CH644635A5 - Mikrobiologisches verfahren zur herstellung von sekundaeren glykosiden aus primaeren digitalisglykosiden. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von sekundären Digitalisglykosiden der allgemeinen Formel I

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worin R1 und R2 je ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe bedeuten.

Bekanntlich befinden sich im aus den Blättern von Digitalis lanata gewonnenen Glykosidgemisch neben den primären Glykosiden oder Lanatosid-Verbindungen (Lanatosid A, B und C) und den sekundären Glykosiden (Digitoxin, Gitoxin und Digoxin^ auch die Acetylderivate der letzteren (Acetyldi-gitoxin, Acetylgitoxin und Acetyldigoxin). Bei der Aufarbeitung der Blätter nach beliebigen bekannten Methoden werden immer solche Gemische von Glykosiden erhalten, von denen nicht alle Komponenten gleichermassen als Arzneimittel verwendet werden können. Es ist also zweckmässig, Methoden zu suchen, nach welchen die einzelnen Kompone-ten des Glykosidgemisches in die für therapeutische Zwecke am besten geeigneten Formen gebracht werden können.

Die Verbindungen der Lanatosidreihe unterscheiden sich von den sekundären Glykosiden dadurch, dass während bei den sekundären Glykosiden sich nur drei Digitoxose-Einhei-ten an den Aglykon-Teil des Moleküls anknüpfen, enthalten die Verbindungen der Lanatosidreihe ausser diesen Zuckern eine zu dritten Digitoxose gebundene Glucose, wobei die 3"'-Hydroxylgruppe der dritten Digitoxose durch Essigsäure verestert ist.

Zum Abspalten der in ß-Stellung stehenden Glucose bzw. der 3"'-Acetylgruppe der Lanatoside sind schon mehrere Methoden bekannt. So kann z.B. die 3"'-Acetylgruppe durch sehr milde alkalische Behandlung abgespaltet werden.

Bei der sauren oder alkalischen Hydrolyse von Lanatosid-Verbindungen wird im allgemeinen auch die zwischen dem Aglykon und dem ersten Digitoxose anwesende Bindung gespaltet, es wird also nicht nur die gewünschte terminale Glucose-Abspaltung erreicht, sondern auch die erwähnte weitere, hier unerwünschte Spaltung zu Geninen (Digitoxigenin, Gitoxigenin und Digoxigenin), so dass auf diesem Weg sekundäre Herzglykoside aus Lanatosiden nicht erhalten werden können; die gewünschte sekundären Herzglykoside können aus Lanatoside nur auf umständlichen chemischen Wegen hergestellt werden.

Es kann zwar durch eine entsprechende Fermentierung der Blätter von Digitalis lanata erreicht werden, dass die Verbindungen der sekundären Reihe im Glykosidgemisch angereichert werden; in diesem Fall kann aber das als Arzneimit-

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tel wertvolle Lanatosid C nicht aus dem Glykosidgemisch gewonnen werden.

Auch mikrobiologische Methoden sind Spaltung von Verbindungen der Lanatosidreihe seit längerer Zeit bekannt. So kann die terminale Glucose mit Hilfe von Schimmelpilz-Kulturen oder von daraus hergestellten ß-Glucosidaseen abgespaltet werden. A. Stoll und seine Mitarbeiterhaben zuerst die lanatosidspaltende Aktivität von Schimmelpilzen untersucht (vgl. Helv. Chim. Acta 34, 397-401 [1951]. Die terminale Glucose von Lanatosiden konnte mit Hilfe des aus der Kultur von verschiedenen Schimmelpilzarten (meistens von Asper-gillus-Arten) durch Behandlung mit Acetontrockenpulver abgespaltet werden. F. Pitra und Mitarbeiter (tschechoslowakische Patentschrift Nr. 108 046) haben ein aus Aspergillus orizae gewonnenes Enzympräparat zur Herstellung von acety-lierten sekundären Glykosiden verwendet. Die Acetylase-Aktivität der Schimmelpilzkulturen ist aber nicht mit ihrer ß-Glucosidase-Aktivität vergleichbar; deshalb.wird diese Methode im allgemeinen nur zur Herstellung von acetylierten Verbindungen der sekundären Reihe angewendet.

