DD143927A5 - Verfahren zur herstellung von 12beta-hydroxy-cardenolid-verbindungen - Google Patents

Description

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Verfahren zur Herstellung von lSß-hydroxy-Cardenolidverbindungen

Anwendungsgebiet der Erfindung;I_- . ·

Die Erfindimg betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Cardenolidverbindungen der allgemeinen Formel I, worin X Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe und R Wasserstoff oder eine Gruppe der allgemeinen Formel III und in der letzteren Formel R Wasserstoff oder eine Acetylgruppen bedeuten· . - .

Charakteristik „der bekannten technischen. Lösung.ent

Es ist bekannt, daß die handelsüblichen Hersmittel Lanatosid-C, Acetyldigoxin und Digoxin aus den Blättern der Pflanze Digitalis lanata gewonnen weraen₀ Die Blätter dieser Pflanze enthalten ein Gemisch der Glykoside Lanatosid-A,

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-B, -C und -D₀ Es kaian aber unter Einwirkung der anwesenden hydrolysierenden Enzyme auch eine Abspaltung des GIykose-Teils und der Acety!gruppe eintreten, wodurch, dann neben den erwähnten primären Glykosiden auch die vier entsprechenden sekundären Glykoside Digitoxin, Gitoxin, Digoxin und Biginatin im Drog anwesend sind* Das Mengenverhältnis der primärer* au den sekundären Glykoside schwankt in Abhängigkeit von den Züchtungsbedinungen der Pflanze, was aber vom Gesichtspunkt der Technologie der Gewinnung der Glykoside überhrjipt nicht vorteilhaft ist· Dabei verbleibt das Lanatosiä-»A bei der Gewinnung der als Arzneimittel verwendbaren* in der 12ß-Stellung eine Hydroxylgruppe enthaltenden Glykoside als unbrauchbares Nebenprodukt zurück«

Zur Hydroxylierung des Aglykons von 12-Desoxy-Herzglykoßiden können nach den Literaturangaben verschiedene Mikroorganismen verwendet werden. So wurden zu diesem Zweck z.B. Fusarium lini (HeIv. Shim* Acta, £1, 297 /I960/), Gibberella fujikuroii und Melicostylum piriforme (Nature 184"» 4&9 /1959/), Gibberella saubinetti (Chem. Pharm. Bull.'8, 530 /I960/), Oaloneetria decora und Nigrospora sphaerica (Abstr₀ Symposium on the Chem. of Digitalis Cardiac Glycosides, 114 /I960/) vorgeschlagen. Mit der Hydroxylierung des therapeutisch anwendbaren Herzglykosids Digitoxin hat sich aber nur eine japanische Forschergruppe befaßt, welche die Mikroorganismenstämme Streptorayces owashiensis, Streptomyces diastatochromogenes, Mortierella isabellina, Trichocladium asperam und Circinella muscae mit Erfolg zur Herstellung von Digoxin verwendet, hat (Agr_o Biol. Chern, 2^., 783 /1965/)ο -

Ziel .der^Erfindung:

Das Ziel der vorliegenden Erfindung war die Ausarbeitung eines neuen, einfachen und großbetrieblich wirtschaftlich

— 3 «,

anwendbaren Verfahrens' zur Herstellung von therapeutisch wertvollen, in der 12ß-Stellung eine Hydroxylgruppe enthaltenden Herzglykosiden*

Erfindung··*

Die Erfindung wurde dadurch ermöglicht, daß es gelungen ist, aus einem Waldboden einen solchen Streptomycesstamm zu isolieren und heranzuzüchten, welcher die Fähigkeit hat, im Laufe einer aeroben Fermentation eine 12ß-Hydroxylgruppe in den Aglykon-Teil von 12~Desoxy-Herzuglykosiden einzuführen· Taxonomisch ist der neue Stamm auf Grund seiner nachfolgend ausführlich beschriebenen Eigenschaften als Streptomyces praecox zu betrachten (vgl· Waksmant The Actinomycetes, IPo 1· ^, 196I); der Stamm wurde in der Ungarischen nationalen Sammlung von Mikroorganismen unter Er. MG 127 deponiert·

Der neue Stamm zeigt die folgenden charakteristischen Eigenschaften*

Morphologie* die aus den Hyphen der Luftmyzelien entspringenden Sporenträger zeigen monopodiale Verzweigungen, die einseinen Zweige sind kurz·,- in etwa 50 % rankenförmig, in 50"$ bestehen sie aus lockeren oder kompakten, 2 bis 3 Schleifen zeigenden Spiralen. Die Sporen sind glattwändig, ellipsoidförmigs¹· ihre Größe ist 0,95 * 1,00 χ 1,10 - 1,28/U·

