CH620244A5 - Process for the microbiological preparation of a deacylpepsidin - Google Patents

Description

620244 2

PATENTANSPRÜCHE noyI-alanyl-4-amino-3-hydroxy-6-methyIheptansäure der For-

1. Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung des Desa- mei (I)

cyl-Pepsidins Valyl-vaIyl-4-amino-3-hydroxy-6-methyI-hepta-

H,C CH.. H-.C CH,

\/3 3\/3

H,C CH, H,C CH, CH CH

3\/ 3 3\/ J

CH CH CH~ OH CH, CH-, OH (I)

I ! I ^ I » J 1^1

H2 K-CH-CO-NM-CH-CO-MH-CH—Cli-CHg-CO-NH-CH-CO-NH-CH—CH-CH2-COOH

dadurch gekennzeichnet, dass man das N-Acylpentapeptid N-Acyl-Valyl-valyl-4-amino-3-hydroxy-6-methyl-heptanoyl-ala-nyl-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure der Formel (II)

\/ CU

H,C CH,

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CH

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CH

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CH

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CH !

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OR

(11/

R-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH—0H-CH2-C0-HH-CH-C0-NH-CH~CH-CH^-COCH

in der R für eine Acylgruppe steht, mittels Kontaktierung mit Bakterien der Art Bacillus pumilus oder mit rohen und angereicherten azellularen Kulturfiltraten und Enzymen, die von der genannten Bakterienart produziert werden, zum Produkt der Formel(I) umsetzt. a

2. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzungszeit zwischen 3 und 60 Stunden liegt.

3. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien solche des Stammes Bacillus pumi- 40 lus Kawaguchi EF 49-210 (ATCC Nr. 31132) sind.

4. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien solche des Stammes Bacillus pumilus IFO-12092 sind.

5. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien solche des Stammes Bacillus pumilus IFO-12HOsind.

6. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Bakterien der Art Bacillus pumilus in Form ganzer oder getrockneter Zellen und die azellularen Präparate in Form von Kulturlösung, von Filtraten der Kulturlösung und/ oder von Enzympräparaten eingesetzt werden.

7. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das N-Acylpentapeptid der Formel (II) als Ausgangsmaterial in einem Gemisch vorliegt, welches Kulturfiltrat aus dem Kulturfiltrat ausgesalzene Produkte und aus dem Kulturfiltrat mittels eines organischen Lösungsmittels extrahierte und eingetrocknete Produkte desjenigen Mikroorganismus enthält, welcher N-Acylpentapeptide mikrobiologisch herstellt.

8. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Umsetzungsmischung Co++-Salze zugegeben werden.

9. Verfahren gemäss Patentanspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Co++-Salz C0CI2 oder C0SO4 ist.

10. Das Desacyl-Pepsidin Valyl-valyl-4-amino-3-hydroxy-6-methyl-heptanoyl-alanyl-4-amino-3-hydroxy-6-methyl-heptan-säure der Formel (I)

H-jC CH3 H3C CH3

\/ V '

\/

HC CH3 H3C CH CH CH

(I)

CH CH CH. OH CH CH„ OH

I I. I 2 I I 3 I 2 I

H N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH—CH-CHj-CO-NH-CH-CO-NH-CH--CH-CH COOH

hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1.

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Die vorliegend beschriebene Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung des Desacyl-Pepsidins

H^C

CH.

Valyl-valyl4-amino-3-hydroxy-6-methyl-heptanoyI-alanyI4-amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure der Formel (I)

H^C

CH.

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3\/ 3

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t

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CH.

OH

i

I)

H2K-CH-CO-K-H-CH-CO-NH-CH—CH-CH2-C0-NH-CH-C0-N1I-CH—CH-CH2-C00H

Der Ausgangsstoff für die Herstellung des Desacyl-Pepsidins der Formel(I) ist das N-Acyl-valyl-valyl4-amino-3-hydroxy-

6-methyl-heptanoylalanyl4-amino-3-hydroxy-6-methylheptan-säure der Formel (II)

CH..

