DE2943817A1 - Bei gaerung in submerser kultur zur einfuehrung der 12 beta -hydroxygruppe und ggf. 7 beta -hydroxygruppe in den aglykonteil von herzglykosiden bzw. in deren aglykone selbst und zur abspaltung der d- glucosegruppe und acetylgruppe von primaeren digitalisglykosiden, der d-glucosegruppe von purpureaglykosiden und der acetylgruppe von acetylderivaten von sekundaeren digitalisglykosiden faehige aus boeden erhaeltliche mikroorganismenstaemme und verfahren zur mikrobiologischen herstellung von 12 beta -hydroxycardenolidverbindungen - Google Patents
Bei gaerung in submerser kultur zur einfuehrung der 12 beta -hydroxygruppe und ggf. 7 beta -hydroxygruppe in den aglykonteil von herzglykosiden bzw. in deren aglykone selbst und zur abspaltung der d- glucosegruppe und acetylgruppe von primaeren digitalisglykosiden, der d-glucosegruppe von purpureaglykosiden und der acetylgruppe von acetylderivaten von sekundaeren digitalisglykosiden faehige aus boeden erhaeltliche mikroorganismenstaemme und verfahren zur mikrobiologischen herstellung von 12 beta -hydroxycardenolidverbindungenInfo
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Description
ZUGELASSENER VERTRETER MONCHENER STRASSE 8OA
AUCH BEIM EUROPAISCHEN PATENTAMT
Konto Nr. 1 368 71
sparkaue Dachau Indersdorf (BLZ 700 515 40)
(VIA Bayerische Landesbank
P 1 265 Beschreibung
zur Patentanmeldung
RICHTER GEDEON VEGYESZETI GYAR R.T. Budapest, Ungarn
betreffend
Bei Gärung in submerser Kultur zur Einführung der
12ß-Hydroxygruppe und gegebenenfalls 7ß-Hydroxygruppe in den Aglykonteil von Herzglykosiden beziehungsweise in deren Aglykone selbst und zur Abspaltung der D-Glucosegruppe und Acetylgruppe von
primären Digitalisglykoside^ der D-Glucosegruppe
von Purpureaglykosiden und der Acetylgruppe von Acetylderivaten von sekundären Digitalisglykosiden
fähige aus Böden erhältliche Mikroorganismenstämme und Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von
^ß-Hydroxycardenolidverbindungen
Die Erfindung betrifft bei Gärung in submerser Kultur zur Einführung der 12ß-Hydroxygruppe und gegebenenfalls
030 0 2 0/0714
Al-
7ß-Hydroxygruppe in den Aglykonteil von Herzglykosiden
beziehungsweise in deren Aglykone selbst und zur Abspaltung der D-Glucosegruppe und Acetylgruppe von primären
Digitalisglykoside^ der D-Glucosegruppe von Purpureaglykosiden
und der Acetylgruppe von Acetylderivaten von sekundären Digitalisglykosiden fähige aus Böden erhältliche
neue Mikroorganismenetämme und ein neues Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 12ß-Hydroxycardenolidverbindungen
unter Verwendung dieser Mikroorganismenstämme .
Es ist bekannt, daß einige Cardenolidverbindungen pflanzlichen Ursprunges, zum Beispiel Lanatosid-C und
Digoxin, unmittelbar als Arzneimittel verwendet werden können, während andere, wie das Lanatosid-A, das Acetyldigitoxin
und das Digitoxin, nur durch vorherige chemische oder mikrobiologische Umsetzung therapeutisch verwendbar
gemacht werden können. Diese Umsetzungen richten sich auf die Abspaltung der Glucose- beziehungsweise
Acetylgruppe der primären Glykoside, besonders aber die Hydroxylierung der 12-Desoxyglykoside.
Derartige Umsetzungen umfassende Verfahren sind bereits bekannt. So ist ein Hydrolyseverfahren zum Beispiel
in der deutschen Patentanmeldung P 29 32 577-7 beschrieben
Nach diesem Verfahren kann beispielsweise das Lanatosid-A auf mikrobiologischem Weg durch die Verwendung von
Streptomyces griseolus, hinterlegt am 6. Dezember 1977 unter der Bezeichnung Streptomyces griseolus MNG 168 bei
der Nationalen Mikroorganismenstammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen, in Digitoxin
überführt werden.
Nach den Japanischen Patentschriften 42 24 498, 42 22 611, 42 22 612, 42 22 613 und 42 22 614 kann
- 3 030020/0714
-AS-
Digitoxin durch Hydroxylieren mit Hilfe der Mikroorganismen-Btämme
Streptomyces diastatochromogenes, Streptomyces
owasiensis, Trichocladium asperum, Mortierella isabellina
beziehungsweise Circinella muscae in Digoxin überführt werden.
Nach der deutschen Patentanmeldung P 29 21 052.4 können
aus Digitoxin beziehungsweise Acetyldigitoxin mit Hilfe einer submersen Kultur von Streptomyces praecox, hinterlegt
an 4. Juni 197^ unter der Bezeichnung Streptomyces
praecox MNG 127 bei der Nationalen Mikroorganismenstammsammlung
des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen, Digoxin und Acetyldigoxin hergestellt werden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Mikroorganismenstämme,
welche neben einer 12-Oxygenasewirksamkeit
und 7-0xygenasewirksamkeit auch eine ß-Glykosidasewirksamkeit
und eine Desacetylasewirksamkeit aufweisen und so in einfacher und überlegener Weise fähig sind, bei
Gärung in submerser Kultur die 12ß-Hydroxygruppe und gegebenenfalls 7ß-Hydroxygruppe in den Aglykonteil von Herzglykosiden
beziehungsweise in deren Aglykone selbst einzuführen und die D-Glucosegruppe und Acetylgruppe von primären
Digitalisglykosiden, die D-Glucosegruppe von Purpureaglykosiden und die Acetylgruppe von Acetylderivaten von
sekundären Digitalisglykosiden abzuspalten, und ein neues einfaches überlegenes Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung
von 12ß-Hydroxycardenolidverbindungen unter Verwendung der ersteren, durch welches Cardenolidverbindungen
der primären und sekundären Digitalisglykosidreihen in einer einzigen Gärstufe in 12ß-Hydroxygruppen und gegebenenfalls
7ß-Hydroxygruppen aufweisende Cardenolidverbindungen
der sekundären Digitalisglykosidreihe überführt werden können, zu schaffen.
(J 3 0 (! 2 0 / 0 7
%■
Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung,
daß einige aus verschiedenen Böden isolierbare Strahlenpilzkulturen, und zwar die Stämme Streptomyces
purpurascens KA-26, Streptomyces purpurascens KA-43,
Streptomyces purpurascens KA-82, Streptomyces purpurascens
KC-I57 und Streptomyces alboniger AB-3I8-ST neben der
12-Oxygenasewirksamkeit und 7-Oxygenasewirksamkeit auch
eine B-Glykosidasewirksamkeit und Desacetylasewirksamkeit
aufweisen.
