DE2921052A1 - Bei aerober gaerung zur einfuehrung einer 12 beta -hydroxygruppe in den aglykonteil von 12-desoxyherzglykosiden faehiger aus waldboeden erhaeltlicher mikroorganismenstamm und verfahren zur herstellung von 12 beta -hydroxycardenolidverbindungen - Google Patents
Bei aerober gaerung zur einfuehrung einer 12 beta -hydroxygruppe in den aglykonteil von 12-desoxyherzglykosiden faehiger aus waldboeden erhaeltlicher mikroorganismenstamm und verfahren zur herstellung von 12 beta -hydroxycardenolidverbindungenInfo
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Description
DR. STEPHAN G.BESZ^DES PATENTANWALT
ZUGELASSENER VERTRETER AUCH BEIM EUROPÄISCHEN PATENTAMT
PROFESSIONAL REPRESENTATIVE ALSO BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE
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P 1 221
zur Patentanmeldung
RICHTER GEDEON VEGrESZETI GYAR RT.
Budapest, Ungarn
betreffend
Bei aerober Gärung zur Einführung einer 12ß-Hydroxygruppe in den Aglykonteil von
12-Desoxyherzglykosiden fähiger aus Waldböden erhältlicher Hikroorganismenstamin.
und Verfahren zur Herstellung von I2ß-Hydroxycardenolidverbindungen
Die Erfindung betrifft einen bei aerober Gärung zur Einführung einer 12ß-Hydroxygruppe in den Aglykonteil von
12-Desoxyherzglykosiden fähigen aus Waldböden erhältlichen
909883/0^17
ORIGINAL
INSPECTED
neuen Mikroorganismenstamm und ein neues Verfahren zur
mikrobioligischen Herstellung von 12ß-Hydroxycardenolidverbindungen
unter Verwendung dieses Stammes.
Es ist bekannt, daß die handelsüblichen Herzmittel Lanatosid-C, Acetyldigoxin und Digoxin aus den Blättern
der Pflanze Digitalis lanata gewonnen werden. Die Blätter dieser Pflanze enthalten ein Gemisch der Glykoside
Lanatosid-A, Lanatosid-B, Lanatosid-C und Lanatosid-D. Es kann aber unter der Einwirkung der vorliegenden
hydrolysierend wirkenden Enzyme auch eine Abspaltung des
Glykoseteiles und der Acetylgruppe eintreten, wodurch dann neben den erwähnten primären Glykosiden auch die 4- entsprechenden
sekundären Glykoside Digitoxin, Gitoxin, Digoxin und Diginatin in der Droge zugegen sind. Das Mengenverhältnis
der primären zu den sekundären Glykosiden schwankt in Abhängigkeit von den Züchtungsbedingungen der
Pflanze, was aber vom Gesichtspunkt der Verfahrenstechnik
beziehungsweise Technologie der Gewinnung der Glykoside überhaupt nicht vorteilhaft ist. Dabei bleibt das
Lanatosid-A bei der Gewinnung der als Arzneimittel verwendbaren in der 12ß-Stellung eine Hydroxygruppe aufweisenden
Glykoside als unbrauchbares Nebenprodukt zurück.
Zur Hydroxylierung des Aglykonteiles von 12-Desoxyherzglykosiden
können nach den Schrifttumsangaben verschiedene Mikroorganismen verwendet werden. So wurden für diesen
Zweck zum Beispiel Fusarium lini (HeIv. Chim. Acta. 41
£i960j, 297), Gibberella fujikuroü und Helicostylum piriforme
(Nature 184 p959""J, 4-69), Gibberella saubinetti
(Chem. Pharm. Bull. 8_ F196OJ, 530), Calonectria decora und
Nigrospora sphaerica (Abstr. Symposium on the Chem. of Digitalis Cardiac Glycosides £Ϊ96θΓ}» 114) vorgeschlagen.
- 3 9O9883/oei7
Mit der Hydroxylierung des therapeutisch anwendbaren Herzglykosides Digitoxin hat sich aber nur eine japanische
Forsehergruppe, von welcher die Mikroorganismenstämme
Streptomyces owashiensis, Streptomyces diastatochromogenes, Mortierella isabellina, Trichocladium asperum und Circinella
muscae mit Erfolg zur Herstellung von Digoxin verwendet wurden (Agr. Biol. Chem. 23 p965]» 783), befaßt.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen bei aerober Gärung zur Einführung einer 12ß-Hydroxygruppe in
den Aglykonteil von 12-Desoxyherzglykosiden in einfacher und überlegener Weise fähigen neuen Mikroorganismenstamm
und ein neues einfaches und im Großbetrieb wirtschaftlich durchführbares überlegenes mikrobiologisches Verfahren zur
Herstellung von therapeutisch wertvollen in der 12ß-Stellung eine Hydroxygruppe aufweisenden Herzglykosiden unter Verwendung
des ersteren zu schaffen.
