DE2554636C2

DE2554636C2 - Desacyl-pepsidin, Verfahren zu seiner Herstellung und Arzneimittel

Info

Publication number: DE2554636C2
Application number: DE2554636A
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Kounan Aichi Hasegawa; Noriaki Inuyama Aichi Kuwana; Yukio Gifu Nozu
Original assignee: EISAI Co Ltd TOKYO JP
Current assignee: EISAI Co Ltd TOKYO JP
Priority date: 1974-12-05
Filing date: 1975-12-04
Publication date: 1983-02-17
Also published as: DE2554636A1; FR2293215B1; CH620244A5; SE7513671L; JPS5167791A; JPS5339514B2; CA1053167A; DE2560238C2; FR2293215A1; GB1530921A; NL7514241A; SE423710B

Description

H₃C

CHj

CH₃

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von DA-Pepsidin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Mikroorganismen des Stammes Bacillus pumilus Kawaguchi EF 49-210 (ATCC 31 132) züchtet, das Gärmaischenfiltrat, vollständige Zellen, Trockenzellen oder daraus gewonnene Enzympräparate mit Pepsidin C, Pepsidin B oder Pepsidin A als Reinsubstanzen oder als Rohprodukte oder mit deren Gemischen bei einem pH'Wert von 4 bis 10 und einer Temperatur von etwa 30 bis 5O⁰C 3 bis 60 Stunden umsetzt und Desacyl-pepsidin isoliert

DA-Pepsidin weist eine starke pepsinhemmende Wirkung auf. Es eignet sich deshalb als Wirkstoff zur Behandlung von Magengeschwüren. Die Erfindung betrifft somit auch ein Arzneimittel, welches gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an DA-Pepsidin.

Die als Ausgangsverbindungen verwendeten Pepsidine A, B und C sind in J. Antibiotics 26,1973, S. 539-541 beschrieben. Es sind bisher mehr als 10 N-Acylpentapeptide bekannt.

Pepsidin C oder S-PI-Pepsidin ist auch in US-PS 38 19 486 und in der japanischen Patentveröffentlichung CH

CH₂ OH .
H-CO-Nh-CH-CH-CH₂-COOH

39 446/73 beschrieben. PepsidinA und PepsidinB werden außerdem in US-PS 38 78 185 offenbart

Es ist bekannt, daß die Pepsidine A₁ B und C eine starke pepsinhemmende Wirkung aufweisen.

Die eingesetzten Pepsidine lassen sich durch Züchtung verschiedener Actinomyceten herstellen. Die vorgenannten Pepsidine werden beispielsweise durch Züchtung des Stammes Streptomyces naniwaensis EF 44-201 hergestellt

jedoch haben die durch Züchtung dieser Actinomyceten hergestellten Pepsidine den Nachteil, daß sie im allgemeinen nicht homogen sind, sondern aus einem Gemisch von mehreren, d. h. aus bis zu mehr als zehn N'Acylpentapeptiden mit verschiedenen Acylresten und ähnlichen Eigenschaften bestehen. Um aber zu einem bestimmten N-Acylpentapeptid zu gelangen, sind schwierige Trennverfahren erforderlich, was die Ausbeute an dem gewünschten Produkt beträchtlich vermindert.

Das erfindungsgemäße DA-Pepsidin weist demgegenüber den Vorteil auf, daß kein N-endständiger Substituent vorhanden ist und daß es andererseits mit

25 17-

30

den vorgenannten f^Aeylpentapfsptiden die Grundstruktur gemeinsam hat

Stellt mW also querst ßach dem erfwdungsgemWen Verfahren DA-Pepsidin wnter Verwendung eines Gemisches aus verschiedenen N-Acylpentapeptiden 5 11, durch Züchtung eines entsprechenden Stammes von IZ Streptomyces her und acyljert dann das erhaltene 13, DA-Pepsidin mit Hilfe eines entsprechenden Acylierungsmittels, so erhält man auf einfache Weise das gewünschte, reine N-Acylpentapeptid,

Ferner ist DA-Pepsidin ein wertvolles Zwischenprodukt zur Herstellung von bisher nicht bekannten N-Acylpentapeptiden.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird der Bacillusstamm EF 49-210 (nov. sp.) verwendet, der aus Bodenproben in Kawaguchiko machi, Yamanashi, Japan, isoliert wurde. Dieser Stamm weist folgende mikrobiologische Eigenschaften auf:

!.Mikroskopische Beobachtungen

(Bouillon-Agar-Nährmedium)

1. Morphologie: Stäbchen mit abgerundeten Enden, die einzeln oder paarweise und selten in einer Dreierkombination auftreten

2. Größe:0,4bis 0,7 mal 1,0 bis 4,0 μ

3. Beweglichkeit: Beweglich

4. FlagelfcuPeritricli

5. Sporen: Werden gebildet

6. Gramfärbung: Positiv

7. Säurefeste Färbung: Negativ

IL Züchtungseigenschaften

1. Schräggestelltes Bouillon-Agar-Medium (eintägige Züchtung bei 30⁰C): Flaches, ausgebreitetes Wachstum, milchig gelblich bis leicht gelblich und schwach glänzend. Keine Farbänderung im Nährmedium.