Gegenstand der Erfindung sind daher die bei Gärung in submerser Kultur zur Einführung der 12B-Hydroxygruppe und
gegebenenfalls 7B-Hydroxygruppe in den Aglykonteil von
Herzglykosiden beziehungsweise in deren Aglykone selbst und zur Abspaltung der D-Glucosegruppe und Acetylgruppe
von primären Digitalisglykosiden, der D-Glucosegruppe von Purpureaglykosiden und der Acetylgruppe von Acetylderivaten
von sekundären Digitalisglykosiden fähigen aus Baden erhältlichen Mikroorganismenstämme
a) Σtreptomyces purpurascens KA-26, hinterlegt
am 26. September 1978 unter der Bezeichnung
Streptomyces purpurascen6 KA-26 MNG 179 bei der Nationalen Mikroorganismenstammsammlung
des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszagos Közegeszsegügyi Intezet),
b) Streptomyces purpurascens KA-43, hinterlegt
am 26. September 1978 unter der Bezeichnung Streptomyces purpurascens KA-43 MNG 178 bei
der Nationalen Mikroorganismenstammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen
(Orszagos Közegeszsegügyi Intezet),
U 3 0 0 2 0 / 0 7 1 4
- 2343817
. SO-
c) Streptomyces purpurascens KA-82, hinterlegt am 26. September 1978 unter der Bezeichnung
Streptomyces purpurascens KA-82 MNG 177 bei
der Nationalen Mikroorganismenstammsaminlung
des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszagos Közegeszsegügyi Intezet),
d) Streptomyces purpurascens KC-157» hinterlegt
am 26. September 1978 unter der Bezeichnung Streptomyces purpurascens KC-157 MNG 176 bei
der Nationalen Mikroorganismenstammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen
(Orszagos Közegeszsegügyi Intezet^ und
e) Streptomyces alboniger AB-318-ST, hinterlegt am 26. September 1978 unter der Bezeichnung
Streptomyces alboniger AB-318-ST MNG 180 bei der Nationalen Mikroorganismenstammsammlung
des ungarischen Lsndesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszagos Közegeszsegügyi Intezet),
mit den folgenden charakteristischen Eigenschaften:
(J 3 (Π)? Π /07 1 A
| Eigenschaften | a) Streptomyces purpurascens KA-26 MIC 179 |
b) Streptomyces purpurascens KA-43 MNG 178 |
c) Streptomyces purpurascens KA-82 MNG 177 |
d) Streptomyces purpurascens Kc-157 rsm 176 |
| Hefeextrakt/Malzextrakt- Sporen- -ΑεβΓ träger- Haferflocken-Agar morpho- Stärke-Agar mit an- logie organischen Salzen Glycerin/Asparagin- -Agar |
Spiratyp Spiratyp Spiratyp Typ Reti- |
Typ Reti- naculum apertum Spiratyp Spiratyp Typ Reti- naculum apsetum |
Spiratyp Spiratyp Spiratyp Spiratyp |
Typ Reti- naculum μιιμιΊ.ίιγπ Spiratyp Spiratyp Typ Reti- nacu3inn apertun |
| Sporenoberflächenmorphologie | stachelig | stachelig | stachelig | stachelig |
| Hefeextrakt/Malzextrakt- Farbe -Agar des Haferflocken-Agar Luft- myzeles ·) stärke~ABar mit an organischen Salzen Glycerin/Asparagin-Agar |
rot [R] (7ca); violßtt [V] (H ca) rot [R] (5ca) rot [R] (7ca; 3ca) vgeiß [W] (13ba) |
rot [R] (7ca) rot [R] (5ca) rot [R] (7ca; 3ca) weiß [W] (13ba) |
rot [R] (7ca); violett (V] (11 ca) rot [R] (5ca) rot [R] (7ca; 3ca) weiß [W] (13ba) |
rot [R] (7ca); violett [V] (11 ca) rot [R] (5ca) rot [R] (5ca; 7ca) weiß [W] (13ba) |
| - 7 - |
| Eigenschaften | a) Strqptomycee pui'purascens J&*26 MNG 179 |
Lj) Streptomycee purpuraacens KA-43 MNG 17Ö |
q) Streptomyces purpuruscens KA-82 MJG 177 |
d) Streptoinyces putpurescens KC-157 «IC 176 |
| Farbe des Substratmyzeles |
gelb-braun [Y~b] + + blau [tiue] ^>nt [led] ··) |
gelb-braun [Y-b] + + blau |b)uB] Ο rot [red) ··) |
gelb-braun [Y-b] + + biax [bOLie]o rot [nsd] ··) |
gelb-braun [Y-b] + + blau [bLB]«rot[i«i] ··) |
| Indikator- HCl Charakter des aabstrab- Na0H myzeles |
von purpurfarben zu rot von purpurfarben zu blau |
von purpurfarben zu rot von purpurfarben zu blau |
von purpurfarben zu rot von purpurfarben zu violett |
von purpurfarben zu rot von purpurfarben j zu blau |
Fortsetzung der Tabelle 1
| Eigenschaften | a) Streptomyces | b) Streptomyces | c) Streptomyces | d) Streptomyces |
| P'jrpurascens | purpurascens | purpurascens | purpurascens | |
| KA-26 MNG 179 | KA-43 MNG 178 | KA-82 MNG 177 | KC-157 MNG 176 | |
| Hefeextrakt/Malzextrakt- -Agar |
violett | blaßviolett | violett | violett |
| Lösliches Haferflocken-Agar | blau | blau | blau | blau |
| Pigment starke.Agar mit an_ organischen Salzen |
violett | violett | violett | violett |
| Glycerin/Asparagin-Agar | blaßviolett | blaßviolett | blaßviolett | blaßviolett |
| Indikator- hq ι | von violett | von violett | von violett | von violett |
| Charakter | zu orangefarbig | zu orangefarbig | zu orangefarbig | zu orangefarbig |
| non "lne"]if}Tm NaOH Pigmentes |
von violett BU blau |
von violett zu blau |
von violett zu blau |
von violett
zu blau |
|
Pepton/Hefeextrakt/Eisen-
Melanoid- _Agar pigment Tyrosin-Agar |
+ | + | + | + |
- 9 Fortsetzung der Tabelle
| Eigenschaften | a) Streptomyces | Assimilation | b) Streptomycea | Assimilation | c) Streptomyces | Assimilation | d) Streptomyces | Assimilation |
| purpurascens | Assimilation | purpurascens | Assimilation | purpurascens | Assimilation | purpurascens | Assimilation | |
| KA-26 mc 179 | Assimilation | KA-43 MiG 178 | Assimilation | KA-82 ITC 177 | Assimilation | Kc-157 rm 176 | Assimilation | |
| D-Glucose | gute | Assimilation | gute | Assimilation | gute | Assimilation | gute | Assimilation |
| L-Arabinose | gute | Assimilation Assimilation |
gute | Assimilation Assimilation |
gute | Assimilation Assimilation |
gute | Assimilation Assimilation |
| Verwertung V-*?1™* | gute | Assimilation | gute | Assimilation | gute | Assimilation | gute | Assimilation |
| von Kohlen- i-Inosit | gute | Assimilation | gute | Assimilation | gute | Assimilation | gute | Assimilation |
| stoff- D-Mannit quellen D-Fructose |
gute gute |
Assimilation | gute gute |
Assimilation | gute gute |
Assimilation | gute gute |
Assimilation |
| Saccharose | gute | gute | gute | gute | ||||
| Rhamnose | gute | gute | gute | gute | ||||
| Raffinose | gute | gute | gute | gute |
*) die Teile nach den Strichpunkten beziehen sich jeweils auf die bei der
Alterung des Myzeles entstehende Farbe
·*) die ganzen Bezeichnungen unmittelbar vor und nach <—) beziehen sich jeweils
auf die bei der Alterung des Myzeles entstehende Farbe
e) Streptomyces alboniger AB-318-STj
Morphologie: Die Sporenträger sind vom Typ Rectus flexibi
lis, lang, gerade, mit mehr als 50 Sporen Je Sporenkette,
welche morphologischen Eigenschaften an Hefeextrakt/Malzextrakt-Agar,
Haferflocken-Agar, Glycerin/Asparagin-Agar
und an anorganische Salze enthaltendem Stärke-Agar zu
beobachten sind, nach elektronenmikroskopischen Beobachtungen haben die Sporen glatte Oberflächen;
die Farbe des Luftmyzeles gehört nach den vergleichenden
Untersuchungen mit dem Farbenrad nach Tresner-Backus zur
Serie "Weiß" ["White"] (W), welche Farbe an sämtlichen oben erwähnten Standardnährböden identifizierbar ist;
das Substratmyzel zeigt an verschiedenen Nährböden die folgenden Farben:
Hefeextrakt/Malzextrakt-Agar: graugelb (Co 81);
gelb-braun [Y-b],
Haferflocken-Agar: nicht bestimmbar,
Glycerin/Asparagin-Agar: gelb (Co 68; Co 70)
gelb-braun [Y-b],
Stärke-Agar mit
anorganischen Salzen: gelb (Co 37» Co 67)
gelb-braun [Y-b];
das Pigment des Substratmyzeles hat keinen Indikatorcharakter, an den oben erwähnten Nährböden kann keine
Exopigmentbildung beobachtet werden;
- 11 -
Ü30020/07U
an Pepton/Eisen-Agar und an Tyrosin-Agar wird kein
Pigment vom Melanintyp gebildet, die Melanoidpigmentreaktion ist negativ;
die folgenden Kohlenhydrate werden gut verwertet: D-Glucose, L-Arabinose, D-Xylose, i-Inosit, Mannit,
D-Fructose und Raffinose, während Saccharose und Rhamnose nicht verwertet werden.