Die Erfindung beruht darauf, daß es überraschenderweise gelungen ist, aus einem Waldboden einen solchen Streptomycesstamm
zu isolieren und heranzuzüchten, welcher die Fähigkeit hat, bei aerober Gärung beziehungsweise Fermentation eine
12ß-Hydroxygruppe in den Aglykonteil von 12-Desoxyherzglykosiden einzuführen. Taxonomisch ist der neue Stamm auf
Grund seiner nachfolgend ausführlich beschriebenen Eigenschaften als Streptomyces praecox anzusehen (vergleiche
Waksman: The Actinomycetes, Vol. 2y 1961).
Gegenstand der Erfindung ist daher der bei aerober Gärung zur Einführung einer 12ß-Hydroxygruppe in den
Aglykonteil von 12-Desoxyherzglykosiden fähige aus Waldböden erhältliche Stamm Streptomyces praecox, hinterlegt am
4. Juni 1974- unter der Bezeichnung Streptomyces
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praecox MNG 127 bei der Nationalen Stammsammiung des
ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszägos Közegeszsegügyi Intezet), mit den folgenden
charakteristischen Eigenschaften:
Morphologie: Die aus den Hyphen der Luftmyzelien entspringenden Sporenträger zeigen monopodiale Verzweigungen,
die einzelnen Zweige sind kurz, zu etwa 50% sind sie rankenförmig
und zu 50% bestehen sie aus 2 bis 5 Schleifen aufweisenden
lockeren oder kompakten Spiralen, die Sporen sind glattwandig und ellipsoidförmig, ihre Größe ist
0,95 bis 1,00 ux 1,10 bis 1,28 /i;
an Saccharose-Nitrat-Agar nur zerstreutes Wachstum der Kolonien, das Luftmyzel ist cremefarbig, die Nährbodenmyzelien
sind hell zimtfarbig, kein lösliches Pigment wird gebildet;
an Tyrosin-Agar kein Wachstum;
an Nähr-Agar Wachstum mit mittelmäßiger Geschwindigkeit, es entwickeln sich keine Luftmyzelien, die Nährbodenmyzelien
sind farblos mit wachsartiger Oberfläche, es entsteht kein lösliches Pigment;
an Glucose/Asparägin-Agar sehr schnelles Wachstum, die
Luftmyzelien haben eine staubige Oberfläche und spinnengewebeartige
Form, sowohl die Luftmyzelien, als auch die Nährbodenmyzelien sind drappfarbig (ist eine braune Farbe),
es entsteht kein lösliches Pigment;
an Bouillon-Agar schnelles Wachstum der Kolonien, es entsteht
kein Luftmyzel, die Nährbodenmyzelien bilden eine sehr dünne Schicht und sind schleimig, kein lösliches
Pigment diffundiert in den Agar;
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an Kartoffel/Glucose-Agar schnelles Wachstum, die Luftmyzelien
sind anfangs weiß, später zimtfarbig und schließlich drappfarbig, die Nährbodenmyzelien sind
drapp- beziehungsweise zimtfarbig, es entsteht kein lösliches Pigment;
an Sabouraud/Glucose-Agar Wachstum mit mittelmäßiger Geschwindigkeit,
Luftmyzelien bilden sich nur langsam und spärlich mit weißer Farbe aus, die Nährbodenmyzelien sind
cremefarbig, kein lösliches Pigment;
an Löffler'schem geronnenem Molkenährboden gutes Wachstum,
keine Luftmyzelien, die Nährbodenmyzelien sehen wie Bakterienkolonien aus und haben eine wachsartige Oberfläche,
es entsteht kein lösliches Pigment, die proteolytische Wirkung ist minimal;
an Cellulose als einziger Kohlenstoffquelle gutes
Wachstum;
positive Gelatineverflüssigung;
an Kartoffelschnitten schnelles Wachstum, zimtfarbige
Luftmyzelien, kein lösliches Pigment;
an Blut-Agar graubraune Kolonien mit wachsartiger Oberfläche
mit Durchmessern von 1 mm, nach 1-wöchiger Bebrütung bei 260C keine Sporenbildung, schwache ß-Hämolyse;
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Sf-
2921P52
Kohlenstoffquellenassimilation
D-Glucose
D-Galaktose
Saccharose
Maltose
Lactose
Eaffinose
Sorbose
Cellobiose
Trehalose
Melibiose
Melecitose -(^
lösliche Stärke
D-Xylose
L-Arabinose
L-Rhamnose
Galaktit
^T-Mannit Inosit
Salicin
οί-Me thyl-D-gLucosid
gute Assimilation gute Assimilation gute Assimilation sehr gute Assimilation sehr gute Assimilation
gute Assimilation sehr gute Assimilation
schwache Assimilation
gute Assimilation sehr gute Assimilation gute Assimilation
gute Assimilation sehr gute Assimilation
im Nähr-Agar gut diffundierendes
braunes Pigment
schwache Assimilation
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DR. STEPHAN G. BESZfDES PATENTANWALT
ZUGELASSENER VERTRETER AUCH BEIM EUROPAISCHEN PATENTAMT
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8060
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25- Oktober 1979 P 29 21 052.4
P 1 221
P 1 221
NAOHQEREiCHT
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung von 12ß-Hydroxycardenolidverbindungen der
allgemeinen Formel
909883/0617 INSPECTED
X für Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe
steht und
R Wasserstoff oder einen Rest der allgemeinen Formel
Es folgen Seiten 8 bis 20 der ursprünglichen Unterlagen vom
23. Mai 1979 unter Berücksichtigung der mit der Eingabe vom 10. Oktober 1979 beantragten
Änderungen
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909883/0617
OH
OH
III ,
in welchletzteren R^ Wasserstoff oder einen
Acetylrest bedeutet,
darstellt,
welches dadurch gekennzeichnet ist, daß CardenoIodverbindungen
der allgemeinen Formel
- 10 -
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XO
worin X und R wie oben festgelegt sind, in einem wäßrigen Medium mit einer belüfteten und gerührteny zse
submersen* Kultur des erfindungsgemäßen Stammes in Berührung
gebracht und dann das erhaltene biologisch aktive hydroxylierte Produkt aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt
wird.