2. Flachgestelltes Bouillon-Agar-Medium (ein- bis siebentätige Züchtung bei 30° C): Flaches, ausgebreitetes Wachstum, dendroid, milchig gelblich; leicht gelbliche, glatte Kolonien, schwach glänzend und durchscheinend bis opak; kein lösliches Pigment

3. Nährbrühe (zwei Tage bei 30⁰Q: Häutchenbildung auf der Oberfläche; schwache und gleichmäßige Trübung.

4. Gelatine-Medium (drei Tage bei 20,27 bzw. 30^s C): Schwaches Wachstum, aber Verflüssigung der Gelatine; bei Stichkultur nicht klar,

5. Lackmusmilch (sechs Tage bei 30"C): Ziemlich sauer und nach sethstagiger Züchtung schwach verflüssigt; keine Koagulation.

6. Kartorfel (zwei Tage bei 30"C): Feuchtes Wachstum und geringe Ausbreitung; Kartoffel dunkel verfärbt

HI. Physiologische Eigenschaften

1. Nitrat-Reduktion: Negativ

2. Denitrogen-Reaktion: Negativ

3. Methylrot-Test: Positiv

4. Voges-Proskauer-Reaktion: Positiv

5. Bildung von Indol: Negativ

6. Bildung von Schwefelwasserstoff: Negativ

7. Stärkehydrolyse: Negativ

8. Verwertung von Citronensäure:
Positiv in Kosar-Medium
Negativ in Symmons-Medium

Verwertung von anorganischem Stickstoff:
Schwach positiv mit Kaliumnitrat
Schwach positiv mit Ammoniunwulf at
PigmentbiJdung: Negativ
Urease: Negativ
Oxidase; Positiv
Katalase: Positiv
Wachstumsbereich:

a) pH-Wert (zweitätige Züchtung unter Schütteln bei 30⁰C in Nährbrühe); Wachstum im sterilisierten Medium bei pH-Wert 5 bis 9,8.

b) Temperatur (bei zweitägiger Züchtung unter Schütteln in Nährbrühe): Wachstum bei 20 bis 45°C

c) Salzkonzentration (bei zweitägiger Züchtung unter Schütteln in Nährbrühe): Wachstum innerhalb eines Tages bei einer Konzentration von 0,5 bis 7,0 Prozent NaCL Wachstum innerhalb von zwei Tagen öei einer Konzentration von 10 Prozent NaCL

Sauerstoffbedarf: Fakultativ anaerob
O-F-Test nach dem Hugh-Leifsr^-Verfahren: Säure wird sowohl aerob als auch an? »rob gebildet; keine Gasbildung.

Fermentationstest und Säurebildung mit Kohlenhydraten wie folgt:

Nr.

Kohlenhydrate

Säurebildung
aerob anaerob

1	Arabinose	—	- ±
2	Xylose	±	±
3	Glucose	+	" +
4	Mannose	+	+
5	Fructose	+	+
6	Galactose	±	±
7	Maltose	—	±
8	Saccharose	+	+
9	Lactose	—	±
10	Trehalose	+	+
11	Sorbit	-	±
12	Mannit	—	±
13	Inosit	+	+
14	Glycerin	+	±
IS	Stärke	—	±
Bei keinem der Kohlenhydrate tritt Gasbildung auf.
Säurebildung (+),
leichte Säurebildung (± \
keine Säurebildung (—l

35

40

45

50 Beim Vergleich der vorgenannten Eigenschaften des Baktßniims mit den in Berge's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, ergibt sieh, daß dieses als eine Art von Bacillus puoiilus zu betrachten ist Es wird als Bacillus pumilus Kawaguchi bezeichnet Dieser Bakterienstamm EF 49-210 (ATCC 31 132) wurde bei der Agency of Industrial Science and Technology, Fermentation Research Irjtitute in Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM-P 2677 hinterlegt

