der allgemeinen Formel CH₁
CH-R¹ CH₃ CH

I I ι '

CH-R² CH-CH₃

COOH