Der wichtigste Vorteil der Erfindung besteht darin,
daß sie die wirtschaftliche Herstellung von therapeutisch wirksamen Herzglykosiden ermöglicht. Bei der Gewinnung von
Lanatosid C aus der Pflanze Digitalis lanata bleiben immer große Mengen des therapeutisch wertlosen Lanatosides A
zurück und bei der Herstellung von Digoxin wird das
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ORIGINAL INSPECTED
therapeutisch, ebenfalls wertlose Digitoxin als Nebenprodukt
erhalten. Durch die Anwendung des erfindungsgemäßen
Verfahrens können aus diesen wertlosen Nebenprodukten
therapeutisch wertvolle Herzglykoside erhalten werden.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
können der Stamm Streptomyces praecox oder Varianten desselben unter Verwendung von Nährbodenbestandteilen, deren
Eignung zum Züchten von Streptomyceten bekannt ist, gezüchtet werden. So können als Energiequellen vorteilhaft
Glucose, Maltose, Galaktose, Lactose, Stärke und/oder Dextrin eingesetzt werden. Als Stickstoffquellen können
organische Stoffe natürlicher Herkunft, wie Caseinhydrolysat,
Sojamehl, Erdnußmehl, Maisquellwasser, Peptone und/oder Hefeauszüge, sowie ferner synthetische Produkte, wie
Aminosäuren, Harnstoff oder Ammoniumsalze, dienen. Die
Nährbodenbestandteile können in verschiedenen Kombinationen verwendet werden. Es ist zweckmäßig, im Nährboden auch
anorganische Salze, insbesondere Phosphate und/oder Kalium-, Calcium-, Magnesium- und/oder Eisensalze, mit zu
verwenden. Die Mengen und das Mengenverhältnis der Kohlenstoffquelle
und der Stickstoffquelle im Nährboden können innerhalb weiter Grenzen (von etwa 0,5 bis 4 Gew.-%) variiert
werden. Das Absinken des pH-Wertes der Gärflüssigkeit kann durch einen Zusatz von Galciumcarbonat im Nährboden verhindert
werden.
Die Gärung kann von 20 bis 400C, insbesondere aber bei
der für Streptomyceten günstigen Temperatur von 28 bis JO0C,
durchgeführt werden. Die Züchtung kann in geschüttelten Erlenmeyerkolben oder in mit einem Rührwerk ausgerüsteten
Gärvorrichtungen erfolgen. Die Luftzufuhr kann durch
- 12 -
kräftiges Schütteln der Kolben beziehungsweise bei— - submerser gärung in Gärvorrichtungen durch Einblasen von
Luft in das Gärmedium erfolgen. Die hydroxylierende Aktivität der Mikroorganismen kann durch mehrmaliges
Umimpfen der Kultur auf frische Nährböden gesteigert werden.
Das zu hydroxylierende Substrat kann zu der schon voll entwickelten Kultur oder während der Phase des kräftigen
Wachstumes zugegeben werden; dasselbe Ergebnis wird aber auch dann erzielt, wenn das Substrat schon vor dem Anfang
des Wachstumes dem Nährboden zugesetzt wird, da das Wachstum der Kultur durch die Gegenwart von Herzglykosiden
nicht beeinflußt wird. Es kann ferner auch in der Weise gearbeitet werden, daß die ausgewachsene Kultur vom Nährboden
durch Filtrieren abgetrennt und in einer Pufferlösung suspendiert wird und dann das Substrat dieser Suspension
zugesetzt wird. Die Sauerstoff Versorgung des Reaktionsgemisches
und die geeignete Temperatur müssen aber in jedem Fall sichergestellt werden.
Als als Substrat dienende Cardenolidverbindungen können beliebige 12-Desoxyherzglykoside der allgemeinen
Formel II oder auch die entsprechenden Aglycone selbst, wie Digitoxin, oi-Acetyldigitoxin oder Digitoxigenin, eingesetzt
werden. Die als Substrat einzusetzende Cardenolidverbindung wird zweckmäßig in Lösung in einem mit Wasser
mischbaren organischen Lösungsmittel, zum Beispiel Äthanol oder Methanol, dem Gärmedium zugeführt; die Umsetzung kann
aber auch dann mit gutem -Ergebnis durchgeführt werden,
wenn die feingepulverte Verbindung in Suspension in Wasser dem Gärmedium zugesetzt wird.