An Saccharose-Hitrat-Agar zeigen die Kolonien nur zerstreutes Wachstum, das Luftmyzelium ist-kremfarbig, die Hährbodenmyzelien haben eine helle Zimtfarbe\ kein löo~ liches Pigment wird gebildet·

An Ty ro sin- Agar? kein. Wachs tum<> ' ·..-. .··... An Nähr-Agar wähcst der Stamm mit mittelmäßiger Geschwindigkeit* Es entwickeln sich keine Luftmyzelien, die Hähr-

boden-Myzelien sind farblos, mit wachsartiger Oberfläche; ee entsteht kein lösliches Pigmente

An Glycose-Asparagin~Agar zeigt der Stamm sehr schnelles Wachstum, die Luftmyzelien haben staubige Oberfläche und spinnengewebeartige !Form; sowohl die Luftmyzelien, als auch die Nährbodenmyzelien sind drappfarbig; es entsteht kein lösliches Pigment.

An Bouillon-Agar wachsen die Kolonien schnell; es entsteht kein Luftmyzelium, die Nährbodenmyzelien bilden eine sehr dünne Schicht und sind schleimig; kein lösliches Pigment diffundiert in das Agar.

Kartoffel-Glucose-Agar: schnelles Wachstum; die Luftmyzelien sind anfangs weiß, später zimtfarbig und schließlich drappo Die Nährbodenmyzelien sind drapp- bzw. zimtfarbig; es entsteht kein lösliches Pigment«,

Sabouraud-Glucose-Agars der Stamm wächst mit mittelmäßiger. Geschwindigkeit, Luftmyzelien bilden sich nur langsam und spärlich aus mit weißer Farbe; die Nährbodenmyzelien sind kremfarbig; kein lösliches Pigment«

Löffler¹scher geronnener Molke-Nährbodeni gutes- Y/achstum, kein Luftmyzelien, die Nährbodenmyzelien sehen aus wie Bakterienkolonien und haben wachsartige Oberfläche; ea entsteht kein lösliches Pigment, die proteolytische Wirkung ist minimal«

Cellulose als einzige Kohlenstoffquelle; gutes Wachstum. Gelatineverfliissigungs positive

Kartoffelschnitt: schnelles Wachstum'} zimtfarbige Luftmyzelien, kein lösliches Pigment»

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Blut~Agarj graubraune Kolonien mit wachsartiger Oberfläche, 1 mm Durchmesser; nach einwöchiger Inkubation bei 26⁰G keine Sporenbildung, schwache Beta-Hämolyse»

Assimilation von Kohlens.toffquellens

D-Glucose	+ '	Melesitose	schwach
D-Galaktöse	+.	lösliche Stärke	+
Saccharose		D-XyIose	++
Maltose	++	L-Arabinose	+
Laktose	++	Ii-Ehamnose	-
Raffinose		Galaktit	. -
Sorbose	—	H-Mannit	+
Cellobiose	. -f-	Inosit
Trehalose		Salicin	Θ
Melibiose	-	ώ -Methyl-D- glucosid	schwach

@ im Nähr-Agar gut diffundierendes braunes Pigment + bzw. ++$ gute bzwo sehr gute Assimilation.

Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist also, ein neues Verfahren zur Herstellung: von Cardenolidverbindungen der oben definierten allgemeinen Formel I auf mikrobiologischem Weg, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man Herzglykoside der allgemeinen Formel II, worin R und X die bei der allgemeinen Formel I. angegebenen Bedeutungen haberij in wäßrigem MeäLuni mit einer submersen, belüfteten und gerührten Kultur des Stammes Streptomyces (MjUG-127* deponiert in der Ungarischen Nationalen Sammlung von Mikroorganismen) in Berührung bringt und dann das entstandene, biologisch aktive, hydroxylierte Produkt aus dem Eeaktionsgemisch abtrennt·

Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können der Stamm Streptomyces praecox oder Vari-

anten davon unter Verwendung von zum Züchten von Strepto~ myzeten bekannterweise geeigneten Nährbodenbestandteilen gezüchtet werden* So kann man als Energiequellen vorteilhaft Glycose, Maltose, Galaktose, Laktose, Stärke oder Dextrin einsetzen Als Stickstoffquelle können organische Stoffe natürlicher Herkunft, wie Kaseinhydrolysat, Sojamehl, Erdnußmehl, Maisquellwasser, Pepton oder Hefeextrakt, ferner synthetische Produkte, wie Aminosäuren, Harnstoff oder Ammoniumsalze dienen. Die Mahrbodenbestandteile kö'n-. nen in verschiedenen Kombinationen verwendet werden* Es ist zweckmäßig, dem Eährboden auch anorganische Salze, besonders Phosphate, Kalium-, Calcium-, Magnesium und/oder Eisensalze, zuzusetzen· Die Mengen und das Mengenverhältnis dejr Kohlenstoffquelle und der Stickstoffquelle im Nährboden kann zwischen weiten Grenzen (etwa 0,5 % bis 4 %) variieren. Das Absinken des pH-Wertes der Fermentationsflüssigkeit kann durch das Zusetzen von Calciumcarbonat • zum Nährboden verhindert werden»

Die Fermentation kann zwischen 20⁰C und 4O⁰C, besonders aber bei der für Streptomyzeten günstigen Temperatur von 28 - 30⁰C ausgeführt werden· Die Züchtung erfolgt in geschüttelten Erlenmeyerkolben oder in mit Rührwerk ausgerüsteten Fermentoren· Die Luftzufuhr kann durch intensives Schütteln der Kolben, bzw· bei submerser Fermentation in Fermentoren durch Einblasen von Luft in das Fermentationsmedium erfolgen* Die hydroxylierende Aktivität der Mikroorganismen kann durch mehrmaliger Umimpfen der Kultur auf frischen Nährboden gesteigert werden₀

Das zu hydroxylierende Substrat kann zu der schon voll entwickelten Kultur oder während der Phase des intensiven Wachstums zugegeben werden; das selbe Ergebnis wird aber auch dann erzielt, wenn man das Substrat schon vor dem Anfang des Wachstums zu dem Nährboden zusetzt, da das Wachstum der Kultur durch die Anwesenheiz von Herzglykosiden

nicht beeinflußt wird» Man kann ferner auch so arbeiten, daß man die ausgewachsene Kultur von dein Nährboden durch Filtrieren abtrennt und in einer.Pufferlösung suspendiert und dann das Substrat dieser Suspension zusetzte Die Sau~ erstoffversorgung des Reaktionsgemisches und die geeignete Temperatur muß aber in jedem Fall gesichert werden₀ "

Als Substrat können beliebige 12-Desoxy-Herzgl:ykoside der allgemeinen Formel IX, oder auch die entsprechenden AgIucone selbst, als «^-,Acetyl-digitoxin, Digitoxin oder Digitoxigenin eingesetzt ^erden₀ Me als Substrat einzusetzende Verbindung wird zweckmäßig in einem mit Wasser mischbaren organischen lösungsmittel, z_oB. in Äthanol oder Methanol, gelöst und in dieser Form dem Fermentationsmedium zugeführt; die Reaktion kann aber auch dann mit gutem Ergebnis, ausgeführt werden, wenn, man' die fein gepulverte Verbindung in Wasser suspendiert und in dieser Form dem Fermentationsmedium ansetzt« "

Die als Produkt des Fermentationsverfahrens erhaltene, in der 12ß-Stellung eine Hydroxylgruppe enthaltende Verbindung der allgemeinen Formel I kann durch Extraktion mit einem mit Y/asser nicht mischbaren Lösungsmittel, vorteilhaft mit Chloroform, Bichlormethan oder Äthylacetat aus der Fermentationsflüssigkeit gewonnen werden· Nach dem Einengen der so erhaltenen organischen Lösung und nach Chromatographieren des Rückstandes kann das grhaltene rohe Produkt durch Umkristallisieren gereinigt werden.

Der wichtigste Verteil der Erfindung ist i daß sie die wirt-r schaftliche Herstellung von therapeutisch wirksamen Herzglykosiden ermöglichte- Bei der Gewinnung von Lanatosid C aus der Pflanze Digitalis lanats bleiben immer große Mengen von dem therapeutisch wertlosen Lanatosid A zurück* während bei der Herstellung von Digoxin der therapeutisch ebenfalls wertlose Digitoxin als Nebenprodukt erhalten

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wird; durch die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man aus diesen wertlosen Nebenprodukten therapeutisch wervolle Herzglykoside erhaltene

Aus führung sb e isj3.ie.le.;. . . -

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die nachstehenden Beispiele näher veranschaulichte

Beispiel 1 . . . . "