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CH

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V

CH

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1

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QH

i

( i t ;

R-NH-CH-CO-NH-CH-CG-NH-CH — CH-CH?-CO~NH-CH-CO-NH-CH— CH-CH2-C0CH

worin R für eine Acylgruppe steht.

Das beschriebene Desacyl-Pepsidin weist starke Aktivitäten als Pepsininhibitor auf und ist daher bei der medikamentösen Behandlung von Magengeschwüren nützlich.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung des Desacyl-Pepsidins Valyl-valyl4-amino-3-hydroxy-6-methyl-heptanoylalanyl4-amino-3-hydroxy-6-methyl-heptansäure der Formel (I) ist im Patentanspruch 1 definiert.

Es sind schon mehr als 10 Verbindungen von N-Acylpenta-peptiden der Formel (II) bekannt. Die Verbindung mit R = Ace-tyl ist zum Beispiel durch N. Kuwana entdeckt worden. Die Verbindung ist in den US-Patentschriften Nr. 3 819 486 und 3 878 185, und in der J. Patanm. Nr. 39446/73 beschrieben und trägt dort die Bezeichnung «S-PI» oder «Pepsidine C». In der genannten J. Patanm. werden auch diejenigen Verbindungen mit R = Butyryl und Propionyl beschrieben; sie tragen die Bezeichnungen «Pepsidine A» resp. «Pepsidine B».

Weiter sind durch Umezawa et al N-Acylpentapeptide mit R = Isovaleryl oder gerade verzweigte aliphatische Acylgrup-pen mit 5 bis 16 C-Atomen in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 8996/72, in der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 29582/72 und in der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 41590/74 beschrieben worden. In den genannten Dokumenten werden die Produkte als «Pepstatin» bezeichnet.

Es ist bekannt, dass alle die beschriebenen N-Acylpentapeptide starke pepsininhibitorische Aktivitäten aufweisen.

Die N-Acylpentapeptide werden durch mikrobiologische Kulturen von verschiedenen Actinomycetes gewonnen. Das weiter oben angeführte Desacyl-Pepsidin wird zum Beispiel aus den Kulturen von Streptomyces naniwaensis EF 44-201 gewonnen. Die erwähnten Pepstatine können beispielsweise aus Kulturen von Streptomyces testaceus gewonnen werden. Die aus den genannten Actinomycetes-Kulturen gewonnenen N-Acylpentapeptide sind normalerweise aber nicht homogene Produkte. Sie stellen vielmehr eine Mischung von verschiedenen, bis zu mehr als 10, N-Acylpentapeptide dar, welche verschiedene Acylreste R aufweisen und ähnliche Eigenschaften haben. Um aus diesen Mischungen reine, spezielle N-Acylpentapeptide zu erhalten, sind sehr komplizierte und aufwendige Trennverfahren notwendig. Dadurch wird aber auch die Ausbeute am gesuchten Endprodukt stark verringert. m Desacyl-Pepsidin mit der freien, N-haltigen endständigen Gruppe hat die gleiche Grundstruktur wie die obengenannten homologen N-Acylpentapeptide. Durch das erfindungsgemässe Verfahren wird aus der Mischung der N-Acylpentapep-tide das Desacyl-Pepsidin erhalten; dieser kann hierauf durch 3-5 ein spezielles Acylierungsmittel zu einem gewünschten N-Acylpentapeptid umgesetzt werden. Dieses wird somit so in reiner Form und erhöhter Ausbeute erhalten.

Ebenso kann natürlich das Desacyl-Pepsidin als ein Zwischenprodukt für die Synthese von weiteren, bis heute unbe-4o kannten N-Acylpentapeptiden verwendet werden.