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ORIGINAL INSPECTED
2921Q52
Die ä-s Produkt des Gärverfahrens erhaltene in der
12ß-Stellung eine Hydroxygruppe aufweisende Verbindung der allgemeinen Formel I kann durch Extrahieren mit einem
mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, vorteilhaft Chloroform, Dichlormethan oder Äthylacetat, aus der Gärflüssigkeit
gewonnen werden. Nach dem Einengen der so erhaltenen organischen Lösung und nach dem Chromatographieren
des Rückstandes kann das erhaltene rohe Produkt durch Umkristallisieren
gereinigt werden.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Es wurde der Stamm Streptomyces praecox MNG 127 an
einem
1,Q Gew.-% Glucose
0,2 Gew.-% Casamin
0,1 Gew.-% Fleischextrakt
0,01 Gew.-% Lanatosid A und
1,7 Gew.-% Agar
enthaltenden Nährboden gezüchtet. Eine Abschwemmung der
auf Schrägagar bereiteten Sporen in 5 cm destilliertem
Wasser wurde als Impfstoff für die submerse Kultur verwendet .
100 cm* einer 2 Gew.-% Sojamehl, 3 Gew.-% Glucose und
0,5 Gew.-% Calciumcarbonat enthaltenden Nährlösung (Nährlösung "S") wurden mit 1 cm der obigen Suspension
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beimpft. Vor dem Impfen wurde die Nährlösung, deren pH-Wert 7 war, 25 Minuten lang bei 120°C sterilisiert.
Die Züchtung der Streptomyceten erfolgte bei 28°C auf
einem Schütteltisch mit einer Amplitude von 2,5 cm und 300 Umdrehungen/Minute. Nach 2 Tagen dauernder Bebrütung
wurde die Kultur mit einer Lösung "von 50 mg Digitoxin in
3 > ο
2 cm Methanol versetzt und sie wurde bei 37 C weitergeschüttelt.
Das Fortschreiten der biochemischen Reaktion wurde durch die dünnschichtchromatographische Analyse des
Chloroformauszuges von täglich entnommenen Proben des Mediums verfolgt. Zu diesem Zweck wurden Platten von Kieselgel
HFoc/, (E. Merck, Darmstadt) verwendet; als Laufmittel
diente ein Gemisch von Cyclohexan, Äthylacetat und absolutem Äthanol im Volumverhältnis von 35 : 55 J 10. Die Flecke
des Umsetzungsproduktes wurden durch Verwendung einer essigsauren Anisaldehydlösung bei 105°C sichtbar gemacht.
In dem auf Grund der dünnschichtchromatographischen .Analyse
als vom Gesichtspunkt der Digoxinbildung am günstigsten erscheinenden Zeitpunkt, welcher etwa 90 Stunden nach der
Zugabe des Digitoxines lag, wurde die Gärung beendet. Aus den aus 40 geschüttelten Kolben erhaltenen 4 1 Gärflüssigkeit
wurden die abgesetzten Bestandteile durch Zentrifugieren abgetrennt und mit 500 cm Methanol extrahiert und
die methanolische Lösung wurde zur Trockne eingedampft. Die beim Zentrifugieren erhaltene überstehende Flüssigkeit
wurde 3-mal mit je 3 1 Chloroform extrahiert und die Auszüge wurden vereinigt. In dieser vereinigten Chloroformlösung
wurde auch der Trockenrückstand des obigen Methanolauszuges gelöst und die Lösung wurde über wasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet und bei 40 C unter Vakuum eingedampft. Der ölige Rückstand wurde in 10 cnr eines Gemisches
von Chloroform und Methanol im Volumverhältnis von 1 : 1 aufgenommen und auf 20 g Silicagel (zur Säulenchromatographie
geeignete Qualität) auftrocknen gelassen. Das das
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- Vr-
rohe Produkt aufweisende Silicagel wurde in eine Säule mit einer Höhe von 70 cm und einem Durchmesser von 4 cm
eingebracht. Das Chromatographieren wurde mit trockenem Träger begonnen und in aufsteigender Richtung durchgeführt.
Anfangs wurde als Lösungsmittel ein Gemisch von Cyclohexan, Ithylacetat und absolutem Äthanol im Volumverhältnis von
35 : 55 : 2,5 verwendet, dessen Volumverhältnis dann linear zu 35 ι 55 ' 10 geändert wurde, bis ein Eluatvolumen von
1 100 cm erreicht war. Danach wurde das Volumverhältnis
der Lösungsmittel während des weiteren Eluierens unverändert gelassen, aber die anfängliche Durchflußgeschwindigkeit
von 30 cm /Stunde auf 20 cmVStunde vermindert. Das unverändert gebliebene Digitoxin erschien in den Fraktionen
von 960 bis 1 070 cm , dann wurde aus den Fraktionen von
■χ
1 070 und 1 150 cm^ das Hauptumsetzungsprodukt Digoxin und
aus den nachfolgenden Fraktionen das ebenfalls gebildete 7ß-Hydroxydigoxin erhalten.
