NL7906140A - Microbiologische werkwijze voor de bereiding van secun- daire digitalis glycosides. - Google Patents

Description

+' 1 > t i t TO 8225

Richter Gedeon Yegyeszeti Gyar RT.

Boedapest, Hongarije.

Microbiologische werkwijze voor de "bereiding van secundaire digitalis glycosides.

De uitvinding heeft betrekking op een nieuwe microbiologische werkwijze voor de bereiding van secundaire digitalis glycosides met de algemene formule 1, waarin R^ en R^ waterstof of een hydrcxylgroep voorstellen, uit primaire digitalis glycosides.

Zoals bekend is, bevatten de hartsterkende glyeoside-mengsels, d-e uit' de bladeren van Digitalis laaata verkregen zijn primaire glycosiden of lanatoside-derivaten (lanatoside A, B en c), secundaire glycosiden (digitoxine,. gitoxine, digoxine), alsook de geacety-leerde derivaten van de laatstgenoemde (acetyldigitoxine, aeetylgitoxi-ne en acetyldigoxine). Ongeacht de conditie waaronder de verwerking van de bladen wordt uitgevoerd, worden mengsels van glycosiden verkregen. Daar niet alle componenten van het mengsel als geneesmiddel kunnen worden toegepast, zijn werkwijzen, die het -mogelijk maken dat deze verbindingen in elkaar of in de therapeutisch meest gunstige vorm worden omgezet, zeer belangrijk.

De verbindingen van de lanatoside-serie verschillen van die van de secundaire serie alleen daardoor, dat aan het aglycon-gedeelte van de secundaire verbinding drie digitoxose-suikereenheden zijn gebonden, terwijl bij de lanatoside-verbindingen nog een extra glycose-eenheid aan de derde digitoxose is gebonden, terwijl voorts de hydrcxylgroep op de plaats 3n’ van de derde digitoxose geacetyleerd is.

Toor de verwijdering van het β-glucose-gedeelte en de 3n‘-acetaatgroep van lanatosiden zijn' verschillende methoden beschreven.

De aeetaatgroep op de 3”’-plaats kan seleetief werden verwijderd door de verbindingen onder zeer milde condities met alkaliën te behandelen.

De milde zure en alkalische hydrolyse van lanatoside-verbindingen brengt in het algemeen ook de splitsing met zich mede van de verbinding tussen het aglycon en de eerste digitGxose-suiker, » 7906140 2 4 d.w.z. dat niet alleen de vereiste eind-glueose wordt verwijderd; daarom worden ook geninen (digitoxigenine, gitoxigenine of digoxi-genine) gevormd. Het is derhalve moeilijk cm secundaire hartsterkende glycosiden uit lanatosiden door toepassing van chemische werkwijzen 5 te bereiden.

De verbindingen van de secundaire serie kunnen in de bladeren van Digitalis lanata worden verrijkt door geschikte fermente-ringswerkwijzen; in dergelijke gevallen kan echter het farmaceutisch waardevolle lanatoside C niet worden afgescheiden.

10 Microbiologische werkwijzen zijn ook bekend voor het ontleden van de verbindingen van de lanatoside-serie. De eind-glucose-eenheid kan worden afgesplitst door toepassing van culturen van schim-melstammen of daaruit verkregen 3-glycosidase-enzymen. Het lanatose-splitsingseffekt van schimmels werd het eerst, bestudeerd door A. Stoll 15 et al. (Helv. Chim. Acta 3^, 397 - ^01 ('1951))- Volgens de door hen verkregen resultaten kon de eindglucose-eenheid van lanatosiden worden afgesplitst onder toepassing van aceton-droge poeders van culturen van verschillende schimmelstammen (in hoofdzaak Aspergillus-stam-men). F. Pitra et al. pasten een uit Aspergillus oryzae geïsoleerd 20 enzym toe om geacetyleerde secundaire produkten te bereiden (Tsjecho-slowaaks octrooischrift 108.0½). In aanmerking genomen echter dat de β-glycosidase-activiteit van Hyphcmycetes-culturen veel groter is dan hun acetylase-effekt, wordt deze methode in het algemeen toegepast voor de produktie van geacetyleerde verbindingen, behorende tot de 25 secundaire serie.