Oben und im folgenden wurde die Bestimmung der Farbe
des Substratmyzeles und des löslichen Pigmentes der Empfehlung des Komitees des International Streptomyces
Project, abgekürzt ISP (auch im folgenden hat diese Abkürzung dieselbe Bedeutung), gemäß auf der Grundlage der
Veröffentlichung von H. Prauser (Zeitschrift für allg. Mikrobiologie 4^ [1964], 95) sowie ferner der Farbtafel
von P. Baumann (Baumann's Farbtonkarte Atlas II für die Philatelie) und der Veröffentlichung von
J. H. Szabo und M. Marton (Int. Bull. Bact. Norn. Tax.
14 [1964] 17) durchgeführt. Die Farben des Luftmyzeles
sind nach dem Farbenrad von Tresner-Backus (Tresner und Backus': Appl. Microbiol. J_1 [1963], 335; E. Küster:
Int. Bull. Bact. Nom. Tax. _14 [1964], 1) angegeben.
"Co" ist eine auf den Farbcharakter sich beziehende inter national anerkannte Bezeichnung, wie es auch bei den
daneben stehenden Zahlenwerten der Fall ist.
Wie es aus den Daten der obigen Tabelle 1 hervorgeht, zeigen die dort beschriebenen Stämme völlige taxonomische
Identität untereinander. Die Sporenträger gehören morphologisch dem Spiratyp an, nur an den Nährböden
Hefeextrakt/Malzextrakt-Agar beziehungsweise
Glycerin/Asparagin-Agar zeigt sich in einigen Fällen
der Typ Retinaculum apertum. Sowohl das Substratmyzel als auch das lösliche Pigment haben Indikatorcharakter.
- 12 Ü 3 O Π 2 O / O 7 1 4
In der folgenden Tabelle 2 sind die Standardbe-Bchreibungen
der Stämme Streptomyces species KA-26,
Streptomyces species KA-43» Streptomyces species KA-82 und Streptomyces species KC-157 sowie des Typenstammes von Streptomyces purpurascens (ISP 5310) zum Vergleich zusammengefaßt (wobei sich die Bezeichnung ISP auf die vom Komitee des International Streptomyces Project einheitlich ausgearbeitete Stammbeschreibung bezieht).
Streptomyces species KA-43» Streptomyces species KA-82 und Streptomyces species KC-157 sowie des Typenstammes von Streptomyces purpurascens (ISP 5310) zum Vergleich zusammengefaßt (wobei sich die Bezeichnung ISP auf die vom Komitee des International Streptomyces Project einheitlich ausgearbeitete Stammbeschreibung bezieht).
0 3 η η ν η / υ ν ι k
- 13 Tabelle
O ο 2 co
| Eigenschaften • |
Streptomyces species KA-26 Streptomyces species KA-43 Streptomyces species KA-82 Streptomyces species KC-157 |
Streptomyces purpurascens ISP 5310 (zum Vergleich) |
+ | + | - MX - |
| Sporentragermorphologie . | Spiratyp | Spiratyp | |||
| Sporenoberflächen- morphologie |
stachelig | stachelig | |||
| Farbe des Luftmyzeles *) | rot [R] (3ca; 5ca; 7ca); violett [V] (11ca) |
rot [R]; weiß [W] | |||
| Farbe des Substrat- myzelea ·*) |
gelb-braun [Y-b] + + blau [blue] <*—>rot [red]·*) |
gelb-braun [Y-b] + + blau [blue] <-> rot [red] ··) |
|||
| Indikatorcharakter HC1 des Substratmyzeles NaOH |
von violett zu purpurfarben von rot zu violett |
von purpurfarben zu rot von purpurfarben zu blau |
|||
| Lösliches Pigment *) | rot; blau | violett | |||
| Indikatorcharakter des löslichen Pigmentes |
wie beim Substratmyzel | ||||
| Melatjoidpigment Peptxn/Hefeextrakt/Eisen-Agar Mäanoidpigment Tyrosin-Agar |
|||||
- 14 Fortsetzung der Tabelle 2
| Eigenschaften | Streptomyces species ΚΛ-26 | otreptoinyces |
| ütreptoinyces species KA-4 3 | purpurascens | |
| Streptomyces species KA-82 | isp 5310 | |
| Streptomyces species KC-157 | (zum Vergleich) | |
| D-Glucose | gute Assimilation | gute Assimilation |
| L-Arabinose | gute Assimilation | gute Assimilation |
| D-Xylose | gute Assimilation | gute Assimilation |
| Verwertung von i-Inosit | gute Assimilation | gute Assimilation |
| Kohlenstoff- Mannit | gute Assimilation | gute Assimilation |
| <3uellen D-Fructose | gute Assimilation | gute Assimilation |
| Saccharose | gute Assimilation | gute Assimilation |
| Rhamnose | gute Assimilation | gute Assimilation |
| Raffinose | gute Assimilation | gute Assimilation |
*) die Teile nach den Strichpunkten beziehen sich jeweils auf die bei der Alterung des Myzeles entstehende Farbe
'*) die ganzen Bezeichnungen unmittelbar vor und nach£—>
beziehen sich jeweils auf die bei der Alterung des Myzeles entstehende Farbe
Auf Grund der Übereinstimmung der wichtigsten
diagnostischen Merkmale wurden die obigen erfindungsgemäßen Stämme als Streptomyces purpurascens identifiziert
diagnostischen Merkmale wurden die obigen erfindungsgemäßen Stämme als Streptomyces purpurascens identifiziert
Die wichtigsten diagnostischen Merkmale des Stammes Streptomyces species AB-3I8-ST sind in der folgenden
Tabelle 3 zusammen mit den entsprechenden Merkmalen des Typenstammes von Streptomyces alboniger (ISP 50^3) zum
Vergleich zusammengefaBt.
Tabelle 3 zusammen mit den entsprechenden Merkmalen des Typenstammes von Streptomyces alboniger (ISP 50^3) zum
Vergleich zusammengefaBt.
- 16 -
3 η ·Ί / f.' / η 7 ]
- 16 Tabelle 3
| Eigenschaften | Streptomyces ΑΒ-318-εΤ |
Streptomyces alboniger ISP 5043 (zum Vergleich) |
| Sporenträgennorphologie | Sporenträger vom Typ Rectus flexibilis |
Sporenträger vom Typ Rectus flexibilis |
| Sporenoberflachenmorphologie | glatt | glatt |
| Farbe des Luftmyzeles | weiß [W] | weiß [W] |
| Farbe des Substratmyzeles | gelb-braun [Y-b] | gelb-braun [Y-b] |
| Indikatorcharakter des Substratmyzeles |
- | - |
| Lösliches Pigment | - | - |
| Indikatorcharakter des löslichen Pigmentes |
- | - |
| Melanoidpigment Pepton/Hefeextrakt/Eisen-Agar |
- | - |
| Melanoidpigment Tyrosin-Agar | - | - |
- 17 Fortsetzung der Tabelle 3
| Eigenschaften | D-Glucose | Streptomyces | Streptomyces |
| L-Arabinose | AB-3I8-ST | alboniger | |
| D-Xylose | isp 5043 | ||
| Kohlenhydrat- i-Inosit | (zum Vergleich) | ||
| verwertung Mannit | gute Assimilation | gute Assimilation | |
| D-Fructose | gute Assimilation | gute Assimilation | |
| Saccharose | gute Assimilation | abweichende Ergebnisse | |
| Rhamnose | gute Assimilation | gute Assimilation | |
| Raffinose | gute Assimilation | gute Assimilation | |
| gute Assimilation | abweichende Ergebnisse | ||
| - | - | ||
| - | - | ||
| gute Assimilation | abweichende Ergebnisse |
- 18 -
- 76 -
Auf Grund der Daten der obigen Tabelle 3 wurde der
obige erfindungsgemäße Stamm als Streptomyces alboniger bestimmt.