Die Digoxin enthaltenden Fraktionen wurden 2 Tage lang auf -20°C gehalten; während dieser Zeit schied sich das
rohe Digoxin (330 mg) in Form von nadeiförmigen Kristallen
aus. Die Mutterlauge wurde unter Vakuum eingedampft, der
•z
ölige Rückstand wurde in 5 cm Chloroform gelöst und der
Lösung wurde Cyclohexan bis zur beginnenden Trübung zugetropft. Die Trübung wurde durch die Zugabe von einigen
Tropfen Methanol aufgehoben und das Gemisch wurde auf -200C abgekühlt und zum Kristallisieren stehengelassen.
In 2 Tagen schieden sich 140 mg Digoxin in kristalliner Form aus. Die beiden rohen Produktfraktionen wurden vereinigt
und aus heißem 80%-igem Methanol umkristallisiert. So wurden 450 mg kristallines Digoxin mit einem Schmelzpunkt
- 16 -
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von 245 bis 25O0C und einem [p^-Wert von +10,8°
(c = 1, Pyridin) erhalten.
Ultrarotspektrum (KBr): 3 400 cm"1,
3 090 cm"1,
1 620 cm"1,
1 270 cm"1,
3 090 cm"1,
1 620 cm"1,
1 270 cm"1,
820 cm
-1
3 510 cm"1, 1 720 cm"1,
1 400 cm"1, 860 cm"1 und
Das aus dem erhaltenen kristallinen Produkt durch saure Hydrolyse hergestellte Dipoxigenin zeigte die folgenden
Spektraldaten:
Spitzenwerte des Massenspektrums: 390 (M+), 372 (30%),
354 (70%), 262 (42%), 2^9 (40%), 201 (100%),
147 (40%) und 111 (41%)
UV-Spektrum (in konzentrierter Schwefelsäure): max.
228 nm, 388 nm
317
und
Magnetisches Kernresonanzspektrum [nmrJ
(in Dirnethylsulfoxyd):
=0,7 s (18-Me) ppm,
0,9 s (19-Me) ppm,
3,85 (3-H) ppm,
4.05 s (14-0H) ppm, 4,2 d (3-OH) ppm,
4.6 d (12-0H) ppm, 4,9 s (21-H) ppm 5,8 s (22-H) ppm .
und
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Aus dem Eindampf rückst and der 7ß-Hydroxydigoxin enthaltenden
Fraktionen wurden nach dem Umkristallisieren aus 80%-igem Methanol 175 mg kristallines Produkt mit einem
Schmelzpunkt von 210 bis 217°C und einem [Ö6JD -Wert von
+16,1° (c - 1, Pyridin) erhalten.
Das aus dem erhaltenen kristallinen Produkt durch saure
Hydrolyse hergestellte 7ß-Hydroxydigoxigenin zeigte die folgenden Spektraldaten:
Spitzenwerte des
Mas s e nsp ektrums:
Mas s e nsp ektrums:
(M+, 3%), 281 (36%),
(30%) und 163, (43%) .
Ultrarotspektrum (KBr):
570 cm"1,
910 cm"1,
600 cm"1,
310 cm"1,
910 cm"1,
600 cm"1,
310 cm"1,
cm
-1
3 370 cm"1, 1 710 cm"1,
1 430 cm"1, 860 cm"1 und
Magnetisches Kernresonanzspektrum [nmr]
(in Dimethylsulfoxyd):
(in Dimethylsulfoxyd):
cT= 0,7 s (18-Me) ppm, 0,9 s (19-Me) ppm, 3,9 (3-H) ppm,
4,25 d (3-OH) ppm, 4,65 cL (12-0H) ppm,
4,9 s (21-H) ppm, 5,3 s (14-0H) ppm, 5,5 a (7-OH) ppm
5,8 s (22-H) ppm
und
- 18 -
UV-Spektrum (in konzentrierter
Schwefelsäure): λ,ηαν : 250 mn, 380 nm und
460 nm .
Die Züchtung des Stammes Streptomyces praecox MNG-127
und die mikrobiologische Umsetzung des zugesetzten Substrates wurden unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen
durchgeführt. Zu je 100 car ausgewachsene Kultur
wurden als Substrat 20 mg o6-Acetyldigitoxin in Lösung in
1 cnr Äthanol zugegeben. Die Gärung wurde 4 Tage lang fortgesetzt,
dann wurde das erhaltene Produkt in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise extrahiert und chromatographisch
gereinigt, jedoch mit dem Unterschied, daß der Lösungsmittelgradient in der Weise eingestellt wurde, daß das anfängliche
Volumverhältnis von 35 : 55 : 2,5 des Gemisches von Cyclohexan,
Äthylacetat und absolutem Äthanol bis zum Abfließen
7,
von 1 600 cm Eluat auf 35 J 55 s 8 verdünnt war; im weiteren
Verlauf des Eluierens wurde dann dieses Verhältnis beibehalten. Die von 1 550 bis 1 770 cm Eluatvolumen gesammelten
Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft; der Rückstand wurde aus 80%-ige'm Methanol kristallisiert; das erhaltene
kristalline Produkt konnte auf Grund seiner dünnschichtchromatographischen Eigenschaften als oC-Acetyldigoxin identifiziert
werden. Das Produkt wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie
weiter gereinigt. Das so erhaltene analytisch reine oi-Acetyldigoxin hatte einen Schmelzpunkt von 224 bis 229 C
und einen [ρθη Wert von ^8,2 (c = 1, Pyridin).