Het doel van de uitvinding is het uitwerken van een nieuwe werkwijze voor het verkrijgen van verbindingen van de secundaire serie uit lanatosiden onder toepassing van micro-organismen, die zowel β-glycosidase- als acetylase-activiteïten bezitten en in staat 30 zijn cm het substraat in hoge concentraties bij een hoge snelheid om te zetten, waarbij zowel de glucose- als de acetylgroep in een enkele fer-mentatiestap worden verwijderd. Het micro-organisme dient nagenoeg dezelfde acetylase- en β-glycosidase-activiteiten te bezitten, terwijl tussenprcdukten (acetylderivaten van de secundaire verbindingen 35 of deacetyl-lanatosiden/purpurea-glycosides/) mogen tijdens het cmzet-tingsproces niet accumuleren. Het micro-organisme dient in staat te 7906140 > 3 zijn secundaire glycosiden uit de "beide geschikte ac etylverbindingen (onder gebruikmaking Tan de acetylas e-verking) en purpurea-glycosides (onder gebruikmaking ran de β-glycosidase-activiteit) om te zetten.

GeTonden werd, dat de cultuur van een tot het genus 5 Streptcmyces behorend· micro-organisme» dat extreem sterke enzymatische -werkingen bezit» ten Tolle aan de borengenoemde eisen voldoet.

Met het bovengenoemde als basis heeft de uitvinding betrekking op een microbiologische werkwijze voor de bereiding van secundaire digitalis glycosiden met de algemene formule 1» waarin en Rg "waterstof of 10 een hydrcxylgroep voorstellen, met het kenmerk, dat een primair glycoside met de algemene formule 2, waarin R.| en Hg waterstof of een hydrcxylgroep voorstellen, waterstof of een acetylgroep vertegenwoordigt, en R^ waterstof of een O-glueose-eenheid is, 15 waarbij ten minste een van de groepen R^ en R^ geen waterstof is, wordt gefermenteerd met een submersiecultuur van Streptcmyces griseolus (MUG 168) of met een daaruit verkregen enzympreparaat» en vervolgens de resulterende secundaire glycosiden uit de fermentatievloeistof warden afgescheiden door toepassing van op zichzelf bekende methoden.

20 Volgens een bij voorkeur toegepaste uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding wordt het enzym op de cel geïmmobiliseerd en wordt de hyörolytische omzetting met dit geïmmobiliseerde enzympreparaat uitgevGerd.

De Streptomyces-stam, die volgens de uitvinding wordt 25 toegepast» was geïsoleerd uit de bodem. De stam bezit de volgende taxonomische kenmerken:

Morfologie: De sporof oren bezitten sympcdiale vertakkingen met rechte einden, terwijl geen helix of lus voorkomt. Bij onderzoek met een microscoop zijn de sporen ellipsoïdaal, afmetingen 30 0,7 - 0,9 x 0,9 - 1,1 micrometer.

Q-p saccharose-nitraat-agar is de kweek kleurloos, en wordt deze later grijs; het luchtmycelium is dun, wit, later olijfgroen. Een lichtbruin pigment wordt in de agar gediffundeerd.

On tyrosine-sgar is de stam melanine-negatief. Zowel 35 4e kweek als het luchtmycelium bezitten eën losse struktuur. Een licht- 7906140 , k b' bruin oplosbaar pigment wordt in de agar gediffundeerd.

Op voedingsagar is de kweek kompakt, sterk, aanvankelijk grijs, terwijl zij later bruin wordt. Het luchtmycelium is dun, poedervormig, lichtgrijs. Oplosbaar pigment wordt niet gevormd.

5 Op Bennett-agar is de kweek beige gekleurd, welke kleur bij veroudering overgaat in bruin. Het luchtmycelium is dun doch kompakt» poreus van stinktuur, blauwachtig grijs. Oplosbaar pigment wordt niet gevormd.

Op glucose-asparagine-agar is de kweek grijs, dohker-10 grijs; sporadisch wordt zij daarna zwart. Luchtmycelium wordt slechts sporadisch gevormd en bezit een muisgrijze kleur. Een kleine hoeveelheid bruin oplosbaar pigment wordt in de agar gediffundeerd.

Op bouillon-agar is de kweek dik, grijs en gerimpeld. Luchtmycelium en oplosbaar pigment worden niet gevormd.

15 Op calciummalaat-agar is de kweek snel, lichtgrijs; zij wordt later donkergrijs. Het luchtmycelium is blauwachtig grijs, met sporadisch olijfgroene vlekken. Een zeer kleine hoeveelheid bruinachtig oplosbaar pigment wordt in de 'agar gediffundeerd.

Op aardappel-glucose-agar is de kweek matig snel, 20 doch sterk verspreid en bruin. Het luchtmycelium is fluweelachtig, 1 .....