Die Zielsetzung der vorliegenden Erfindung war die Herstellung von Verbindungen der sekundären Reihe aus Lanatosiden, und zwar mit Hilfe von solchen Mikroorganismen, welche neben der ß-Glucosidase-Aktivität auch eine entsprechende Acetylase-Aktivität aufweisen, so dass sie das Substrat mit grosser Geschwindigkeit und in hoher Konzentration derart umsetzen können, dass dabei sowohl die Glucose als auch die Acetylgruppe in demselben Fermentation abgespaltet werden. Weiterhin wird von den zu diesem Zweck verwendbaren Mikroorganismen noch gefordert, dass die erwähnten beiden Aktivitäten, d.h. die ß-Glucosidase- und die Acetylase-Aktivität, praktisch gleich stark sein sollen und dass während der Umsetzung sich keine Zwischenprodukte (Acetylderivate der sekundären Reihe bzw. Desacetyl-lanato-side, auch als Purpurea-Glykoside bekannt) anhäufen sollen. Es ist also erwünscht, dass die zu verwendenden Mikroorganismen fähig sein sollen, sekundäre Glykoside sowohl aus den Acetylderivaten der sekundären Glykoside (wobei die Acetylase-Aktivität zur Geltung kommt) als auch aus den Pur-purea-Glykosiden (wobei die ß-Glykosidase-Aktivität die entscheidende Rolle spielt) herzustellen.

Es wurde nun gefunden, dass es möglich ist, die den obi-

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gen Forderungen entsprechenden Ergebnisse mit Hilfe eines zum Genus Streptomyces gehörenden, sich durch hervorragend hohe Enzymaktivität auszeichnenden Mikroorganismenstammes zu erzielen. Dieser neue Mikroorganismenstamm wurde als Streptomyces griseolus identifiziert und von der Titularin in der Ungarischen Nationalen Mikroorganis-menstamm-Sammlung des Ungarischen Landesinstituts für

Hygienie unter Nr. MNG 168 am 6. Dezember 1977 deponiert.

Die Erfindung ist demnach ein neues Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von sekundären Digitalisgly-kosiden der oben definierten allgemeinen Formel I, worin R1 und R2 Wasserstoffatome oder Hydroxylgruppen bedeuten, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man primäre Glykoside der allgemeinen Formel II

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worin R1 und R-je ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe R3 ein Wasserstoffatom oder eine Acetylgruppe und 35 R4 ein Wasserstoffatom oder eine D-Glucosegruppe bedeuten, aber R3 und R4 nicht beide zugleich Wasserstoff bedeuten können, mit einer submersen Kultur des Stammes Streptomyces griseolus MNG 168 oder mit einem aus einer solchen Kultur hergestellten Enzympräparat in Berührung bringt und die <to erhaltenen sekundären Glykoside aus der Fermentationsflüssigkeit auf an sich bekannte Weise isoliert.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsweise des erfin-dungsgemässen Verfahrens wird das Enzym an den Mikroorganismenzellen fixiert und die hydrolytische Umsetzung mit « dem auf diese Weise gebundenen Enzympräparat durchgeführt.

Der im erfindungsgemässen Verfahren angewendete Mikroorganismenstamm wurde aus einem Bodenmuster isoliert; der Stamm zeigte die folgende taxonomischen Eigen- 50 Schäften :

Morphologie: Die Sporenträger zeigen sympodiale Verzweigungen, haben gerade Endungen; Spirale oder Schlingen kommen nicht vor. Im Lichtmikroskop sind die Sporen eiförmig, ihre Grösse ist 0,7-0,9 x 0,9-1,1 ji. 55 Wachstum an verschiedenen Nährböden: Saccharose-Nitrat-Agar: Wachstum farblos, später grau; die Luftmyzelien sind dünn, weiss, später olivgrün. Schwaches braunes Pigment diffundiert in das Agar.