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Das nach, der Hydrolyse dieses Produktes erhaltene Genin zeigte dieselben physikalisch-chemischen Daten wie
das nach dem Beispiel 1 erhaltene Dxgoxigenin.
Von einer an einen Kartoffelextrakt und Glucose enthaltendem
Schrägagar gewachsenen 5 bis 6 Wochen alten Kultur
des Stammes Streptomyces praecox MNG 127 wurde mit 10 em
sterilem destilliertem Wasser eine Suspension hergestellt. Mit je 1 cm dieser Suspension wurden in 500 cur Erlenmeyerkolben
je 100 cm einer 0,8 Gew.-% staubförmigen Sojaextrakt und 3 Gew.-% Glucose enthaltenden sterilisierten Nährlösung
(PS-Nährlösung) beimpft. Die Nährlösung, deren pH-Wert vor dem Sterilisieren 7>0 war, wurde vor dem Impfen
45 Minuten bei 1200C sterilisiert; die Sterilisierung der
in der Nährlösung zu verwendenden Glucose erfolgte getrennt
in 50%-iger Lösung 30 Minuten bei 1200C.
Der staubförmige Sojaextrakt wurde wie folgt hergestellt:
Extrahiertes Sojamehl wurde durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,4- mm gesiebt und in Leitungswasser
suspendiert. Die 10% Mehl enthaltende Suspension wurde
1 Stunde unter einem Druck von 1 atü erhitzt, dann auf
370C abgekühlt und mit 0,4% Pankreatin 2 Stunden lang unter ständigem Rühren hydrolysiert, wobei der pH-Wert des
Reaktionsgemisehes mit nach Bedarf zugesetztem Natriumhydroxyd
während der Hydrolyse auf 7»5 bis 8,0 gehalten
wurde. Nach der Beendigung der Hydrolyse wurde das Gemisch zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit unter Zer-
- 20 -
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stäubung getrocknet. Der Stickstoffgehalt des so gewonnenen pulverförmigen Sojaextraktes betrug 9%·
Die Bebrütung des Stammes Streptomyces praecox MNG 127
im beimpften Kolben erfolgte bei 32°C auf einem Schütteltisch
mit einer Amplitude von 2,5 cm und 300 Umdrehungen/Minute.
Mit der unter diesen Bedingungen in 24 Stunden voll ausgewachsenen 400 cnr Schüttelkultur wurden in
einer 10 1 Laboratoriumsgärvorrichtung aus Glas 5 1 der
oben genannten Nährlösung (PS-Nährlösung), welche außer dem Sojaextrakt und der Glucose in diesem Fall auch 0,2 Gew.-%
Palmöl zur Verhinderung des Schäumens enthielt, beimpft. Die Gärung wurde bei 32°C unter Belüftung mit 5 l/Minute
steriler Luft und unter Rühren mit 350 Umdrehungen/Minute
1 Tag fortgesetzt, dann wurde die Temperatur der Kultur auf 37°C erhöht und es wurde eine durch Filtrieren sterilisierte
Lösung von 2,5 g Digitoxin in 100 cm Methanol zugesetzt. Nach 2 Tagen langem Bebrüten wurde die Gärflüssigkeit
filtriert und das Filtrat 2-mal mit je 4 seines VoIu-
mens Benzol und anschließend 3-mal mit je -y seines Volumens
Chloroform extrahiert. Aus dem Chloroformauszug wurden
750 mg Digoxin und 440 mg 7ß-Hydroxydigoxin erhalten.