Der Stamm Streptomyces praecox MNG 127 wird an

1,0 % Glucose

0,2 % Casamin

0,1 % Fleischextrakt

0,01 % Lanatosid A und

1,7 % Agar -

enthaltenden Nährboden gezüchtet· Eine mit 5 ml destilliertem Wasser von Schrägagar hergestellte Sporenabschwemmung wird als Impfstoff der Submerskultur verwendete-

100 ml Nährlösung ^US«, welche 2 % Sojamehrl, 3 % Glucose und 0,5 % Oalsiumöarbonat enthält, werden mit 1 ml der obigen Suspension beimpft« Vor dem Impfen wird der Nährboden, dessen pH-Wert 7 ist, bei 120⁰G 25 Minuten sterilisiert. Die Züchtung der Streptomyceten erfolgt bei 28⁰O, an einem Schütteltisch mit 2,5 cm Ausschlag, 300 U/min· Nach 2 Tagen Inkubation wird die Kultur mit der Lösung von 50 mg Digitoxin in 2 ml Methanol versetzt und die Kultur bei 37°0 weiter geschüttelt. Das Fortschreiten der biochemischen Reaktion wird durch die dünnschichtchromatographische Analyse des Chloroformextraktes von täglich entnommenen Mustern des Mediums verfolgt. Zu diesem Zweck werden Kieselgel HF₂₅, Platten (E_c Merck, Darmstadt, BRD) verwendet; Laufmittel: 35j55j1O Gemisch von Cyclohexane Äthylacetat und abs_c Äthanol,-Die Flecke des Umsetzungsprodukts werden

durch die Anwendung von essigsaurer Anisaldehydlösung bei 105°C sichtbar gemacht. In dem auf Grund der dünnechichtchromatographischen Analyse als vom Gesichtspunkt der Digoxinbil&ung günstigsten erscheinenden Zeit- punkt, etwa 90 Stunden nach der Zugabe von Digitoxin wird die Fermentation beendet; aus den aus 40 geschüttelten Kolben erhaltenen 4 liter Fermentationsflüssigkeit werden durch Zentrifugieren die sich absetzenden Bestandteile abgetrennt, mit 500 ml Mehtanol extrahiert und die Methanollösung zur Trockne eingedampft« Die bei der Zentrifugierung erhaltene supernatante Flüssigkeit wird mit je 3 Liter Chloroform dreimal extrahiert und die Extrakte vereinigt. IiJ dieser vereinigten Chloroformlösung wird auch der trok kene Rückstand des obigen Methanolextraktes gelöst» die Lösung über wasserfreiem Natriumsulfat, getrocknet und im Vakuum bei 40⁰C eingedampft» Der ölige Rückstand wird in 10 ml IjI Gemisch von Chloroform und Methanol aufgenommen und an 20 g Silicagel (zur Säulenchromatographie geeignete Qualität) getrocknet« Das dad rohe Produkt tragende Silicagel wird in sine Säule von 70 cm Höhe und 4 cm Durchmesser eingetragen;. das Chromatographieren.wird.mit trockenem Träger begonnen und In aufsteigender Richtung durchgeführt. Anfangs wird ein 35*55*2,5-Gremisch von Cyclohexane Äthylacetat und abs. Äthanol verwendet, welches dann bis zum Erreichen von 1100 ml Eluatvolumen linear auf 35l55:10 modifiziert vyird. Dann bleibt das Verhältnis der Lösungs-' mittel während der weiteren Eluierung unverändert, aber die anfängliche Durchflußgeschwindigkeit von 30 ml/h wird auf 20 ml/h reduziert* Das unverändert gebliebene Digitoxin erscheint in den. Fraktionen zwischen 960 ml und 1070 ml, dann wird aus den Fraktionen zwischen 1070 und 1150 ml das Hauptumsetzungsprodukt Digoxin und aus den nachfolgenden Fraktionen das ebenfalls gebildete 7B-Hydroxydigoxin erhalten.,

Die Digoxin enthaltenden Fraktionen werden 2 Tage lang bei

10

-20⁰C gehalten; während dieser Zeit scheidet sich das rohe Digoxin (330 mg) in Porm von nadeiförmigen Kristallen aus. Die Mutterlauge wird im Vakuum eingedampft, der ölige Rückstand in 5 ml Chloroform gelöst und die Lösung tropfenweise mit Cyclohexan bis zur beginnenden Trübung versetzt· Die Trübung wird durch die Zugabe von einigen Tropfen Methanol aufgelöst, das Gemisch auf -20⁰C abgekühlt und zum Kristallisieren stehen gelassen« In zwei Tagen scheiden sich 140 mg Digoxin in kristalliner Porm aus· Die beiden rohen Produkte werden vereinigt und aus heißem 80 %igem Methanol umkristallisiert· Es werden auf diese Ysfeise 450 mg kristallines Digoxin erhalten; F. ι 245 - 250⁰C; £iOj |° « + 10,8° (c « 1, Pyridin). IR (KBr): 3400, 3510, 3090, 1720, 1620, 1400, 1270, 860, - 820 cm"¹.