Tyrosin-Agar: Melanin negativ. Die Luftmyzelien und das 60 gesamte Wachstum zeigen lockere Struktur. Ein hellbraunes lösliches Pigment diffundiert in das Agar.

Nähr-Agar: Kompaktes, starkes Wachstum, anfangs grau, später bräunlich. Die Luftmyzelien sind dünn, staubig, hellgrau; kein lösliches Pigment. b5

Bennett-Agar: Wachstum kremfarbig, dunkelt sich mit der Zeit zu bräunlich. Die Luftmyzelien sind dünn, aber kompakt, mit staubiger Struktur und von blaugrauer Farbe.

Glukose-Asparagin-Agar: Wachstum grau, dunkelgrau, später stellenweise schwarz. Luftmyzelien werden nur stellenweise gebildet, mit mausgrauer Farbe. Wenig braunes lösliches Pigment diffundiert in das Agar.

Bouillon-Agar: Wachstum dick, grau, wird runzelig. Weder Luftmyzelien, noch lösliches Pigment werden gebildet.

Calciummalat-Agar: Rasches Wachstum, hellgrau, später dunkelgrau. Die Luftmyzelien sind blaugrau, stellenweise in Flecken olivgrün. Sehr wenig bräunliches, lösliches Pigment diffundiert in das Agar.

Kartoffel-Glucose-Agar: Das Wachstum zeigt mittlere Geschwindigkeit, breitet sich aber stark aus, mit brauner Farbe. Die Luftmyzelien sind in der Mitte samtig, blaugrau, kriechen am Rand der Kolonie spinnengewerbeartig auseinander. Wenig hellbraunes lösliches Pigment diffundiert in das Agar.

Maismehl-Agar: Wachstum hellbraun, die Luftmyzelien sind staubig, dünn, anfangs hellgrau, später blaugrau. Kein lösliches Pigment.

Glyzerin-Nitrat-Agar: Wachstum grau, graubraun, zuletzt schwarz, stark gerunzelt. Die Luftmyzelien sind gipsartig, staubig, gleichmässig aschgrau. Wenig, aber ausgeprägt braunes lösliches Pigment diffundiert in das Agar.

Sabouraud-Glucose- (Glucose-Pepton-) Agar: Das wachsende Bodenmyzel ist hellbraun, die Luftmyzelien sind dünn, hellgrau, gipsartig, trocken, es entsteht ein schwach braunes lösliches Pigment.

Kartoffelscheibe: Starkes und rasches Wachstum, mit sich grob runzelnder Oberfläche; anfangs grau, später schwarz. Die Luftmyzelien sind aschgrau, das lösliche Pigment braun.

Löfflerscher geronnener Molke-Nährboden: braunes Wachstum, starke proteolytische Aktivität.

Cellulose als einzige Kohlenstoffquelle: gutes Wachstum.

Nitratreduktion: positiv.

Gelatine-Verflüssigung: positiv.

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Milch: starke Koagulation und starke Peptonisation werden beobachtet.

Blut-Agar: Wachstum runzelig, olivgrün; Luftmyzelien hellgrau; schwache Beta-Hämolyse.

Assimilation von Kohlenstoffquellen

D-Glucose

+

D-Sorbit schwach

D-Galaktose

+ +

lösliche Stärke

+ +

Saccharose

+

D-Xylose

+

Maltose

+

L-Rhamnose

+

Lactose

+

Galaktit

—

Raffinose

+

D-Mannit

+

L-Sorbose

—

Inosit

+

Cellobiose

+

D-Fructose

+

Trehalose

+ +

D-Mannose

+

Glycerin

+ +

Auf Grund der obigen charakteristischen Eigenschaften gehört der neue Stamm zur Art Streptomyces griseolus (Waksman) Waksman et Henrici 1948 (vgl. Waksman: The Actinomycetes, Vol. 2, The Williams Wilkins Company, Baltimore, 1961, S. 222-223).