Ein Bakterienstamm, der im erfindungsgemässen Verfahren eingesetzt wird, ist Bacillus pumilus EF49-210 (nov. sp.). Dieser Stamm wurde aus dem Erdboden bei Kawaguchiko machi, in der Präfektur Yamanashi, Japan, isoliert. Die mikrobiologi-43 sehen Eigenschaften des Stammes sind die folgenden:

I. Mikroskopische Eigenschaften (Bouillon-agar-Nährmedium)

1. Morphologie: Stäbchen mit abgerundeten Enden, die v ■ einzeln, paarweise oder (selten) in Dreierformation vorliegen.

2. Grösse: 0,4 bis 0,7 mal 1,0 bis 4,0 n.m.

3. Motilität: beweglich

4. Flagella: Peritrichös

5. Sporen: ausgebildet

:> 6. Färbung, Gram: positiv

7. Schnellfärbung, Säure: negativ

II. Beobachtung an der Kultur

1. Auf geneigtem Bouillon-agar-Nährboden (bei 30 °%C, ein b'i Tag lang): Wuchs durch flaches Ausdehnen, Farbe milchiggelblich bis leicht gelblich, leicht schimmernd, keine Verfärbung des Nährmediums.

2. Auf ebenem Bouillon-agar-Nährmedium (30 °C, 1 bis 7 Tage lang): Wuchs durch flaches Ausdehnen, dendroitisch, mil-chig-gelblich, leicht gelblich, glatte Kolonie, leicht schimmernd und durchscheinend bis opak, kein lösliches Pigment.

3. In der Kulturbrühe (bei 30 °C, 2 Tage lang): Hautbildung auf der Oberfläche, Trübung ist schwach und gleichmässig.

J

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4. In Gelatinemedium (bei 20,27 und 30 °C, 3 Tage lang): Schwacher Wuchs, Gelatine wird aber verflüssigt, nicht klar im Vergleich zu Stichkultur.

5. In Litmusmilch (bei 30 °C, 6 Tage lang): Eher sauer, nach ötägiger Kultur leicht verflüssigt, keine Koagulation.

6. Auf Kartoffelschnittfläche (bei 30 °C, 2 Tage lang): Feuchter Wuchs und schleimige Ausdehnung, Kartoffel dunkel verfärbt.

III. Physiologische Eigenschaften:

1. Nitratreduktion: negativ

2. Stickstoffabspaltung: negativ

3. Methyl-rot-Test: positiv

4. Voges-Proskauer-Reaktion: positiv

5. Indolbildung: negativ

6. H2S-Bildung: negativ

7. Stärkehydrolyse: negativ

8. Aufbrauchen von Zitronensäure: positiv in Kosers Medium, negativ in Symmons Medium

9. Aufbrauchen von anorganischem Stickstoff: schwach positiv in Kaliumnitrat, schwach positiv in Ammoniumsulfat

10. Bildung von Pigmenten: negativ

11. Urease: negativ

12. Oxidase: positiv

13. Catalase: positiv

14. Wuchsparameter: a) pH (Kulturbrühe als Nährmedium bei 30 °C, 2 Tage lang unter Schütteln) Wuchs im sterilisierten Medium bei pH zwischen 5 und 9,8;

b) Temperatur (Kulturbrühe als Nährmedium, 2 Tage lang unter Schütteln) Wuchs bei Temperatur zwischen 20 °C und 45 °C;

c) Salzkonzentration (Kulturbrühe als Nährmedium, 2 Tage lang unter Schütteln) Wuchs innerhalb eines Tages in NaCl-Konzentrationen zwischen 0,5 bis 7,0%; Wuchs innerhalb zweier Tage in NaCl-Konzentration von 10%.

15. Sauerstoffbedarf: fakultativ anaerob

16.0-F-Test nach Hugh-Leifson: Bildung von Säure sowohl aerob wie auch anaerob; keine Gasbildung.

17.Fermentationstest und Säurebildung mit Kohlehydraten:

Nr.