Das aus dem erhaltenen kristallinen Produkt durch saure Hydrolyse hergestellte Genin zeigt die folgenden Spektraldaten:

Spitzenwerte des Massenspektrums: 390 (M⁺), 372 (30 %), • 354 (70 Jg), 262 (42 #), 219 (40 %), 201 (100 #), 147 (40 %)_t 111 (41 %).

UV (in cc· H₂SO₄): λ' max.: 228, 317, 388 mn» BMR "(in Dimethylsulfoxyd): <f « 0,7 s (18-Me), 0,9 s -(19-Me), 3,.85 (3~H),-4,05 s (14-0H),."4,2 d (3-OH), 4,6 d (12-0H), 4,9 s (21-H), 5,8 s (22-H) ppm.

UV (in CCoHpSO,): λ _{n v} t -228, 317 und 388 mn. £ τ* max.

Aus dem Eindampfrückstand der 7ß-Hydroxy-digoxin enthaltenden Fraktionen werden nach Umkristallisieren aus 80 %igem Methanol 175 Mg kristallines Produkt erhalten; F.: 210 - 217⁰C; £luj ²£ « + 16,1° (c - 1, Pyridin)»

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I f

Das aus dem erhaltenen kristallinen Produkt durch saure Hydrolyse hergestellte 7ß~Hydroxy-digoxygenin zeigt die folgenden Spektraldatenι

Spitzenwerte des Massenspektrumsi 403 (M⁺, 3 %)$ 281

(36 SS), 278 (30. SS), 163, 145 (43 SS). IR CKBr) ί 3570, 3370, -2910, 1710, 1600, 1430, 1310, 860,

- 825 cm""¹

UHR (in Dimethylsulfoxyd)χ «Γ « 0,7 s (18-Me), 0,9 s

-(19-Me), 3,9 (3-H), 4,25 d (3-OH), 4,65 df (12-0H), 4,9 s (21-H), 5*3 s (14-0H), 5*5 d (7-OH), 5,8 s * (22-H) ppm. . - -

UV (in cc» HpSOJ Λ _moT * 23o, 380 und 460 nnu £ *r max»

Beispiel 2

Die Züchtung des Stammes Streptomyces praecox (MMG-127) und die mikrobiologische Umsetzung des zugesetzten Substrats werden unten den im Beispiel 1 beschriebenen Verhältnissen durchgeführt» Zu der ausgewachsenen Kultur werden als Substrat auf jede 100 ml der Kultur 20 mg pi -Äcetyldigitoxin in 1 ml Äthanol gelöst zugegeben« Die Fermentation wird 4 Tage lang fortgesetzt, dann wird das erhaltene Produkt auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise extrahiert und chromatographisch gereinigt, mit dem Unterschied, daß der Lösungsmittelgradient derart eingestellt wird, daß das anfängliche Volumenverhältnis 35*55s2,5 des Gemisches von Cyclohexan, Äthylacetat und abs· Äthanol bis sum Abfließen von I6OO ml Bluat auf 35«55ί8 verdünnt sein·soll; im weiteren Verlauf des EIuierens wird dann dieses Verhältnis beibehalten. Die zwischen I55O ml und 1770 ml Eluatvoiümen gesammelten Fraktionen werden vereinigt und eingedampft; der Rückstand wird aus 80-$igem Methanol kristallisiert; das erhaltene kristalline Produkt kann auf Grund seiner dünnschichtchromatographisehen Eigenschaften alsc/y-Äcetyldigoxin

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Identifiziert werden· Bas Produkt wird durch präparatlve Dünnschichtchromatographie weiter gereinigt«, Das auf diese Weise erhaltene analytisch reine pü -Acetyldigoxin schmilzt bei 224 - 229°C; PdjJ ²^ « 18,2° (c « 1, Pyridin). - -