obige erfindungsgemäße Stamm als Streptomyces alboniger bestimmt.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur
mikrobiologischen Herstellung von 12ß-Hydroxycardenolidverbindungen der allgemeinen Formel
OH
Y für Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe steht und
R Wasserstoff oder einen Rest der
Formeln
Formeln
I) 3 P!: vfi / η 7 I 4
C =
- 20 -
(J 3 Π ·ί ;>
π / 0
beziehungsweise
CB,
CH
OH
OH
OH
bedeutet,
welches dadurch gekennzeichnet ist, daß Cardenolidverbindungen
der allgemeinen Formel
- 21 -
υ3η
2(i /07 u
• 36
X für Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe
steht und
Rx, Wasserstoff oder einen Rest der Formeln
- 22 -
ZT-
CH,
OH
030Ü20/0714
·3Ϊ·
OH
III beziehungsweise IV bedeutet,
0 30 1?(i /0 7 1 A
- 24 -
•39-
mit der weiteren Maßgabe, daß3
im Falle daß
X für eine Hydroxygruppe steht,
R^ nur einen Rest der Formel V bedeuten
kann,
mit einer submersen Kultur eines der erfindungsgemäßen
Stämme gegoren beziehungsweise fermentiert wird, wobei
zur Herstellung der 12ß-Hydroxycardenolidverbindungen der
allgemeinen Formel I, bei welchen R für Wasserstoff steht, stets Cardenolidverbindungen der allgemeinen Formel I, bei
welchen R^. Wasserstoff bedeutet, eingesetzt werden, und
die Umsetzungsprodukte in an sich bekannter Weise aus der Gärflüssigkeit isoliert werden.
Besonders vorteilhaft ist das erfindungsgemäße Verfahren auf die Herstellung der 12ß-Hydroxycardenolidverbindungen
der sekundären Digitalisglykosidreihe der allgemeinen Formel I aus den 12-Desoxycardenolidverbindungen
der primären Digitalisglykosidreihe der allgemeinen Formel II anwendbar.
Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist die Sicherstellung des Arbeitens unter aseptischen Bedingungen am wichtigsten. Die erfindungsgemäßen
Streptomycesstämme können unter den beim Züchten von Strahlenpilzen allgemein üblichen Bedingungen
gezüchtet werden.
Ein kräftiges Wachstum wird erreicht, wenn als Kohlenstoff- und Energiequelle diejenigen oben erwähnten
Zucker, welche von diesen Stämmen gut verwertet werden
- 25 -
können, wie Glucose, Arabinose, Xylose, Mannit, Fructose,
Saccharose oder Raffinose, verwendet werden. Als Stickstoffquelle
können Haselnußmehl, Maiequellwasser, Peptone oder ferner vorteilhaft Sojamehl, Casein oder deren Hydrolysate,
Aminosäuren oder anorganische Ammoniumsalze verwendet werden.
Der pH-Wert des Nährbodens wird zweckmäßig auf 6 bis 8, vorzugsweise 7» eingestellt; zum Erhöhen der
Pufferkapazität kann Calciumcarbonat zugesetzt werden.
Zur Vermeidung eines etwaigen Schäumens kann zum Nährboden, zweckmäßig schon vor dem Sterilisieren, ein
Pflanzenöl, vorteilhaft Palmöl oder Sonnenblumenöl, oder ein synthetisches Schaumverhütungsmittel zugegeben werden.
Der Nährboden wird zweckmäßig 30 bis 60 Minuten bei 120°C
sterilisiert.
Die Züchtung der Kultur und die Umsetzung werden zweckmäßig bei den für die Streptomyceten günstigen
Temperaturen von 30 bis 40 C, insbesondere 32°C, durchgeführt;
dabei können auch bei der Züchtung der Kultur 320C und bei der Umsetzung 37°C angewandt werden. Es ist
wichtig, daß die submerse Kultur während des gesamten Vorganges eine entsprechende Luftzufuhr erhält, was durch
Schütteln des Kolbens oder entsprechendes Rühren der in die Gärvorrichtung eingeleiteten sterilen Luft erreicht
werden kann.
Die Umsetzung des Substrates wird zweckmäßig mit einer schon kräftig entwickelten Kultur, vorteilhaft bei einem
Trockensubstanzgehalt des Gärmediums von 1 Gew.-%, begonnen.
Mit der Zugabe des Substrates kann aber auch schon während des Wachstumes der Kultur angefangen werden.
- 26 -
030020/07U
Die Zugabe des Substrates zum Gärmedium kann in Form
einer Lösung desselben in einem mit Wasser mischbaren und die Umsetzung nicht hemmenden Lösungsmittel, welche vor
der Zugabe durch Filtrieren oder Erwärmen sterilisiert wurde, erfolgen. Bei der Zugabe des Substrates kann vorteilhaft
das in der gleichzeitig eingereichten der ungarischen Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen GO-1427
entsprechenden deutschen Patentanmeldung beschriebene Verfahren angewandt werden. So kann durch eine entsprechende
Wahl des Lösungsmittels die Konzentration des Substrates im Gärmedium erheblich erhöht werden.
Das Fortschreiten der Umsetzung kann mit Hilfe von entnommenen Proben verfolgt werden. Nach dünnschichtchromatographischer
Trennung wird der Cardenolidverbindungsgehalt
der Proben durch photometrische Messung der mit Dixanthylharnstoff erhaltenen Farbe bestimmt. Die
praktische Durchführung dieses Verfahrens ist ebenfalls in der oben genannten der ungarischen Patentanmeldung
GO-1427 entsprechenden deutschen Patentanmeldung sowie auch im weiter unten folgenden Beispiel 1 ausführlich
beschrieben.
Die Gärung kann beendet werden, wenn die erwähnte analytische Prüfung den völligen Verbrauch des Substrates
und die maximale Anreicherung des gewünschten Produktes anzeigt. Dann wird, die Gärflüssigkeit abfiltriert und das
erhaltene Produkt mit einem organischen Lösungsmittel aus der Zellmasse beziehungsweise aus der Gärflüssigkeit
extrahiert. Der Trockenrückstand des Auszuges kann durch Chromatographieren beziehungsweise Umkristallisieren gereinigt
werden. (Bei der Reinigung können die entstandenen Nebenprodukte gut abgetrennt werden).
Der wichtigste Vorteil der Erfindung besteht darin,
- 27 -
030020/07U
daß die überführung von primären 12-Desoxycardenolidverbindungen
in die in der 12ß-Stellung eine Hydroxygruppe
aufweisenden entsprechenden sekundären Cardenolidverbindungen statt der bisher erforderlichen 2 aufeinanderfolgenden
mikrobiologischen Umsetzungen in einer einzigen Gärstufe durchgeführt werden kann. Der Wegfall einer
Gärstufe bedeutet auch das Einsparen einer aufwendigen und Materialverluste verursachenden Extraktions- und
Aufarbeitungsstufe, so daß durch die Erfindung eine wesentlich einfachere und höhere Ausbeuten liefernde Herstellung
von 12ß-Hydroxycardenolidverbindungen ermöglicht
wird.
Ein weiterer wichtiger Vorteil der Erfindung liegt darin, daß das energieverbrauchende Gären unter Trocknen
bei der Aufarbeitung der Droge, durch welche die überführung der primären Glykoside in sekundäre Glykoside
erleichtert werden soll, bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ebenfalls fortfällt.
Ferner kann durch die Anwendung des erfindungsgemäßen
Verfahrens die Herstellung des vom therapeutischen Gesichtspunkt wichtigsten Digoxines unabhängig von der
schwankenden Glykosidzusammensetzung der Droge (also vom Wert des Verhältnisses der Gesamtglykoside zum Lanatosid-C)
immer in einfacher Weise sichergestellt werden.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß erfindungsgemäß nicht nur die Lanatoside, sondern auch die Purpureaglykoside
in therapeutisch hochwertige Produkte überführt werden können.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.