P at ent ansprüche
909883/0617
Claims (3)
1.) Bei aerober Gärung zur Einführung einer 12ß-Hydroxygruppe
in den Aglykonteil von 12-Desoxyherzglykosiden fähiger aus Waldböden erhältlicher Stamm Streptomyces
praecox, hinterlegt am 4. Juni 1972J- unter der Bezeichnung
Streptomyces praecox MRG 12? bei der
Nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszägos
Közegeszsegügyi Intezet), mit den folgenden charakteristischen
Eigenschaften:
Morphologie: Die aus den Hyphen der Luftmyzelien entspringenden
Sporenträger zeigen monopodiale Verzweigungen, die einzelnen Zweige sind kurz, zu etwa
50% sind sie rarikenf örmig und zu 50% bestehen sie aus
2 bis 3 Schleifen aufweisenden lockeren oder kompakten Spiralen, die Sporen sind glattwandig und ellipsoidf
örmig, ihre Größe ist 0,95 bis 1,00 u χ 1,10 bis 1,28 ja;
an Saccharose-Nitrat-Agar nur zerstreutes Wachstum der
Kolonien, das Luftiayzel ist cremefarbig, die Nährbodenmyzelien
sind hell zimtfarbig, kein lösliches Pimgent wird gebildet;
an Tyrosin-Agar kein Wachstum;
an Nähr-Agar Wachstum mit mittelmäßiger Geschwindigkeit,
es entwickeln sich keine Luftmyzelien, die Nährboden-Myzelien sind farblos mit wachsaifcLger Oberfläche,
es entsteht kein lösliches Pigment;
- 22 3/0817
-3g- 2821052
χ
an Glucose/Asparagin-Agar sehr schnelles Wachstum,
die Luftmyzelien haben eine staubige Oberfläche und spinnengewebeartige Form, sowohl die Luftmyzelien,
als auch die Nährbodenmyzelien sind drappfarbig, es entsteht kein lösliches Pigment;
an Bouillon-Agar schnelles Wachstum der Kolonien,
es entsteht kein Luftmyzel, die Nährbodenmyzelien bilden eine sehr dünne Schicht und sind schleimig,
kein lösliches Pigment diffundiert in den Agar;
an Kartoffel/Glucose-Agar schnelles Wachstum, die
Luftmyzelien sind anfangs weiß, später zimtfarbig und schließlich drappf arbig, die Nährbodenmyzelien
sind drapp- beziehungsweise zimtfarbig, es entsteht kein lösliches Pigment;
an Sabouraud/Glucose-Agar Wachstum mit mittelmäßiger
Geschwindigkeit, Luftmyzelien bilden sich nur langsam und spärlich mit weißer Farbe aus, die Nährbodenmyzelien
sind cremefarbig, kein lösliches Pigment;
an Löf f ler' schem geronnenem Molkenährboden gutes
Wachstum, keine Luftmyzelien, die Nährbodenmyzelien sehen wie Bakterienkolonien aus und haben eine
wachsartige Oberfläche, es entsteht kein lösliches Pigment, die proteolytische Wirkung ist minimal;
an Cellulose als einziger Kohlenstoffquelle gutes Wachstum;
positive Gelatineverflüssigung;
- 23 -
909883/0617
-39- 2921051 1
an Kartoffelschnitten schnelles Wachstum, zimtfarbige
Luftmyzelien, kein lösliches Pigment;
an Blut-Agar graubraune Kolonien mit wachsartiger Oberfläche mit Durchmessern von 1 mm, nach. 1-wöchiger
Bebrütung bei 26°C keine Sporenbildung, schwache ß-Hämolyse;
909883/0617
- sr-
Kohlenstoffquellenassimilation
D-Glucose
D-Galaktose
Saccharose
Maltose
Lactose
Raffinose
Sorbose
Cellobiose
Trehalose
Melibiose
Melecitose
lösliche Stärke
D-Xylose
L-Arabinose
L-Rhamnose
Galaktit
JST-Mannit
Inosit
Salicin
06-Me thyl-D-gLucosid.
gute Assimilation gute Assimilation gute Assimilation
sehr gute Assimilation sehr gute Assimilation
gute Assimilation sehr gute Assimilation
schwache Assimilation
gute Assimilation sehr gute Assimilation gute Assimilation
gute Assimilation sehr gute Assimilation
im Nähr-Agar gut diffundierendes
braunes Pigment
schwache Assimilation ·
-25 -
909883/0^17
DR. STEPHAN G. BESZEDES PATENTANWALT
ZUGELASSENER VERTRETER AUCH BEIM EUROPAISCHEN PATENTAMT
PROFESSIONAL REPRESENTATIVE ALSO BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE
3931051
DACHAU BEI MÖNCHEN
-POSTTAEH 1 1 6fi
MONCHENER STRASSE 80 A
Bundesrepublik Deutschland
TELEPHON: DACHAU 4371
Postscheckkonto München {BLZ 70S 100 80)
Konto-Nr. 1 368 71
Bankkonlo-Nr. 906 370 bei der Kreis- und Stadt
Sparkasse Dachau Indersdorf (BLZ 700 SIS 40)
(VIA "Bayerische Landesbank
Girozentrale. München)
25. Oktober 1979 P 29 21 052.4
P 1 221
NACHeERElGHTl
2.) Verfahren zur Herstellung von i2ß~HydroxycardenoIodverbindungen
der allgemeinen Formel
I ,
909883/0617 - 25a -
292105?