Das nach Hydrolyse dieses Produkts erhaltene Genin zeigt dieselben physikalisch-chemischen Daten, wie das nach Beispiel 1 erhaltene Digoxygenin«,

Beispiel 3

Von einer an Kartoffelextrakt und Glucose enthaltenden Schrägagar gewachsenen, 5 bis 6 Wochen alten Kultur des Stammes Streptomyces praecox MNG 127 wird mit 10 ml sterilem destilliertem Wasser eine Suspension hergestellt· Mit je 1 ml dieser Suspension werden in 500 ml Erlenmeyer-Kolben je 100 ml sterilisierte PS-Nährlösung (enthaltend 0,8 % staubförmigen Sojaextrakt und 3 % Glucose) eingeimpft. Die Nährlösung, dessen pH-Wert vor dem Strilisieren 7,0 war, wurde vor dem Impfen 45 Minuten bei 120⁰C sterilisiert; die Sterilisierung der zu der Nährlösung zuzusetzenden Glucose separat, in 50 %iger Lösung, 30 Minuten bei 120⁰C.

Der staubförmige Sojaextrakt wird auf die. folgende Weise hergestellt: extrahiertes Sojamehl wird durch ein Sieb mit O₅ 4 mm Maschenweite durchgesiebt und In Leitungswasser suspendiert. Die 10 % Mehl enthaltende Suspension wird eine Stunde unter 1 Atü erhitzt, dann auf 37⁰C abgekühlt und mit 0,4 % Pankreatin 2 Stunden lang unter ständigem Rühren hydrolysiert, wobei der pH-Wert des Reaktionsgemisches mit nach Bedarf zugesetztem Natriumhydroxyd während der Hydrolyse zwischen 7,5 und 8,0 gehalten wird«, Nach Beendigung der Hydrolyse wird das Gemisch zentrifugiert und die supernatante Flüssigkeit unter Zerstäubung getrocknet«

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Der Stickstoffgehalt des auf diese Weise gewonnenen pulverfönnigen So.jaextraktes ist 9 %o

Die Bebrütung des Streptomyces Stammes in dem beimpften Kolben erfolgt bei 32⁰C an einem Schütteltisch mit 2,5 om Ausschlag und 300 U/min, Mit der unter solchen Umständen in 24 Stunden voll ausgewachsenen 400 ml Schüttelkultur werden in einem gläsernen Laboratoriumsfermentor mit 10 1 Rauminhalt 5 1 PS-Nährboden beimpft· Außer den Sojaextrakt und Glucose werden in diesem Sail dsm Nährboden auch 0,2 % Palmöl zugegeben, um das Schäumen zu verhindern. Die Fermentation wird bei 32⁰C, unter Belüftung mit 5 l/min steriler Luft und unter Rühren mit 350 U/min einen Tag fortgesetzt, dann wird die Temperatur der Kultur auf 37°0 erhöht und es wird die durch Filtrieren sterilisierte Lösung von 2j5 g Digitoxin in 100 ml Methanol zugesetzt« Nach 2 Tagen Unkubation wird die Permentationsflüssigkeit abfil-"fcriert und das Piltrat zweimal mit je 1/3 Vol. Benzol und anschließend dreimal mit je 1/3 Vol. Chloroform extrahiert· Aus dem Chloroformextrakt werden 750 mg Digoxin und 440 mg Tß-Hydroxydigoxin erhalten. ·

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Claims (2)

1. - 14 - 2 1

   Erfindungsanspruch:

   1» Verfahren zur Herstellung von Cardenolidverbindungen
   der allgemeinen Formel I, worin X Wasserstoff oder eine Hydroxylgruppe und R Wasserstoff oder eine Gruppe der
   allgemeinen Formel III, und in der letzteren Formel R
   Wasserstoff oder eine Acetyl gruppe bedeuten, gekennzeichnet dadurch, daß man Oardenolidverbindungen der allgemeinen Formel II, worin R und X die bei der allgemeinen Formel I angegebenen Bedeutungen haben, in wäßrigem Medium mit einer submeren, belüfteten und gerührten Kultur des Stammes Streptomyces praecox MTG 127, deponiert . in der Ungarischen Nationalen Sammlung von Mikroorganismen, in Berührung bringt und dann das enstandene, biologisch aktive, hydroxylierte Produkt aus dem Reaktionsgemisch abtrennte
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch,, daß man Digitoxin als Cardenolidverbindung der allgemeinen Formel II einsetzte

   Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man d/ -Acetyldigitoxin als Cardenolidverbindung der allgemeinen Formel II einsetzte