- 28 -
030020/07H
- 26 -
■ te.
Es wurde aus einer auf Kartoffel/Dextrose-Schrägagar
gezüchteten 3 bis ^ Wochen alten Kultur des Stammes
Streptomyces purpurascens KA-43, hinterlegt am
26. September 1978 unter der Bezeichnung Streptomyces
purpurascens KA-43 MNG 178 bei der Nationalen Mikroorganismenstamms
ammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszagos Közegeszsegügyi Intezet),
mit 10 cm* sterilem Wasser eine Suspension bereitet. In einem 500 cm' Erlenmeyer-Kolben wurden 100 cnr "PS"-Nährboden
der folgenden Zusammensetzung sterilisiert.
0,8 Gew.-% Sojapulver 3,0 Gew.-% Glucose
pH-Wert vor der Sterilisierung: 7»0 .
Die Sterilisierung erfolgte 45 Minuten bei 1200C. Die
Glucose wurde in einer 50%-igen wäßrigen Lösung getrennt sterilisiert, und zwar 30 Minuten bei 1200C.
Das Sojapulver ist wie folgt beschrieben hergestellt worden. Aus einem durch ein Sieb mit einer Maschenweite
von 0,4 mm durchgesiebten extrahierten Sojagrieß wurde mit Leitungswasser eine 10%-ige Suspension bereitet und
diese zunächst durch 1 Stunde langes Erhitzen unter einem Druck von 1 atü und dann nach dem Abkühlen auf 37°C
2 Stunden lang mit 0,4 Gew.-% Pankreatin hydrolysiert, wobei der pH-Wert durch Zugabe von Natronlauge auf
7,5 bis 8,0 gehalten wurde. Dann wurde die Suspension zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit unter Zerstäuben
zur Trockne eingedampft. Das so erhaltene 9 Gew.-% Stickstoff enthaltende Produkt war das verwendete Sojapulver.
- 29 -
030 0 20/07U
Der in der obigen Weise bereitete und sterilisierte
Nährboden wurde im Erlenmeyer-Kolben mit 1 cnr der Mikroorganismensuspension
geimpft und auf einer Flachschüttelmaschine mit einem Ausschlag von 2,5 cm und 300 Umdrehungen/Minute
2 Tage lang bei J>2°C geschüttelt. Dann
wurde eine Lösung von 50 mg Lanatosid-A in 0,5 cm* Dioxan,
welche vorher durch Filtrieren sterilisiert worden ist, zugesetzt, worauf der Kolben noch 4 Tage bei 32°C geschüttelt
und danach die so erhaltene Gärflüssigkeit 2-mal mit je 50 cnr Chloroform extrahiert wurde. Der Glykosidgehalt
des Auszuges wurde nach dünnschichtehromatographischer
Trennung durch photometrische Messung der mit Dixanthylharnstoff erhaltenen Farbe wie folgt beschrieben
ermittelt:
Dünnschichtchromatographi
s ehe Trennung:
Auf einer 0,25 nun dicken Kieselgelschicht (Kieselgel Merck HF-c^
[E. Merck, Darmstadt]) in einer Wanne mit gesättigtem Dampfraum. Laufmittel bei primären Glykosiden:
Chloroform und Methanol im Volumverhältnis von 90 : 10. Laufmittel bei
sekundären Glykosiden: Äthylacetat, Cyclohexan und absolutes Äthanol
im Volumverhältnis von 55 : 35 : 10. Je 3 Läufe wurden durchgeführt.
Von den zu untersuchenden Proben wurden solche Mengen auf die Kieselgelschicht
aufgetropft, daß im aufgetropften Volumen 10 bis 50 /ug der
einzelnen Glykoside zugegen waren.
Nach den 3 Läufen wurde die Schicht
- 30 -
3
/ ι- / 0 7 1 U
■ks·
sorgfältig getrocknet und das Chromatogramm in Joddampf entwickelt.
Die Flecke wurden den Standardproben entsprechend markiert und das Jod wurde in einem Luftstrom
wegsublimiert.
Farbreaktion: Die markierten Flecke wurden abgekratzt und in Reagenzgläser mit
Schliffstopfen aus Glas eingebracht. Je 3 cnr des unten beschriebenen
Dixanthylharnstoffreagens wurden zugesetzt und die Reagenzgläser wurden verschlossen, gründlich
durchgeschüttelt und 3 Minuten lang auf einem siedenden Wasserbad gehalten. Anschließend wurden die
Reagenzgläser in einem kalten Wasserbad abgekühlt und nach dem Durchschütteln scharf zentrifugiert. Die
Farbintensität der klaren überstehenden Flüssigkeit wurde *bei 535 nm im Vergleich zu einer
glykosidfreien Lösung gemessen.
Die glykosidfreie Lösung wurde durch Abkratzen eines "leeren" (keine
Glykoside enthaltenden) in derselben Höhe wie das betreffende Glykosid befindlichen Fleckes von gleich
großer Fläche der Kieselgelschicht in der oben beschriebenen Weise bereitet.
Aus den gemessenen Extinktionswerten
- 31 -
0 3 ',) Γ ι ' ι1 / ;■■ 7 1
. 46-
konnten, unter Berücksichtigung der etwaigen Verdünnung und des aufgetropften
Volumens mit Hilfe des aus der Standardkonzentrationskurve gewonnenen
Faktors die Konzentrationen der einzelnen Glykoside berechnet werden.
Dixanthylharo-
stoffreagens: Es wurden 10 mg Dixanthylharastoff
in einem Gemisch von 50 cnr Essigsäure
und 1 cnr konzentrierter Salzsäure gelöst und die Lösung wurde mit Essigsäure auf 100 cnr aufgefüllt.
Das Reagens wurde vor der Messung jeweils frisch hergestellt.
Der nach der oben beschriebenen Verfahrensweise bestimmte
Digoxingehalt des wie oben angegeben erhaltenen Auszuges war 12 mg.
Es wurde wie im Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch mit dem Unterschied, daß der Kultur an Stelle der
Lösung von Lanatosid-A eine Lösung von 50 mg Acetyldigitoxin
in 1 cnr Dimethylsulfoxyd zugesetzt wurde. Der so erhaltene Auszug enthielt 9 mg Digoxin.
Es wurde wie im Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch mit dem Unterschied, daß der Kultur an Stelle der
- 32 -
o 3 η η 2 ο / ο 7 u
Lösung von Lanatosid-A eine Lösung von 50 mg Purpureaglykosid-A
in 1 cnr Tetrahydrofurfurylalkohol zugesetzt wurde. Der eo erhaltene Auszug enthielt 8 mg Digoxin.
Es wurde wie im Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch
mit dem Unterschied, daß der Kultur an Stelle der Lösung von Lanatosid-A eine Lösung von 50 mg Digitoxin
in 1 cm* Dimethylsulfoxyd zugesetzt wurde. Der so erhaltene
Auszug enthielt 8 mg Digoxin, während 15 mg Digitoxin unverändert geblieben sind.
Es wurde wie im Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch mit dem Unterschied, daß die Mikroorganismen-Suspensionen
an Stelle der Kultur von Streptomyces purpurascens KA.-43 aus Kulturen der folgenden Mikroorganismfnstä'mme
bereitet wurden:
- 33 -
0 3 G :■ 2 η / p 7 u
- 35 -
2343817
Kolben 1: Streptomyces purpurascens KA-26,
hinterlegt am 26. September 1978 unter der Bezeichnung Streptomyces purpurascens
KA-26 MNG 179 bei der Nationalen Mikroorganismenstammsammlung
des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszagos Közegeszsegygyi Intezet),
Kolben 2: Streptomyces purpurascens KA-82,
hinterlegt am 26. September 1978 unter der
Bezeichnung Streptomyces purpurascens KA-82 MNG 177 bei der Nationalen Mikroorganismenstammsammlung
des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszagos Közegeszsegügyi Intezet),
Kolben J>: Streptomyces purpurascens KC-157,
hinterlegt am 26. September 1978 unter der Bezeichnung Streptomyces purpurascens
KC-157 MNG 176 bei der Nationalen Mikroorganismenstammsammlung
des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszagos Közegeszsegügyi Intezet) und
Kolben 4: Streptomyces alboniger AB-3I8-ST,
hinterlegt am 26. September 1978 unter der Bezeichnung Streptomyces alboniger AB-318-St MNG 180 bei der Nationalen Mikroorganismenstammsammlung
des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszagos Közegeszsegügyi Intezet).