Kohlehydrat

Säurebildung aerob anaerob

1

Arabinose

+

2

Xylose

+

±

3

Glucose

+

+

4

Mannose

+

+

5

Fructose

+

+

6

Galactose

±

±

7

Maltose

-

+

8

Sucrose

+

+

9

Lactose

-

+

10

Trehalose

+

+

11

Sorbit

-

+

12

Mannit

-

±

13

Inosit

+

+

14

Glycerol

+

±

15

Stärke

-

±

In keinem der Kohlehydrate war eine Gasbildung zu beobachten.

Sauer (+), leicht sauer (±), nicht sauer (-).

Durch Vergleich der oben angegebenen Spezifizierungen mit denjenigen in Bergey, Manual of Determinative Bacterio-Iogy, 7. Auflage, kann angenommen werden, dass die beschriebene Bakterienkultur eine Variante von Bacillus pumilus ist.

Der Stamm wurde daher als Bacillus pumilus Kawaguchi bezeichnet. Der Stamm EF 49-210 (ATCC Nr. 31132) wurde am 16. August 1974 bei der Agency of Industriai Science and Technology, Fermentation Research Institute in Japan unter der Bezeichnung FERM-P Nr. 2677 hinterlegt. Es ist auch festgestellt worden, dass zwei weitere Stämme dieser Bakterienart, nämlich Bacillus pumilus IFO-12092 und Bacillus pumilus IFO-12110, welche beide im Institute of Fermentation in Osaka, Japan, gehalten werden, im erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden können.

Für die Kultivierung der im erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Mikroorganismen können verschiedene Medien und Bedingungen verwendet werden, vorausgesetzt, dass der Mikroorganismus darin wachsen und seine gewünschten Aktivitäten voll entfalten kann. Im Nährmedium können zum Beispiel vorhanden sein irgendwelche organischen oder anorganischen Stickstoffquellen wie Peptone, Fleischextrakt, Flüssigkeit aus eingeweichtem Getreide, Soyabohnenhydrolysat, Soyabohnenextrakt, Stärkeextrakt, anorganische Ammoniumsalze und ähnliche. Weiter kann das Nährmedium irgendeine Kohlenstoffquelle wie Melasse, Dextrose, Stärke und die entsprechenden Hydrolysate, enthalten. Ebenso können in den Medien anorganische Salze vorliegen. Die Kultivierung wird normalerweise unter Schütteln oder Belüftung bei Temperaturen zwischen 20 und 45 °C ausgeführt, die Dauer beträgt 1 bis 7 Tage.

Es ist festgestellt worden, dass die deacylierende Wirkung des Bacillus pumilus sowohl intra- wie auch extrazellular vorliegt. Es ist daher möglich, im erfindungsgemässen Verfahren die Bakterienart als Kulturbrühe, Filtrat der Kulturbrühe,

ganze Zellen, trockene Zellen und/oder Enzympräparate dieser Bestandteile zu verwenden.

Das Ausgangsmaterial zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens, d. h. das N-Acylpentapeptid muss nicht immer in einer gereinigten Form vorliegen. Es können zum Beispiel Mischungen aus verschiedenen N-Acylpentapeptiden eingesetzt werden. Diese können durch verschiedene Reinigungsstufen getrennt werden, so dass Filtrate der Kulturbrühe sowie ausgesalzene Produkte dieses Filtrâtes eingesetzt werden können. Ebenso können Produkte, welche mittels organischer Lösungsmittel aus dem Kulturfiltrat extrahiert wurden, und von denen anschliessend das Lösungsmittel abgetrennt wurde, verwendet werden.

Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens sind die Umsetzungsbedingungen wie Konzentrationen, Temperaturen, pH und ähnliche nicht kritisch. Sie können über grosse Bereiche variiert werden, je nach Art des verwendeten Mikroorganismus und des eingesetzten N-Acylpentapeptids. Wenn die Desacylierung des N-Acylpentapeptides zum Beispiel mittels Bacillus pumilus Kawaguchi EF 49-210 ausgeführt wird, sind die folgenden Umsetzungsbedingungen vorteilhaft: pH 4 bis 10, Temperatur 30 bis 50 °C, Reaktionszeit: 3 bis 60 Stunden. Durch Zugabe von Kobalt ++-Salzen wie Kobaltchlorid und Kobaltsulfat, usw. wird die Ausbeute an Desacyl-Pepsidin erhöht.

Die Abtrennung und Reinigung des Desacyl-Pepsidins von der Reaktionsmischung kann mittels konventioneller Methoden wie Lösungsmittelextraktion, Kolonnenchromatographie, fraktionierte Kristallisation, Rekristallisation und ähnliche ausgeführt werden.

Um die Bildung des erfindungsgemässen Desacyl-Pepsidins nachzuweisen, kann die Dünnschichtchromatographie gemäss folgendem Vorgehen verwendet werden:

Ein Tropfen der Umsetzungslösung wird auf einer Dünnschichtplatte von Silikagel G (Produkt und Marke der Firma Merck AG), gegeben. Die Entwicklung wird hierauf entweder mit einem Lösungsmittelgemisch aus N-Butylalkohol, Essigsäure und Wasser in den Volumenverhältnissen 3 :1:1, oder

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5

10

15

20

25

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mit einem Lösungsmittelgemisch aus N-Butylalkohol, Essigsäure, Wasser und Butylacetat in den Volumenverhältnissen 4:1:1:4 ausgeführt. Das Desacyl-Pepsidin zeigt sich hierauf als ein Fleck, welcher in der Ninhydrin-Reaktion positiv und in der Rydon-Smith-Reaktion, bei Rf = 0,48 mit dem ersten Lösungsmittelgemisch ebenfalls positiv reagiert.

Eine weitere Art, das Desacyl-Pepsidin nachzuweisen, geschieht mittels Caseinplatten:

Ein Untersuchungsplättchen, wie es weiter oben beschrieben worden ist, wird entwickelt und getrocknet und hierauf so auf eine flache Unterlage aus Casein enthaltendem Agar gelegt. Hierauf wird ein mit der Pepsin-Lösung angefeuchtetes Filterpapier auf die Agarfläche gelegt. Die Mischung wird hierauf bei 30 °C über Nacht reagieren gelassen, um hierauf das nicht abgebaute Casein festzustellen.

Das Desacyl-Pepsidin, welches gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellt worden ist, hat die folgenden physico-chemikalischen Eigenschaften:

a) Aussehen: weisse Nadeln b) Löslichkeit: Leicht löslich in Essigsäure und Methanol, löslich in Äthanol, n-Butanol und Pyridin, schwach löslich in Aceton und Äthyläther.

c) Farbreaktion: Positiv sowohl in Ninhydrin-Reaktion wie auch in Rydon-Smith-Reaktion.

d) UV-Absorptionsspektrum: Eine 0,l%ige Lösung in Methanol zeigt nur die Endabsorption der Peptid-Bindung; keine maximale Absorption zwischen 250 um bis 370 um.

e) IR-Absorptionsspektrum: Dieses ist in der beigelegten Figur 1 dargestellt.

f) Anteile der Aminosäuren: Nach 72 Stunden Hydrolyse mit 6N HCl bei 110 °C wurde das Muster mittels eines Amino-säurenanalysengerätes untersucht. Das molare Verhältnis von Alanin zu Valin ist zu 1 :2 gefunden worden.

g) Molekulargewicht und Strukturformel: Ein Muster wurde mit einem Säurechlorid acetyliert und hierauf mittels Diazomethan verestert zum entsprechenden Methylester. Die erhaltene Verbindung wurde im Massenspektrograph analysiert und ein Molekulargewicht von 657 wurde errechnet. Das Molekulargewicht des Desacyl-Pepsidins wurde so zu 601 berechnet, was mit dem theoretischen Wert übereinstimmt. Der Peak eines abgespaltenen Teiles der Verbindung stimmte überein mit dem berechneten Wert, welcher aus der Strukturformel von Desacyl-Pepsidin gemäss der Formel (I) berechnet wurde.