Zur Züchtung der erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen können Nährmedien beliebiger Zusammensetzung und beliebige Züchtungsbedingungen angewendet werden, vorausgesetzt daß die Mikroorganismen dabei ein Wachstum aufweisen und die gewünschten Aktivitäten zeigen. Die Medien können

beispielsweise beliebige organische oder anorganische Stickstoffquellen enthalten, wie Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenhydrolysat, Sojabohnenextrakt, Hefeextrakt, anorganische Ammoniumsalze und dgl. Als Kohlenstoffquellen können beispielsweise :> Melassen, Dextrose, Stärke und Hydrolyseprodukte davon verwendet werden. Ferner können anorganische Salze im Nährmedium enthalten sein. Die Züchtung wird im allgemeinen unter Schütteln oder Belüften bei Temperaturen von 20 bis 45⁰C 1 bis 7 Tage durchgeführt.

Es wurde festgestellt, daß die entacylierende Wirkung von Bacillus pumilus sowohl intrazellulär als auch extrazellulär auftritt. Dies bedeutet, daß erfindungsgemäß die Gärmaische, das Gärfiltrat, die vollständigen Zellen, Trockenzellen und/oder daraus gewonnene Enzympräparate verwendet werden können.

Es ist nicht immer erforderlich, das erfindungsgemäß eingesetzte Ausgangsmaterial, die Pepsidine A, B und C, in gereinigter Form einzusetzen. Beispielsweise können Gemische von N-Acylpentapeptide enthaltenden Materialien verwendet werden, die bei verschiedenen Reinigungsstufen anfallen, beispielsweise kann das Gärfiltrat des Mikroorganismus, der N-Acylpentapeptide bildet, verwendet werden. Ferner können auch Produkte verwendet werden, die durch Aussalzen aus diesem Filtrat erhalten werden. Schließlich können auch Produkte verwendet werden, die durch Extraktion des Gärfiltrates mit einem organischen Lösungsmittel unter anschließendem Entfernen des Lösungsmittels erhalten werden.

Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird bei der Deacylierung der eingesetzten Pepsidine unter Verwendung von Bacillus pumilus Kawaguchi EF 49-210 vorzugsweise ein pH-Wert von 4 bis 10 und eine Temperatur von etwa 30 bis 5O⁰C gewählt Entsprechende Reaktionszeiten liegen im Bereich von 3 bis 60 Stunden. Durch Zugabe von zweiwertigen Kobaltverbindungen, wie C0CI2, COSO4 oder dgl. kann die Ausbeute an DA-Pepsidin gesteigert werden.

Die Abtrennung und Reinigung von DA-Pepsidin aus dem Reaktionsgemisch kann nach einem üblichen Verfahren durchgeführt werden, beispielsweise durch Lösungsmittelextraktion, Säulenchromatographie, fraktionierende Kristallisation, Umkristallisation.

Zum Nachweis der Bildung des erfindungsgemäßen DA-Pepsidins kann folgendes dünnschichtchromatographisches Verfahren angewendet werden:

Die Probe wird auf eine Silicagel-G-Dünnschichtplatte aufgesetzt Als Laufmittel wird entweder (I) ein Gemisch aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser im Volumenverhältnis von 3:1:1 der (II) ein Gemisch aus n-Butanol, Essigsäure, Wasser und Essigsäurebutylester im Volumenverhältnis von 4:1 :1 :4 verwendet DA-Pepsidin wird als Ninhydrin-positiver Fleck, der auch eine positive Rydon-Smith-Reaktion ergibt, nachgewiesen. Bei Verwendung des Laufmittels (I) beträgt der Rr Wert 0,48.

Eine andere Nachweismöglichkeit besteht im Casein' platten-Verfahren, das wie folgt durchgeführt wird:

Nach Entwicklung und Trocknung wird die vorerwähnte Dünnschichtplatte auf eine flache Platte aus Casein enthaltendem Agar übertragen. Auf diese Platte wird ein mh einer Pepsinlösung imprägniertes Filterpapier gelegt Anschließend wird über Nacht bei 30⁰C umgesetzt, uiTi nicht zersetztes Casein nachzuweisen.
DA-Pepsidin hat die folgenden Eigenschaften:

I. Aussehen: Weiße Nadeln

II. Löslichkeit: Leichtlöslich in Essigsäure und Methanol; löslich in Äthanol, n-Butanol und Pyridin; und geringfügig löslich in Aceton und Diäthyläther.

III. Färbungsreaktion: Positive Ninhydrin- und Rydon-Smith-Reaktion.

IV. UV-Absorptionsspektrum: In einer O.lprozentigen Methanoilösung tritt nur die auf die Peptidbindung zurückzuführende Absorption am Ende ein, während im Bereich von 250 bis 370 nm keine Absorptionsmaxima auftreten.