NACHeEREtCHTJ
X für Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe steht "und
R Wasserstoff oder einen Rest der allgemeinen Formel
- 26 -
Es folgen Seiten 26 bis 28 der ursprünglichen Unterlagen vom 23. Mai 1979 unter Berücksichtigung
der mit der Eingabe vom 10. Oktober 1979 beantragten Änderung
909883/0617
2921Q52
CH-
CH
OH
OH
in weIchletzterer R. Wasserstoff
oder einen Acetylrest bedeutet,
oder einen Acetylrest bedeutet,
darstellt,
dadurch gekennzeichnet, daß man Cardenolidverbindungen
der allgemeinen Formel
- 27 -
909883/0617
worin X und R wie oben festgelegt sind, in einem
wäßrigen Medium mit einer belüfteten und gerührten*·
-vorzugsweise submersen^ Kultur des Stammes nach
Anspruch 1 in Berührung bringt und dann das erhaltene biologisch aktive hydroxylierte Produkt
aus dem Eeaktionsgemisch abtrennt.
- 28 -
909883/0617
- aar-
3.) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Cardenolidverbindung der allgemeinen
Formel II Digitoxin verwendet.
4·.) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Cardenolidverbindung der allgemeinen Formel II Di-Acetyldigitoxin verwendet.
909883/0617
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
HU78GO1405A HU175474B (hu) | 1978-05-23 | 1978-05-23 | Novyjj mikrobiologicheskijj sposob poluchenija proizvodnykh kardenolida soderzhahhikh gruppu 12-beta-gidroksila |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2921052A1 true DE2921052A1 (de) | 1980-01-17 |
DE2921052C2 DE2921052C2 (de) | 1987-10-29 |
Family
ID=10996859
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19792921052 Granted DE2921052A1 (de) | 1978-05-23 | 1979-05-23 | Bei aerober gaerung zur einfuehrung einer 12 beta -hydroxygruppe in den aglykonteil von 12-desoxyherzglykosiden faehiger aus waldboeden erhaeltlicher mikroorganismenstamm und verfahren zur herstellung von 12 beta -hydroxycardenolidverbindungen |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
CH (1) | CH642978A5 (de) |
DD (1) | DD143927A5 (de) |
DE (1) | DE2921052A1 (de) |
GB (1) | GB2023144B (de) |
HU (1) | HU175474B (de) |
NL (1) | NL7904103A (de) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2943817A1 (de) * | 1978-10-30 | 1980-05-14 | Richter Gedeon Vegyeszet | Bei gaerung in submerser kultur zur einfuehrung der 12 beta -hydroxygruppe und ggf. 7 beta -hydroxygruppe in den aglykonteil von herzglykosiden bzw. in deren aglykone selbst und zur abspaltung der d- glucosegruppe und acetylgruppe von primaeren digitalisglykosiden, der d-glucosegruppe von purpureaglykosiden und der acetylgruppe von acetylderivaten von sekundaeren digitalisglykosiden faehige aus boeden erhaeltliche mikroorganismenstaemme und verfahren zur mikrobiologischen herstellung von 12 beta -hydroxycardenolidverbindungen |
WO1996015253A1 (de) * | 1994-11-14 | 1996-05-23 | Schering Aktiengesellschaft | Verfahren zur herstellung von 1-hydroxymethyl-1.4-androstadien-3.17-dion |
-
1978
- 1978-05-23 HU HU78GO1405A patent/HU175474B/hu not_active IP Right Cessation
-
1979
- 1979-05-21 DD DD21303179A patent/DD143927A5/de not_active IP Right Cessation
- 1979-05-22 CH CH477179A patent/CH642978A5/de not_active IP Right Cessation
- 1979-05-23 NL NL7904103A patent/NL7904103A/xx not_active Application Discontinuation
- 1979-05-23 GB GB7918023A patent/GB2023144B/en not_active Expired
- 1979-05-23 DE DE19792921052 patent/DE2921052A1/de active Granted
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
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Agr. Biol. Chem. 29, 1965, 783 * |
Chem. Pharm. Bull. 8, 1960, 530 * |
Helv. Chim. Acta 41, 1960, 297 * |
Nature 184, 1959, 469 * |
WAKSMAN: The Actionomycetes, Vol. 2, 1961 * |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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DE2943817A1 (de) * | 1978-10-30 | 1980-05-14 | Richter Gedeon Vegyeszet | Bei gaerung in submerser kultur zur einfuehrung der 12 beta -hydroxygruppe und ggf. 7 beta -hydroxygruppe in den aglykonteil von herzglykosiden bzw. in deren aglykone selbst und zur abspaltung der d- glucosegruppe und acetylgruppe von primaeren digitalisglykosiden, der d-glucosegruppe von purpureaglykosiden und der acetylgruppe von acetylderivaten von sekundaeren digitalisglykosiden faehige aus boeden erhaeltliche mikroorganismenstaemme und verfahren zur mikrobiologischen herstellung von 12 beta -hydroxycardenolidverbindungen |
WO1996015253A1 (de) * | 1994-11-14 | 1996-05-23 | Schering Aktiengesellschaft | Verfahren zur herstellung von 1-hydroxymethyl-1.4-androstadien-3.17-dion |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB2023144A (en) | 1979-12-28 |
DE2921052C2 (de) | 1987-10-29 |
CH642978A5 (de) | 1984-05-15 |
HU175474B (hu) | 1980-08-28 |
DD143927A5 (de) | 1980-09-17 |
NL7904103A (nl) | 1979-11-27 |
GB2023144B (en) | 1982-11-03 |
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