Zum Züchten der im erfindungsgemässen Verfahren angewendeten Mikroorganismen können die bei dem Züchten von Strahlenpilzen allgemein üblichen Methoden angewendet werden. Die Züchtung erfolgt am vorteilhaftesten in submer-ser Kultur. Der zum Züchten geeignete Nährboden kann in Wasser gelöste bzw. suspendierte, durch die Pilze assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze und sonstige übliche Zusätze (Biosstoffe, Antischaum-mittel usw.) enthalten.

Als Kohlenstoffquelle können Malz, Glucose, Maltose, Saccharose oder andere Zucker, Fette, Fettsäuren, Aminosäuren und Peptide eingesetzt werden. Als assimilierbare Stickstoffquellen kommen Stickstoffverbindungen mikrobialer, tierischer oder pflanzlicher Herkunft und/oder anorganische Stickstoffverbindungen, wie Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, hydrolysiertes Kasein, Sojamehl, Maisquellwasser, Ammoniumsalze und Nitrate in Betracht.

Unter Berücksichtigung auch von wirtschaftlichen Gesichtspunkten können am vorteilhaftesten Glucose als Kohlenstoffquelle und Sojamehl und/oder Maisquellwasser als Stickstoffquelle im Nährboden verwendet werden. Die Bestandteile des Nährbodens werden in Leitungswasser gelöst bzw. suspendiert und zusammen bei 121 °C 20 bis 45 Minuten steriliesiert, mit Ausnahme der reduzierenden Zuk-ker, da diese zweckmässig separat sterilisiert werden.

Die Züchtung der im erfindungsmässen Verfahren verwendeten Mikroorganismen kann bei 22-37 ° C, vorzugsweise bei 28 °C, erfolgen. Diese Mikroorganismen sind gegenüber der Belüftung und der Umdrehungszahl des Rührwerkes nicht besonders empfindlich; im allgemeinen können in einem 100-1-Fermentor mit einer Belüftungsgeschwindigkeit von 1001/min, mit einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min gute, zur raschen Umsetzung geeignete Kulturen erhalten werden ; ähnlich gute Ergebnisse können aber auch mit davon nicht allzusehr abweichenden anderen Belüftungsgeschwindigkeiten und Rührwerk-Umdrehungszahlen erzielt werden.

Die im erfindungsgemässen Verfahren umzusetzenden Substrate werden in mit Wasser mischbaren und die Funktion von biologischen Systemen nicht oder nur mässig schädigenden organischen Lösungsmitteln (Methanol, Äthanol, Dime-thylformamid, Aceton, Tetrahydrofuran), vorteilhaft in Methanol, gelöst, die Lösung durch Filtrieren sterilisiert und dann der voll entwickelten, maximale Enzymaktivität zeigenden Kultur zugegeben. Die Umsetzung wird in einem belüfteten, mit Rührwerk ausgerüsteten Gefäss, bei 22 bis 37 °C, vorzugsweise bei 28 bis 32 °C, durchgeführt.

Die Umsetzung kann auch gesondert von dem Fermentationsvorgang durchgeführt werden, indem man aus der zur Umsetzung schon geeigneten Kultur ein Enzympräparat herstellt und dieses zur Umsetzung verwendet. Das Enzympräparat kann nach der allgemein bekannten Methode der Herstellung von «durch Behandlung mit Aceton gewonnenen trockenen Pulvern» hergestellt werden. Etwa 70% der gesamten ß-Glucosidase und Acetylase Aktivität der Kultur ist in diesem Acetontrockenpulver enthalten. Die Aktivität solcher trockenen Enzympräparate bleibt bei einmonatiger Lagerung bei 4 bis 6 °C voll erhalten.