Das weiter oben aufgeführte acetylierte Produkt des Musters verhielt sich auf dünnschichtchromatographischen Platten identisch mit Pepsidin C und das veresterte Produkt identisch mit dem Methylester des Pepsidin C.

h) Pepsininhibitorische Aktivität: Die pepsininhibitorische Aktivität von Desacyl-Pepsidin wurde bestimmt gemäss der Methode nach S. Murao und S. Satoi in Agr. Biol. Chem. Japan 34(8)1265-1267(1970).

Es ist so nachgewiesen worden, dass diejenige Menge an Desacyl-Pepsidin, welche 50%ige Inhibition gegen 100 |xg Pepsin ergibt, 0,82 |xg beträgt. Die entsprechende Menge von Pepsidin C beträgt 0,86 ng.

Die folgenden Beispiele illustrieren einige bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens; sie dienen aber keineswegs als Begrenzung desselben.

Beispiel 1

In eine 0,5 Liter Sakaguchi-Flasche wurden 0,1 Liter eines flüssigen Mediums (pH 7) gegeben, welches 1% Fleischextrakt, 1% Pepton und 0,5% NaCl enthielt. Das Medium wurde hierauf 10 Minuten lang bei 120 °C sterilisiert. Auf diese Weise wurden 20 solcher Flaschen vorbereitet.

Jede Flasche wurde hierauf mittels 1 ml einer Aufschläm-mung des Bakterienstammes Bacillus pumilus Kawaguchi EF

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49-210 geimpft. Dieser Stamm war zuvor in einer ähnlichen Nährlösung 24 Std. lang bei 30 °C vorerst ruhend und hierauf 72 Std. lang bei 30 °C unter Schütteln kultiviert worden.

Nach Abschluss der Kultivierung wurden die Zellen von der Aufschlämmung mittels Zentrifugierung abgetrennt. Zu den zusammengeschütteten Zentrifugaten wurden hierauf tropfenweise und unter starkem Kühlen 4 lt. kalter Aceton gegeben. Der erhaltene Niederschlag wurde im destillierten Wasser suspendiert und man erhielt 50 ml Suspension.

Daneben wurden 10 g einer Mischung von N-Acylpenta-peptiden (Pepsidin C, Pepsidin B und Pepsidin A im Gewichtsverhältnis 94:4 :2) in Wasser aufgelöst und mit 6n NaOH neutralisiert, wodurch 500 ml einer wässrigen Lösung erhalten wurden. Zu dieser wässrigen Lösung wurden 10 ml der weiter oben erhaltenen Suspension des Acetatausfalles gegeben. Die Mischung, welche einen pH von 8,5 hatte, wurde hierauf 5 Std. lang bei 37° gerührt.

Die resultierende Reaktionslösung wurde dreimal mit 500 ml N-Butylalkohol extrahiert. Die kombinierten N-Butylalko-hollextrakte wurden zusammengegeben, unter reduziertem Druck zur Trockene eingedampft und es wurden so 9,8 g Rückstand erhalten.

Dieser Rückstand wurde hierauf mit 90 ml eines Lösungsmittelgemisches gelöst. Dieses Gemisch enthielt N-Butylalko-hol, Essigsäure, und n-Butylacetat im Volumenverhältnis 4:1:1:4. Die erhaltene Lösung wurde auf eine Kolonne aufgegeben, welche mit 500 g Silikagel gefüllt war. Die Lösung wurde chromatographisch getrennt, in dem gemäss den oben angegebenen Verfahren eluiert wurde.