1 /
Die in den bo erhaltenen Auszügen gefundenen Mengen von Glykosiden sind in der folgenden Tabelle 4 zusammengestellt.
| Kolben | Lanatosid-A | Mengen in mg von Acetyldigitoxin |
Digitoxin | Diftoxin |
| 1 | 2,1 | 3,0 | 15,3 | 4,2 |
| 2 | 1,8 | 5,5 | 12,4 | 7,3 |
| 3 | 3,6 | 4,1 | 11,3 | 6,1 |
| 4 | - | 1,7 | 16,4 | 3,8 |
Es wurde wie im Beispiel 5 beschrieben gearbeitet, jedoch
mit dem Unterschied, daß den Kulturen an Stelle der Lösung von Lanatosid-A eine Lösung von 50 nig Purpureaglykosid-A
in 1 cm Tetrahydrofurfurylalkohol zugesetzt
wurde.
Die in den so erhaltenen Auszügen gefundenen Mengen von Glykosiden sind in der folgenden Tabelle 5 zusammengestellt.
- 35 -
| Kolben | Men i m VC Purpureaglyko8id-A |
gen η ß >n Digitoxin |
Digoxin |
| 1 | 1,7 | 18,2 | 4 |
| 2 | - | 14,3 | 6,8 |
| 3 | 2,8 | 12,7 | 7,2 |
| 4 | 3,5 | 15,8 | 4,1 |
Es wurde wie im Beispiel 5 beschrieben gearbeitet, jedoch mit dem Unterschied, daß den Kulturen an Stelle der
Lösung von Lanatosid-A eine Lösung von 50 mg Acetyldigitoxin
in 1 cnr Dimethylsulfoxyd zugesetzt wurde.
Die in den so erhaltenen Auszügen gefundenen Mengen von Glykosiden sind in der folgenden Tabelle 6 zusammengestellt.
- je -
| Kolben | Acetyldigitoxin | Mengen in mg von Digitoxin |
Digoxin |
| 1 | 5,2 | 15,8 | 4,6 |
| 2 | 4,5 | 14,5 | 6,4 |
| 5 | 6,1 | 15,5 | 4,8 |
| 4 | 7,5 | 16,0 | 5,7 |
Es wurde wie im Beispiel 5 beschrieben gearbeitet, jedoch
mit dem Unterschied, daß der Kultur an Stelle der Lösung von Lanatosid-A eine Lösung von 50 mg Lanatosid-C
in 1 cnr D:methylsulfoxyd zugesetzt wurde.
Die in den so erhaltenen Auszügen gefundenen Mengen von Glykosiden sind in der folgenden Tabelle 7 zusammengestellt.
- 37 -
'r-Ί U
- υϊ -. 58-
| Kolben * |
Lanatosid-C | Men i m V( |
gen η |
Digoxin |
| 1 | 5,2 | 12,0 | ||
| 2 | 6,0 | 17,1 | ||
| 3 | 2,1 | 18,1 | ||
| 4 | 4,3 | 14,2 |
Es wurde wie im Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, Jedoch mit dem Unterschied, daß die Gärung 2 Tage nach der
Zugabe des Substrates beendet wurde. Die Gärflüseigkeit
wurde mit Chloroform extrahiert. Der Auszug wurde auf einer Kieselgelschicht (Kieselgel HFot-/i , Merck,
Darmstadt) mit einer Dicke von 0,25 mm chromatographiert, wobei als Laufmittel ein Gemisch von Cyclohexan, Äthylacetat
und absolutem Äthanol im Volumverhältnis von 35 s 55 J 10 verwendet wurde. Die Flecke wurden mit
einem Essigsäure/Anisaldehyd-Reagens bei 105°C entwickelt. Auf dem erhaltenen Chromatogramm wurden neben
wenig nicht umgesetztem Lanatosid-A erhebliche Mengen von Acetyldigitoxin, Acetyldigoxin und Digitoxin sowie
wenig Digoxin identifiziert.
030020/071
Es wurde aus einer auf Kartoffel/Dextrose-Schrägagar
gezüchteten 3 biß ^ Wochen alten Kultur des Stammes
Streptomyces purpurascens KA-43, hinterlegt am
26. September 1978 unter der Bezeichnung Streptomyces
purpurascens KA-43 MNG 178 bei der Nationalen Mikroorganismenstammsammlung
des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszagos Közegeszeegügyi Intezet),
mit 10 cnr sterilem Wasser eine Suspension bereitet. In 4 500 cm* Erlenmeyer-Kolben wurden je 100 cnr
"PS"-Nährboden der im Beispiel 1 angegebenen Zsammensetzung sterilisiert und dieser wurde dann mit je 1 cm*
der Mikroorganismensuspension geimpft. Die Kolben wurden 2 Tage lang bei 32°C geschüttelt.
In einer Laboratoriumsgärvorrichtung wurden 5 1 0,2 Gew.-% Palmöl enthaltender "PS"-Nährboden der im
Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung 60 Minuten lang bei 1200C sterilisiert und nach dem Abkühlen mit dem
vereinigten Inhalt der 4 Kolben geimpft.
Der Inhalt der in einem auf 32°C erwärmten Wasserbad gehaltenen Gärvorrichtung wurde unter Belüftung mit
5 l/Minute steriler Luft und Rühren mit 350 Umdrehungen/Minute
1 Tag lang bebrütet und dann wurde eine durch Filtrieren sterilisierte Lösung von 5 g Lanatosid-A
in 25 cm* Dioxan zugesetzt. Nach noch 5 Tage langem Bebrüten
wurde die Gärflüssigkeit abfiltriert.
Das zellenfreie Filtrat wurde 2-mal mit je -* ihres
Volumens Benzol extrahiert. Der mit Benzol erhaltene Auszug enthielt das etwaige nicht umgesetzte Substrat
(Lanatosid-A) sowie das ale Zwischenprodukt erhaltene
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030020/ 07U
Digitoxin und einen Teil der Nebenprodukte.
Anschließend wurde die bereits mit Benzol extrahierte Gärflüssigkeit 3-mal mit je ·* ihres Volumens Chloroform
extrahiert und der Auszug wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum bei
höchstens 500C zur Trockne eingedampft. Der so erhaltene
Rückstand enthielt 40 Gew.-% Digoxin, 14 Gew.-% 7ß-Hydroxydigoxin sowie noch 20 Gew.-% andere Glykoside
von nicht identifizierter Struktur. Lanatosid-A, Acetyldigitoxin beziehungsweise Acetyldigoxin konnten im Rückstand
nicht nachgewiesen werden.
Dieser Rückstand des chloroformischen Auszuges wurde in einem Gemisch von 60 cnr Methanol und 60 cnr Benzol
gelöst und die Lösung wurde mit 400 mg Phenylborsäure versetzt und 5 Minuten stehengelassen. Dann wurde das
Reaktionsgemisch unter ständigem Rühren mit 60 cm* Wasser versetzt. Nach der Trennung der Phasen wurde die
wäßrig-methanolische untere Schicht abgetrennt und mit 60 cm* Benzol extrahiert. Wiederum wurde die untere
Schicht abgetrennt, das Methanol unter Vakuum bei höchstens 500C entfernt und das ausgeschiedene kristalline
Produkt abfiltriert, mit 60 cnr Wasser gewaschen und getrocknet. So wurde 0,75 ß kristallines Digoxin mit einem
|° von +13,6° (c = 10%, in Pyridin) erhalten.