Nach der Beendigung der Umsetzung werden die in der Fermentationsflüssigkeit anwesenden sekundären Glykoside zweckmässig mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel (Chloroform, Dichloräthan, Äthylacetat, Methylisobutylketon usw.), besonders mit Chloroform, aus der Fermentationsflüssigkeit extrahiert. Das Ablösen der zum Myzel gebundenen sekundären Glykoside kann durch die Zugabe von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln (Methanol, Äthanol, Aceton usw.), besonders von Methanol, erleichtert werden. Während der Herstellung kann das Fortschreiten der Umsetzung mit Hilfe von Dünnschichtchromatographie verfolgt werden.

Die praktische Ausführung und die näheren Einzelheiten des erfindungsgemässen Verfahrens werden durch die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht.

Beispiel 1

Eine auf schrägem Kartoffelglucose-Agar gezüchtete einwöchige Kultur des Stammes Streptomyces griseolus MNG 168 wird mit steriler physiologischer Kochsalzlösung überschüttet und die Oberfläche des Agars mit einer sterilen Platinschleife aufgekratzt. Mit der auf diese Weise erhaltenen Mikroorganismensuspension wird ein Inokulum-Nährboden folgender Zusammensetzung eingeimpft: 2% Glucose, 1% Sojamehl, 0,5% Maisquell wasser (feuchtes Gewicht, auf 50% Trockensubstanz berechnet), 0,2% Pepton, 0,3% Calciumcarbonat; Gesamtvolumen 1 Liter sterilisiert in 3-1-Erlenmeyer-kolben. Die Kultur wird auf einer Schüttelmaschine bei 28 °C 36-48 Stunden geschüttelt. Drei solche Inokulum-Kulturen werden parallel hergestellt und die auf diese Weise gewonnenen 3-Liter-Inokulum-Kulturen werden zum Einimpfen des in einem mit Rührwerk ausgerüsteten Fermentor von 100 Liter nützlichem Rauminhalt zubereiteten Nährmediums gleicher Zusammensetzung verwendet. Während der Fermentation wird das Medium mit 400 U/min gerührt und mit 1001/ min Luftstrom belüftet. Als Antischaummittel wird.Speiseöl verwendet. Die Fermentation wird bei 28 °C 36 bis 48 Stunden lang fortgeführt, um die zur Umsetzung erforderliche Enzymaktivität zu erreichen.

500 g Lanatosid A werden in 10 1 heissem Methanol gelöst, die Lösung durch einen Seitz-Filter abfiltriert und dann unter sterilen Bedingungen und Rühren der auf obige Weise zubereiteten Fermentationsflüssigkeit zugesetzt. Das Fortschreiten der Umsetzung wird mit Hilfe von Dünnschichtchromatographie (auf Merck «Kieselgel-G»-Platten; Laufmittel: 55:35:10-Gemisch von Äthylacetat, Cyclohexan und abs. Äthanol) verfolgt. Der Fleck des Substrats verschwindet nach 48 bis 60 Stunden und auf der Platte ist nur mehr die entstandene Verbindung der sekundären Reihe, das Digitoxin sichtbar. Nach voller Umsetzung wird die Fermentationsflüssigkeit filtriert. Das Myzel wird mit 801 Methanol 2 Stunden gerührt, filtriert und mit weiteren 80 I Methanol wieder 2 Stunden gerührt. Die methanolisch-wässrigen Waschflüssigkeiten werden vereinigt, im Vakuum bei höchstens 40 °C auf 5 Liter eingeengt und bei 0 °C 24 Stunden zum Kristallisieren stehen gelassen. Die erhaltenen Kristalle werden mit 70%igem wässrigem Methanol gewaschen (rohes Produkt

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I). Die Mutterlaugen und Waschflüssigkeiten der Kristallisierung werden mit je '/: Vol. Chloroform dreimal extrahiert und die vereinigten Extrakte zur Trockne eingedampft (rohes Produkt II).