Ungefähr 0,75 lt. der Hauptfraktion wurden hierauf unter reduziertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhielt so 0,7 g Rückstand. Durch Rekristallisation des Rückstandes aus Äthylalkohol wurden 0,3 g rohes, kristallines Material erhalten. Durch weitere Rekristallisation aus Äthylalkohol wurden 0,17 g Desacyl-Pepsidin in Form von weissen Nadeln Kristallen erhalten.

Schmelzpunkt: Das Material zersetzt sich bei 193° bis 199 °C, ohne dass ein eindeutiger Schmelzpunkt zu beobachten war.

[a]o° = -57° bis -60° (C = 1, Methanol) Elementaranalyse für CisHssNsOs • H2O

C%

H%

N%

Berechnet

56,19

9,26

11,29

Gefunden

56,39

8,99

11,27

Beispiel 2

In ein 30-1-Fermentiergefäss wurden 15 lt. eines flüssigen Nährmediums (pH 7) gegeben, welches 1% Fleischextrakt, 1% Pepton und 0,5% NaCl enthielt. Das flüssige Medium wurde hierauf 10 Minuten lang bei 120 °C sterilisiert.

Daneben wurde ein Stamm Bacillus pumilus EF 49-210 kultiviert, in dem die Kultur 24 Std. lang in einem ähnlichen Nährmedium bei 30 °C unter Rühren aufgebaut wurde.

Der Inhalt des Fermentiergefässes wurde mittels 0,2 lt. Kulturbrühe des Stammes EF 49-210 geimpft. Die neue Kultivierung wurde unter den folgenden Bedingungen ausgeführt:

Zeit: 24 h

Temperatur: 30 °C Belüftung: 151/min Rührgeschwindigkeit: 350 U/min

5

5

'0

i5

20

25

30

Vj

4(i

45

hl)

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Nach Abschluss der Kultivierung wurden die Mikroorganismen mittels Zentrifugierung aus der Kulturbrühe entfernt. In 12 lt. Zentrifugat wurde soviel Ammoniumsulfat gegeben, bis 80% Sättigung erreicht worden war. Die Mischung wurde hierauf 3 Tage lang im Kühlschrank belassen. Die gebildete Ausfällung wurde in destilliertem Wasser suspendiert und es wurden 750 ml Suspension erhalten.

Hierauf wurde eine Mischung aus 100 ml der genannten Suspension, 400 ml einer neutralisierten wässrigen Lösung mit 8 g Pepsidin C, 292 ml eines 1/15 m Phosphatpuffers (pH 5,5) und 8 ml einer 5x 10"2 m COCh-Lösung hergestellt. Diese Mischung wurde 40 Std. lang bei 37 °C im Inkubationsschrank gehalten. Die Reaktionsmischung wurde dreimal mit 800 ml N-Butylalkohol extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in einem minimalen Volumen von Lösungsmittelgemisch aus N-Butylalkohol, Essigsäure, Wasser und N-Butylacetat im Volumenverhältnis 4:1:1:4 aufgenommen. Die Lösung wurde hierauf mittels Sili-kagel-Kolonnenchromatographie getrennt.

2 lt. der Hauptfraktion wurden zur Trockne eingedampft und ergaben 6 g weisses Pulver. Nach zweifacher Rekristallisation aus Äthanol wurden 2 g Desacyl-Pepsidin erhalten, welches in Form von weissen Nadeln vorlag.

Beispiel 3

100 mg Desacyl-Pepsidin, wie es gemäss Beispiel 1 erhalten wurde, wurde in 100 ml Pyridin aufgelöst. 1,2 ml einer 20 mal verdünnten Acetylchloridlösung in Aceton wurden hierauf tropfenweise in die Pyridinlösung gegeben, wobei das Ganze mit Eis gekühlt wurde. Die Mischung wurde über Nacht stehengelassen. Ein aliquoter Teil der Reaktionsmischung wurde hierauf der Silikageldünnschichtchromatographie unterworfen, wobei als Entwicklungslösungsmittel Mischungen aus N-Butanol, Essigsäure, Wasser und n-Butylacetat im Volumenverhältnis 4:1:1:4 verwendet wurden. Hierauf wurde die eigentliche Bestimmung mittels der Ninhydrin-Reaktion, mittels der Rydon-Smith-Reaktion und mittels der Caseinplatten-methode ausgeführt. Das untersuchte Material zeigte einen Rf = 0,49 und es wurde als authentisches Pepsidin C identifiziert.