Patentansprüche
030020/07U
Claims (2)
- Patentansprüche12ß-Hydroxygruppe und gegebenenfalls 7ß-Hydroxygruj:pi in den Aglykonteil von Herzglykoside!! beziehunpswei r.( in deren Aglykone selbst und zur Abspslturif der
D-Glucosegruppe und Acetylgruppe von primären
Digitalisglykoside^ der D-Glucosegruppe von
Purpureaglykosiden und der Acetylgruppe von Acetyldcrivaten von sekundären Digitalisglykosiden fähige aus Boden erhältliche Mikroorganismenstänmc-a) Streptomyces purpurascens KA-26, hinterlegt am 26. September 1978 unter der Bezeichnung StreptomyceB purpurascenE KA-26 HNG 179 bei der Nationalen KikroorganienienstemniBamiclung des ungarischen Landesinetitutes für Gesundheitswesen (OrszagoB Közegeszßegügyi Intezet),b) Streptomyces purpurescens KA-4Jt hinterlegt am 26. September 1978 unter der Bezeichnung Streptomyces purpurascens KA-^3 MNG 178 bei der Nationalen MikroorganismenstaromEBmmlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orsrbgos Közegeszsegügyi Intezet),c) Streptomyces purpurascens KA-82, hinterlegt am 26. September 1978 unter der Bezeichnung Streptomyces purpurescens KA-82 MNG 177 bei der Nationalen MikroorganismenBtammsammlung deß ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszagos Közegeszsegügyi Intezet),0 3 0 ü 2 Ü / 0 7 1 A ORIGINAL INSPECTiDDR. STEPHAN G. BESZfDES PATENTANWALTZUGELASSENER VERTRETER AUCH BEIM EUROPAISCHEN PATENTAMTPROFESSIONAL REPRESENTATIVE ALSO BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE8060 DACHAU BEI MÖNCHENPOSTFACX t16« ' —MONCHENER STRASSE 8OABundesrepublik DeutschlandTELEPHON DACHAU 4371Postscheckkonto München IBLZ 700 100 80)Konto-Nr. I 368 71Bankkonto Nr 906 370 bei der Kreis- und Stadtsparkjsse Darhau Inder5dorf (BLZ 700 515 401(VIA Bayerische landesb.inkGirozentrale. MuruJienJ13. November 1979 P 29 43 8I7.3
P 1 265d) Streptomyces purpurascens KC-157» hinterlegt am 26. September 1978 unter der Bezeichnung Streptomyces purpurascene KC-157 HNG I76 bei der Nationalen Mikroorganiemenstammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orezagos Közegeszsegügyi IntezetX unde) Streptomjces alboniger AB-318-ST, hinterlegt am 26. September 1978 unter der Bezeichnung Streptomyces alboniger AB-3I8-ST MNG 180 bei der Nationalen Mikroorganismenstammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Orszagos Közegeszsegügyi Intezet),mit den folgenden charakteristischen Eigenschaften:Ö30020/0714-VIa-Eigenschaften a) Strqpto mycea
puipurascena
K/W 26 KIC 179i b) Streptomycea
purpurascens
iJ^-43 MNG 178c) Streptomyces
purpurascens
KA-82 mi 177d) Str^jtomyces
purpurascens
KC-157 MNG 176Hefeextrakt/Malzextrakt-
Sporen- "" ^&r
träger- Haferflocken-Agar
morpho- Stärke.Agar Bit ω.
logxe organischen Salzen
Glycerin/Aeparagin-
-AgarSpiratyp
Spiratyp
Spiratyp
Typ Reti-Typ Reti-
Spiratyp
Spiratyp
Typ Reti-Spiratyp
Spiratyp
Spiratyp
SpiratypTyp Reti-
Spiratyp
Spiratyp
Typ Reti-Sporenoberflächenmorphologie etachelig stachelig stachelig Hefeextrakt/Malzextrakt-
Farbe -Agar
de8 Haferflocken-Agar
Luft-
myzelÄS ·) Stärke-Agar mit an-
organisehen Salzen
Glycerin/Asparagin-Agarrot [R] (7ca);
violett: [V] (H ca)
rot [R] (5ca)
rot [R] (7ca;
3ca)
weiß [W] (13ba)rot [R] (7ca)
rot [R] (5ca)
rot [R] (7ca;
3ca)
weiß [W] C13ba)rot [R] (7ca);
violett [V] (11 ca)
rot [R] (5ca)
rot [R] (7ca;
3ca)
weiß [W] O3ba)stachelig rot [R] (7ca);
violett [V] (11 ca)
rot [R] (5ca)
rot [R] (5ca-,
7ca)
weiß [W] (IJba)- 41b -Eigenschaftenb) S179 ei) S CItJ-TO ay ce s Luipoieiscens KC--1^ KlG 176Farbe des Substratmyzelesgelb-craun [Y-bj +; geib-oraun [Y-b] + blau [blue] <->icc ^nüj ··) ♦ LLui ^Ue] <r? rot W -urai^ r*-b]b^u "i^ iacgelb-braun [Y-b] + ·) + blau [küus]eioc[led] ··)Indikator Charakter des- HClve1, purpurfarben : von purpuri'arben zu rot ' zu rot;myzelesNaOHvon purpurfarben zu blauvon DurouriaroenVO. ro ure; zu =· P Öle! VO vi zu '_i··.urfurDen ; von purpurfarben zu rotvon purpurfarben zu blau^•curiaroen- 41c -Eigenschaften a) Strtcuc^ycce» -} StreptcEyces c) in-tpto^yces
, T*\1 "1T-I *"^ ι c* r» ^- in o t>" τ nr\i * τ* QQrtCi π α ■* - ■ ι Y^rv ι Τ» 11 C Λ OP Π
V-ZC **r. "9Q -'i_i.7 V\T, "OQ '-'/. _PP ·»'/-. ^79violett
blau
violett
blaßviolettblaSviolett violett
blau ι blau
violett : violett
blaßviolett 1 blaßviolett1 d) Streptomyces
purpurascens
Vr1 ^ CD M>V^ IOCHefeextrakt/Kalzextrakt-
-Agar
Lösliches Haf erf locken-Agar
Pigment stärke-Agar mit an
organischen Salzen
Glycerin/Asparagin-Agarvon violett
von violett
tu blauvon violett ; von violett
zu orangefarbig zu orangefarbig
von violett : von violett
zu blau I zu blauviolett
blau
violett
blaßviolettIndikator— HCl
Charakter
Ώ. NaOH
Pigmentesvon violett
zu orangefarbig
von violett
zu blauPepton/Hefeextrakt/Eisen-
Melaaoid- _Agar
pigment
Tyrosin-Agar+ - 41d -C-OO OEigenschaften a) Strepconyces o) Su-epcomycea Assimilation gute Assimilation OS ci-eptotyces ! f
Assimilationd) Streptomyces Assimilation purpurascens ■ purpurascens
KU-26 MNG 179 KA-43 MN'G 178Assimilation gute Assimilation piirpurascens '
KA-e2 MJG 177 !