Das Filtrat der Fermentationsflüssigkeit wird ebenfalls mit je '/2 Vol. Chloroform dreimal extrahiert und die vereinigten Extrakte zur Trockne eingedampft (rohes Produkt III).

Die vereinigten rohen Produkte II und III werden mit 5 Liter 50%igem vvässrigem Methanol aufgenommen und mit 2 Liter Petroläther extrahiert. Die wässrig-methanolische Phase wird zur Trockne eingeampft (halbfertiges Produkt II-III); die Petroläther-Phase wird verworfen.

Das rohe Produkt I wird mit dem halbfertigen Produkt II-III vereinigt, zerpulvert, in 5 Liter eines 1 ; 1-Gemisches von Methanol und Benzol gelöst, die Lösung mit Aktivkohle gerührt und durch eine Aluminiumoxidschicht filtriert. Das Filtrat wird unter Rühren mit 2,5 Liter Leitungswasser versetzt und bei 0 °C 48 Stunden zum Kristallisieren stehen gelassen. Die Benzolphase wird verworfen, die Kristalle werden abfiltriert, mit Benzol und dann mit einem 1:1-Gemisch von Methanol und Wasser gewaschen und schliesslich bei 50 °C bis zu konstantem Gewicht getrocknet. Es werden auf diese Weise 310 g Digitoxin (Reinheit mindestens 97%) erhalten. Die Mutterlaugen und Waschflüssigkeiten der Kristallisierung werden vereinigt und ebenfalls auf die obige Weise aufgearbeitet; wobei weitere 25 g Digitoxin erhalten werden. Gesamtausbeute: 85%.

Beispiel 2

Die auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise erhaltene, zur Umsetzung schon geeignete Kultur des Mikroorganismenstammes wird abfiltriert, das Myzel mit Wasser gewaschen, dann in eine solche Menge von auf — 20 °C abgekühltem Aceton eingelegt, dass die Flüssigkeit die Myzelmasse überdeckt. Das Myzel wird in dem bei — 20 °C gehaltenen Aceton eine Stunde gerührt, dann kalt abfiltriert und bei Raumtemperatur bis konstantem Gewicht getrocknet. Es werden auf diese Weise 70 g trockenes Enzympräparat erhalten.

70 g Enzympräparat (welches nicht älter ist, als 1 Monat) werden in 80 Liter 0,01 M Phosphat-Pufferlösung (pH = 7) unter Rühren suspendiert; dann wird unter weiterem Rühren die heisse konzentrierte methanolische Lösung von 350 g Lanatosid A zugegeben. Das Gemisch wird bei 28 °C weiter gerührt und das Fortschreiten der Umsetzung durch Dünnschichtchromatographie verfolgt. Nach 48 bis 60 Stunden zeigt sich der Fleck des Ausgangsstoffes nicht mehr, es ist nur der Fleck von Digitoxin sichtbar. Das Reaktionsgemisch wird auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet; es werden 236 g Digitoxin (85% d. Th.) erhalten.

Beispiel 3

Zu 1 Liter nach Beispiel 1 erhaltenem Enzymaktivem Fermentationsmedium werden 5 g Lanatosid B zugesetzt. Nach der Beendigung der Umsetzung wird das Reaktionsgemisch auf die beschriebene Weise aufgearbeitet; es werden 3,37 g Gitoxin (85% d. Th.) erhalten.

Ähnliche Ergebnisse werden erhalten, wenn man das

Lanatosid B zu 1 Liter nach Beispiel 2 erhaltenem, in Phosphat-Pufferlösung suspendiertem Enzympräparat zugibt.