Die Reaktionslösung wurde zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 100 ml Methanol aufgenommen und zur Lösung hierauf 17 ml einer ätherischen Lösung von Diazome-than gegeben. Die Lösung wurde 30 Std. lang bei Raumtemperatur belassen und hierauf zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in Methanol aufgelöst. Durch Zugabe von Äther wurden 34 mg Methylester des Pepsidin C auskristallisiert.

Beispiel 4

Gemäss dem Verfahren in Beispiel 3 und unter Einsatz von Isovalerylchlorid anstelle von Acetylchlorid wurde ein Produkt mit Rf = 0,64 hergestellt, welches mittels Dünnschichtchromatographie als authentisches Pepstatin A identifiziert wurde.

Beispiel 5

1 ml der Kulturbrühe des Stammes EF 49-210, wie er gemäss dem Vorgehen im Beispiel 1 erhalten wird, wurde mit 1 ml einer wässrigen Lösung von 10 mg Pepsidin C in Wasser, welches mit einer 6n NaOH-Lösung neutralisiert worden ist, gemischt. Die erhaltene Lösung wurde 5 Std. lang bei 37 °C geschüttelt.

Die Reaktionslösung wurde mittels Silikagel Dünnschichtchromatographie untersucht, wobei als Entwicklungslösungsmittel ein Gemisch von N-Butanol, Essigsäure und Wasser im Volumenverhältnis 3:1:1 verwendet wurde. Das erhaltene Produkt zeigt einen Rf = 0,48 und wird als authentisches Desacyl-Pepsidin identifiziert.

Beispiel 6

Gemäss dem Vorgehen im Beispiel 5 wurde Desacyl-Pepsidin hergestellt, wobei im Gegensatz zum genannten Beispiel von Pepsidin B oder Pepsidin A ausgegangen wurde. Das Produkt wurde wiederum mittels Dünnschichtchromatographie analysiert.

Beispiel 7

Gemäss dem Vorgehen im Beispiel 5 wurde Desacyl-Pepsi-din hergestellt, indem anstelle von Pepsidin C N-Isovalerylpen-tapeptid (Pepstatin A) verwendet wurde. Das Produkt wurde wiederum mittels Dünschichtchromatographie analysiert.

Beispiel 8

Gemäss dem Vorgehen im Beispiel 5 wurde Desacyl-Pepsi-din hergestellt, wobei N-n-hexanoyl-pentapeptid oder N-n-deca-noylpentapeptid durch Pepsidin C ersetzt wurde. Das Produkt wurde wiederum mittels Dünnschichtchromatographie analysiert.

Beispiel 9

Gemäss dem Vorgehen im Beispiel 5 wurde Desacyl-Pepsi-din hergestellt, wobei jedoch anstelle des Bacillus pumilus Kawaguchi EF 49-210 Bacillus pumilus IFO 12092 oder Bacillus pumilus IFO 12110 verwendet wurde. Das Produkt wurde wiederum mittels Dünnschichtchromatographie bestimmt.

Beispiel 10

Gemäss dem Vorgehen im Beispiel 5 wurde Desacyl-Pepsidin hergestellt, wobei jedoch 1 ml der Kulturbrühe von EF 49-210 durch 10 mg Bakterienzellen ersetzt wurde, welche aus Aceton getrocknet worden waren. Das Produkt wurde wiederum mittels Dünnschichtchromatographie bestimmt.

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1 Blatt Zeichnungen