V. IR-Absorptionsspektrum:vgl.die Fig. 1.

VI. Aminosäurezusammensetzung: Nach 72stündiger Hydrolyse mit 6 η HCI bei UO⁰C wird die Probe mittels eines Aminosäureanalysators analysiert. Es ergibt sich ein Molverhältnis von Alanin zu Valin von 1 :2.

VII. Molekulargewicht und Strukturformel:

Eine Probe wird nach dem Säurechloridverfahren acetyliert und anschließend mit Diazomethan einer Methylveresterung unterzogen. Die erhaltene Verbindung wird massenspektrographisch analysiert. Es ergibt sich M⁺= 657. Somit ist das Molekulargewicht der Probe identisch mit dem berechneten Wert von 601 für DA-Pepsidin. Das Maximum dieses Fragments ist auch identisch mit dem für die Strukturformel I von DA-Pepsidin berechneten Wert Außerdem ist das vorgenannte acetylierte Produkt dünnschichtchromatographisch identisch mit Pepsidin C. Das veresterte Produkt ist ferner identisch mit dem Methylester von Pepsidin C.

VIII. Pepsinhemmende Wirkung: Die pepsinhemmende Wirkung von DA-Pepsidin wird nach dem Verfahren gemäß S. Murao und S. Satoi, Agr. Biol. Chem. Japan, Bd. 34 (8), (1970), S. 1265 bis 1267, bestimmt Es läßt sich feststellen, daß 0,82 μg DA-Bepsidin eine 50prozentige Hemmung von 100 μg Pepsin ergeben. Der entsprechende Wert für Pepsidin C liegt bei 0,86 μ^

Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1

In eine 0,5 Liter fassende Sakaguchi-Flasche werden 0,1 Liter eines flüssigen Nährmediums vom pH-Wert 7 gegeben. Das Nährmedium enthält 1 Prozent Fleischextrakt, 1 Prozent Pepton und 0,5 Prozent NaCl und wird Minuten bei 120° C sterilisiert

Jeweils 20 dieser Flaschen werden mit jeweils 1 ml einer Gärbrühe vom Bacillus pumilus K?^>aguchi EF 49-210 inokuliert Das Inokulum ist vorher in einem ähnlichen Nährmedium durch 24st0ndige Züchtung bei 30⁰C hergestellt worden. Sodann wird unter Schütteln Stunden bei 30° C gezüchtet

Nach beendeter Züchtung werden die Zellen aus der Gärmaische durch Zentrifugieren entfernt Der vereinigte Oberstand wird tropfenweise unter Kühlen mit 4 Liter kaltem Aceton versetzt Der erhaltene Niederschlag wird in destilliertem Wasser zu 50 ml einer Suspension suspendiert

Getrennt davon werden 10 g eines N-Acylpentapeptid-Gemisches (Pepsidin C, Pepsidin B und Pepsidin A im Gewichtsverhältnis von 94 :4 :2) in Wasser gelöst und zur Neutralisation mit 6 η NaOH versetzt Man erhält 500 ml einer wäßrigen Lösung. In diese wäßrige Lösung werden 10 ml der Suspension des vorgenannten

Acetonniederschlags gegeben. Das Gemisch wird bei einem pH-Wert von 8,5 5 Stunden bei 37°C gerührt.

Die erhaltene Lösung wird dreimal mit jeweils 500 ml n-Butanol extrahiert Die n-Butanolphasen werden vereinigt und un'er vermindertem Druck zur Trockne eingedampft Man erhält 9,8 g Rückstand.

Anschließend wird der Rückstand in 90 ml eines Lösungsmittelgemisches, das n-Butanol, Essigsäure, Wassi-' und Essigsäureäthylester im Volumenverhältnis von 4 :1 :1 :4 enthält gelöst. ι ο

Die erhaltene Lösung wird auf eine mit 500 g Kieselgel beschickte Säule aufgesetzt. Anschließend wird unter Verwendung des vorgenannten Lösungsmittelgemisches die Säulenchromatographie durchgeführt.

Etwa 0,75 Liter der Hauptfraktion werden unter i'j vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhält 0,7 g Rückstand. Dieser Rückstand ergibt beim Kristallisieren aus Äthanol 03 g eines rohen, kristallinen Produkts. Dieses rohe, kristalline Produkt wird aus Äthanol umkristallisiert Man erhält 0.17 κ DA-Pepsidin in Form von weißen Nadeln.