Beispiel 4

5 g Lanatosid C werden nach Beispiel 3 behandelt; es werden 3,34 g Digoxin (84% d. Th.) erhalten.

Beispiel 5

5 g Acetyldigitoxin werden nach Beispiel 3 behandelt; es 5 g Acetyldigitoxin werden nach Beispiel 3 behandelt; es werden 3,95 g (85% d. Th.) Digitoxin erhalten.

Beispiel 6

5 g Acetylgitoxin werden auf die im Beispiel 3 beschriebene Weise umgesetzt; es werden 3,92 g (84% d. Th.) Gitoxin erhalten.

Beispiel 7

5 g Acetyldigoxin werden auf die im Beispiel 3 beschriebene Weise umgesetzt; es werden 3,90 g Digoxin (84% d. Th.) erhalten.

Beispiel 8

5 g Desacetyl-lanatosid A werden auf die im Beispiel 3 beschriebene Weise umgesetzt; es werden 3,54 g Digitoxin (84% d. Th.) erhalten.

Beispiel 9

5 g Desacetyl-lanatosid B werden auf die im Beispiel 3 beschriebene Weise umgesetzt; es werden 3,55 g Gitoxin (84% d. Th.) erhalten.

Beispiel 10

5 g Desacetyl-lanatosid C werden auf die im Beispiel 3 beschriebene Weise umgesetzt; es werden 3,51 g Digoxin (83% d. Th.) erhalten.

Beispiel 11

Es wird in allen Einzelheiten auf die in den Beispielen 1 oder 2 beschriebene Weise gearbeitet, mit dem Unterschied, dass anstatt von reinem Lanatosid A beliebige Gemische von Lanatosid A, Lanatosid B, Lanatosid C, Desacetyl-lanatosid A, Desacetyl-lanatosid B, Desacetyl-lanatosid C, Acetyldigitoxin, Acetylgitoxin und/oder Acetyldigoxin als Ausgangsstoffe eingesetzt werden. Als Endprodukte werden in jedem Fall entsprechende Gemische von Digitoxin als Verbindung der Reihe A, Gitoxin als Verbindung der Reihe B und Digoxin als Verbindung der Reihe C erhalten, wobei die Mengenverhältnisse dieser drei sekundären Glykoside jeweils jenen Mengenverhältnissen entsprechen, in welchen die Verbindungen der Reihe A (Lanatosid A, Desacetyl-lanatosid A, Acetyldigitoxin), die Verbindungen der Reihe B (Lanatosid B, Des-acetyl-lanatosid B, Acetyl-gitoxin) und die Verbindungen der Reihe C (Lanatosid C, Desacetyl-lanatosid C, Acetyldigoxin) in dem als Ausgangsstoff eingesetzten Glykosidgemisch anwesend waren. Die Ausbeute an sekundären Glykosiden beträgt im allgemeinen 84%.

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   PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von sekundären Digitalis-Glykosiden der allgemeinen Formel I

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   worin R1 und R2 je ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxyl- 30 Digitalis-Glykoside und/oder Acetylderivate von sekundären gruppe bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dass man primäre Digitalis-Glykosiden der allgemeinen Formel II

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   worin R1 und R2 die obigen Bedeutungen haben, R3 ein Wasserstoffatom oder eine Acetylgruppe und R4 ein Wasserstoffatom oder eine D-Glucosegruppe bedeuten, aber R3 und R4 nicht beide zugleich Wasserstoff bedeuten können, mit einer submersen Kultur des Stammes Streptomyces griseolus MNG 168 oder mit einem aus einer solchen Kultur hergestellten Enzympräparat fermentiert und die erhaltenen sekundären Glykoside aus der Fermentationsflüssigkeit isoliert.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Enzym auf den Mikroorganismenzellen fixiert

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   und die hydrolytische Umsetzung mit dem auf diese Weise fixierten Enzympräparat durchführt.