1Assimilation purpurascens
KC-157 MNG 176Assimilation D-Glucose gute Assimilation;gute Assimilation gute Assimilation gute Assimilation L-Arabinose gute Assimilation!gute Assimilation gute Assimilation gute Assimilation Verwertung D~xylo8e gute Assimilation gute
Assimilation!guteAssimilation
Assimilationgute Assimilation
Assimilationgute Assimilation
Assimilationvon Kohlen- i-Ino8it gute Assimilation gute Assimilation gute Assimilation gute Assimilation atoff- D-Mannit
quellen
D-Fructosegute
guteAssimilation:gute Assimilation gute
guteAssimilation gute
guteAssimilation Saccharose gute Assimilation gute Assimilation gute Assimilation gute Assimilation Rhamnoee gute gute gute Baffinofie gute gute gute die Teile nach den Strichpunkten beziehen sich Jeweils auf die bei der Alterung des Myzeles entstehende Farbedie ganzen Bezeichnungen unmittelbar vor und nach <—) beziehen sich Jeweils auf die bei der Alterung des Myzeles entstehende Farbe■LD JP-- 41e -2943G17e) Streptomyces alboniger AB-318-STMorphologie: Die Sporenträger Bind vom Typ Rectue flexibilie, lang, gerade, mit mehr ale 50 Sporen Je Sporenkette, welche morphologischen Eigenschaften an Hefeextrekt/llalzextrakt-Agar, Haferflocken-Agar, Glycerin/Asparagin-Agar und an anorganische Salze enthaltendem 6tärke-Agar zu beobachten eind, nach elektroneninikroskopiechen Beobachtungen haben die Sporen glatte Oberflächen;die Farbe des Luftmyzeles gehört nach den vergleichenden Untersuchungen mit dem Farbenrad nach Tresner-Backus zur Serie "Weiß" ["White"] (W), welche Farbe en sämtlichen o^en erwähnten Standardnährboden identifizierbar ist;das Substratmyzel zeigt an verschiedenen Nährböden die folgenden Farben:- 42 -Es folgen Seiten 42 bis 49 der ursprünglichen Unterlagen vom 50. Oktober 19793(l(]?f)/07U2943017- ti -• ί·Hefeextrakt/Malzextrakt-Agar: graugelb (Co 81);gelb-braun [Y-b],Haferflocken-Agar: nicht bestimmbar,Glycerin/Asparagin-Agar: gelb (Co 68; Co 70)gelb-braun [Y-b],Stärke-Agar mitanorganischen Salzen: gelb (Co 37; Co 67)gelb-braun [Y-b];das Pigment des ßubstretmyzeles hat keinen Indikator- Charakter, an den oben erwähnten Nährböden kann keine Exopigmentbildung beobachtet werden;an Pepton/Eieen-Agar und an Tyrosin-Agar wird kein Pigment vom Melanintyp gebildet, die Melanoidpigmentreaktion ist negativ;die folgenden Kohlenhydrate werden gut verwertet: D-Glucose, L-Arabinose, D-Xylose, i-Inosit, Mannit, D-Fructose und Raffinose, während Saccharose und Bhamnose nicht verwertet werden. - 2.) Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 12ß-Hydroxycardenolidverbindungen der allgemeinen Formel(J 3 Π Π 2 Π / O 7■ J.2*43817OHwormY für Wasserstoff c .ier eine Hydroxyg-ruppe steht undR Wasserstoff oder einen Rest der Formelnt) Ί Π ' 7 f) / Γ) 7 1C = OCH-OHu 3 f) i1;; ο / ί ν 1-0-beziehungsweise CH:CH3CH1OHOHOHbedeutet,U 3 0 0 2 0 / 0-4-Ai-dadurch gekennzeichnet, daß man Cardenolidverbindungen der allgemeinen Formelfür Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe steht undWasserstoff oder einen Rest der Formeln2^43817ο Γ^ )—ο /IKUM 20/07 1Λ-CH3CH,CH,OHOHOHOHIII beziehungsweise IV bedeutet,VI ,IJ 3 Π Π 2 i J / Ü 7AS-mit der weiteren Maßgabe, daßj im Falle daßX für eine Hydroxygruppe 6teht,R^ nur einen Rest der Formel V bedeuten kann,mit einer submersen Kultur eines der Stämme nach Anspruch 1 gärt, wobei man zur Herstellung der 12ß- -Hydroxycardenolidverbindungen der allgemeinen Formel I, bei welchen R für Wasserstoff steht, stets Cardenolidverbindungen der allgemeinen Formel I, bei welchen R^. Wasserstoff bedeutet, einsetzt, und die Umsetzungsprodukte in an sich bekannter Weise aus der Gärflüssigkeit isoliert.Ü 3 0 i) 7 Π / 0 7 Mi
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HUGO001428 HU176250B (en) | 1978-10-30 | 1978-10-30 | Process for producing mikrobiologically 12-beta-hydroxycardenolide derivatives |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2943817A1 true DE2943817A1 (de) | 1980-05-14 |
| DE2943817C2 DE2943817C2 (de) | 1988-01-14 |
Family
ID=10996878
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19792943817 Granted DE2943817A1 (de) | 1978-10-30 | 1979-10-30 | Bei gaerung in submerser kultur zur einfuehrung der 12 beta -hydroxygruppe und ggf. 7 beta -hydroxygruppe in den aglykonteil von herzglykosiden bzw. in deren aglykone selbst und zur abspaltung der d- glucosegruppe und acetylgruppe von primaeren digitalisglykosiden, der d-glucosegruppe von purpureaglykosiden und der acetylgruppe von acetylderivaten von sekundaeren digitalisglykosiden faehige aus boeden erhaeltliche mikroorganismenstaemme und verfahren zur mikrobiologischen herstellung von 12 beta -hydroxycardenolidverbindungen |
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|---|---|---|---|---|
| HU190784B (en) * | 1981-09-28 | 1986-11-28 | Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Rt,Hu | Process for the intensification of the microbiological transformation of steroid compounds |
Citations (7)
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|---|---|---|---|---|
| DE2921052A1 (de) * | 1978-05-23 | 1980-01-17 | Richter Gedeon Vegyeszet | Bei aerober gaerung zur einfuehrung einer 12 beta -hydroxygruppe in den aglykonteil von 12-desoxyherzglykosiden faehiger aus waldboeden erhaeltlicher mikroorganismenstamm und verfahren zur herstellung von 12 beta -hydroxycardenolidverbindungen |
| DE2932577A1 (de) * | 1978-08-11 | 1980-02-28 | Richter Gedeon Vegyeszet | Bei gaerung zur abspaltung der d-glucosegruppe und acetylgruppe von primaeren digitalisglykosiden, der d-glucosegruppe von purpureaglykosiden und der acetylgruppe von acetylderivaten von sekundaeren digitalisglykosiden faehiger, aus boeden erhaeltlicher mikroorganismenstamm und verfahren zur mikrobiologischen herstellung von sekundaeren digitalisglykosiden |
| JPH04222611A (ja) * | 1990-12-21 | 1992-08-12 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | フィルター装置 |
| JPH04222613A (ja) * | 1990-03-29 | 1992-08-12 | Boc Group Inc:The | 酸素富化生成流の製造方法 |
| JPH04222612A (ja) * | 1990-03-23 | 1992-08-12 | Boc Group Inc:The | 圧力スイング吸着装置及びこれを用いる空気分離方法 |
| JPH04222614A (ja) * | 1990-03-30 | 1992-08-12 | Boc Group Inc:The | 吸着により流体を精製するための方法と装置 |
| JPH04224498A (ja) * | 1990-12-26 | 1992-08-13 | Kayseven Co Ltd | 船灯状態異常の警報装置 |
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1978
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1979
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- 1979-10-30 DE DE19792943817 patent/DE2943817A1/de active Granted
Patent Citations (7)
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| DE2921052A1 (de) * | 1978-05-23 | 1980-01-17 | Richter Gedeon Vegyeszet | Bei aerober gaerung zur einfuehrung einer 12 beta -hydroxygruppe in den aglykonteil von 12-desoxyherzglykosiden faehiger aus waldboeden erhaeltlicher mikroorganismenstamm und verfahren zur herstellung von 12 beta -hydroxycardenolidverbindungen |
| DE2932577A1 (de) * | 1978-08-11 | 1980-02-28 | Richter Gedeon Vegyeszet | Bei gaerung zur abspaltung der d-glucosegruppe und acetylgruppe von primaeren digitalisglykosiden, der d-glucosegruppe von purpureaglykosiden und der acetylgruppe von acetylderivaten von sekundaeren digitalisglykosiden faehiger, aus boeden erhaeltlicher mikroorganismenstamm und verfahren zur mikrobiologischen herstellung von sekundaeren digitalisglykosiden |
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Non-Patent Citations (3)
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|---|
| Appl. Microbiol. 11, 1963, 335 * |
| Int. Bull. Bact. Nom. Tax. 14, 1964, 17 und 1 * |
| Zeitschrift f. allg. Mikrobiologie 4, 1964, 95 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB2034716B (en) | 1983-01-12 |
| DE2943817C2 (de) | 1988-01-14 |
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| GB2034716A (en) | 1980-06-11 |
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