Schmelzpunkt: Zersetzung bei 193 bis 199°C. Es läßt sich kein klarer Schmelzpunkt beobachten.

[a]²° -57 bis -60° (c = 1;Methanol)
C₂₉H₅₅N₅O, · H₂O

ber.: C 56,19 H 9,26 N Π .29%
gef.: C 5639 H 8,99 N 11,27%

Beispiel 2

In einen 30 Liter fassenden Fermenter werden 15 Liter eines flüssigen Nährmediums vom pH-Wert 7 gegeben. Das Nährmedium enthält 1 Prozent Fleischextrakt, 1 Prozent Pepton und 03 Prozent NaCl und wird 10 Minuten bei 120" C sterilisiert

Getrennt davon wird der Stamm EF 49-210 24 Stunden bei 30° C unter Schütteln in einem ähnlichen

Nährmedium gezüchtet.

In den Fermenter werden 0,2 Liter des vorstehend erhaltenen Anzuchtmediums von EF49-210 überimpft Die Züchtung wird sodann unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

20

25

30

35

Zeit:	24 Stunden
Temperatur:	30° C
Belüftung:	15 Liter/min
Rühren:	350 U/min

Nach beendeter Züchtung werden die Mikroorganismen durch Zentrifugieren von der Gärmaische abgetrennt. 12 Liter des Überstands werden mit Ammoniumsulfat bis zu einem Sättigungsgrad von 0,8 versetzt. Das Gemisch wird sodann 3 Tage in den Kühlschrank gestellt. Der erhaltene Niederschlag wird in destilliertem Wasser suspendiert. Man erhält 750 ml Suspension.

Ein Gemisch aus 100 ml dieser Suspension, 400 ml einer neutralisierten, wäßrigen Lösung mit 8 g Pepsidin C, 292 ml Vi5 m -Phosphatpuffer vom pH-Wert 5,5 und 8 ml einer 5 χ 10-²m CoCl₂-Lösung wird 40 Stunden bei 37°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird dreimal mit je 800 ml n-Butanol extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in einem möglichst geringen Volumen eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol, Essigsäure, Wasser und Essigsäure-n-butylester im Volumenverhältnis 4:1:1:4 gelöst Dieses Gemisch wird der Säulenchromatographie an Kieselgel unter Verwendung dieses Lösungsmittelgemisches als EIutionsmittel unterworfen.

2 Liter der Hauptfraktion werden vereinigt und zur Trockne eingedampft Man erhält 6 g weißes Pulver. Dieses Pulver wird zweimal aus Äthanol kristallisiert. Man erhält 2 g DA-Pepsidin in Form von weißen Nadeln.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

230267/139

Claims

Patentansprüche;

1, Als Desacyl-pepsidin bezeichnetes Pentapeptjd der Formel s

Val-Val-AHMHA-Ala-AHMHA

in der VaI L-Valyl und AIa L-Alanyl bedeuten und AHMHÄ sich von SS^-^Ainino-a-hydroxy-e-me- to thyl-heptansäure ableitet
2. Verfahren zur Herstellung von Desacyl-pepsidin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen des Stammes Bacillus pumilus Kawaguchi EF 49-210 (ATCC 31132) züchtet, das Gärmaischenfiltrat, vollständige Zellen, TrokkenzeUen oder daraus gewonnene Enzyinpräparate mit Pepsidin C, PepsidinB oder PepsidroA als Reinsubstanzen oder als Rohprodukte oder mit deren Gemischen bei einemapH-Wert von 4 bis 10 und einer Temperatur von etwa 30 bis 5(?^OC 3 bis 60 Stunden umsetzt und Desacyl-pepsidin isoliert
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Entacyfierung unter Zugabe von CoCl₂ oder CoSO* durchführt
4. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Desacyl-pepsidin nach Anspruch 1.

Die Erfindung betrifft Desacyl-pepsidin (im folgenden 20 Herstellung und ein Arzneimittel, als DA-Pepsidin bezeichnet), ein Verfahren zu seiner Unter DA-Pepsidin ist das Pentapeptid

Val-Val-AHMHA-Ala-AHMHA

zu verstehen, wobei VaI L-VaIyI und AIa L-Alanyl 25 droxy-6-methyl-heptansäure ableitet DA-Pepsidin gebedeuten und AHMHA sich von 3S,4S-4-Amino-3-hy- maß der Erfindung entspricht der Formel:

H₃C

H₃C CH₃ H₃C CH₃ \ / \ / CM CH

CH₂ OH H₂N-CH-CO-MH-CH-CO-NH-CH-Ch-CH₂-CO-

NH-