•blauwachtig groen in het midden en spinnewebachtig uitgespreid aan de rand van de kolonie. Een kleine hoeveelheid lichtbruin oplosbaar pigment wordt in de agar gediffundeerd.

Op maismeel-agar is de kweek lichtbruin, het lucht-25 mycelium poedervormig, dun, aanvankelijk lichtgrijs, welke kleur later blauwachtig grijs wordt. Oplosbaar pigment wordt niet gevormd.

Op glycerol-nitraat-agar is de kweek grijs, grijsachtig bruin, tenslotte bijna zwart en sterk gerimpeld.. Het luchtmycelium is gipsachtig ("plastery"), poedervormig en uniform asgrijs. Een 30 kleine hoeveelheid van een uitgesproken bruin, oplosbaar pigment wordt in de agar gediffundeerd.

Op Sabouraud-glucose (glucose-pepton)-agar is het gekweekte substraatmycelium lichtbruin, het luchtmycelium dun, lichtgrijs, gipsachtig ("plastery") droog. Een lichtbruinachtig oplosbaar 35 pigment wordt gevormd.

7906140 5

Op aardappelschijfjes is de kweek sterk en snel, grof gerimpeld, aanvankelijk grijs en later zwart. Het luchtmycelium is asgrijs, het oplosbare pigment is bruin.

Ou een uit boef fierr s geeoaguleerde wei bestaand mi-5 lieu kan een bruine kweek en een sterke proteolytische activiteit worden waargenomen»

Op cellulose als enige koolstofbron groeit de stam goed.

Kitraatreduetie: positief.

10 Gelatinevervloeilng: positief.

Melk: totale eoagulatie en sterke peptonisatie kunnen worden waargenomen.

Op bloed-agar kunnen een gerimpelde, olijfgroene kweek, een lichtgrijs luchtmycelium en een zwaake B-haemolyse worden waar-15 genomen.

Assimilatie van koolstofbronnen D-glucose: + D-sorbitol: week D-galactGse: ++ oplosbaar zetmeel ++ saccharose: + D-xylose: + 20 maltose: + L-rhamnose: + lactose: + galactitol: - raffinose: + D-mannitol: + L-sorbose: - inositol: + cellobiose: + D-fructose: + 25 trehalose: ++ D-mannose: + glycerol: ' ++

Op basis van de bovengenoemde eigenschappen behoort de stam tot het species Streptcmyees griseolus (Waksman), Waksman en Henrici 19^8 (Waksman: The Actinomycetes, Tol. 2 (The Williams Wilkins 30 Company, Baltimore) 1961, biz. 222 - 223).

De bij de werkwijze volgens de uitvinding toegepaste micro-organismen worden gekweekt door methoden, die in het algemeen worden toegepast voor het kweken van Actinomycetes. De meeste voorkeur gaat uit naar het kweken in submersie-culturen. Het cultuurmilieu 35 kan assimileerbare koolstof- en stikstofbronnen, anorganische zouten 7906140 ' 6 .

en andere toevoegsels (biotische stoffen, antischuimmiddelen, enz.), opgelost of gesuspendeerd in water, bevatten.

Als koolstofbron kunnen b.v. mout, glucose, maltose, saccharose of andere suikers, vetten, vetzuren, aminozuren en pepti-5 den, worden toegepast. Van de assimileerbare stikstofbronnen kunnen b.v. worden genoemd: stikstofverbindingen van microbiale, plantaardige of dierlijke oorsprong en/of anorganische stikstofverbindingen, zoals gistextrakt, pepton, vleesextrakt, gehydrolyseerd caseïne, sojabonen-- meel, maisweekvloeistof, ammoniumzouten en nitraten. Uit een econo-10 misch aspekt gaat de meeste voorkeur uit naar het toepassen van cul-tuurmedia, welke glucose als koolstofbron en sojabonenmeel en maisweekvloeistof als stikstofbronnen bevatten. De componenten van het cultuurmilieu worden opgelost of gesuspendeerd in leidingwater, terwijl het resulterende mengsel 20 - U5 minuten bij- 121ÖC wordt gesteriliseerd. 15 Wanneer reducerende suikers in het cultuurmilieu worden toegepast, dan. worden zij bij voorkeur afzonderlijk gesteriliseerd.

De stammen volgens de uitvinding worden bij 20 -37°C, bij voorkeur bij 28°C, gekweekt.. Het micro-organisme is niet al te gevoelig voor de snelheid van beluchting en roeren. Een cultuur, 20 die in staat is een snelle omzetting te bewerkstelligen, kan worden verkregen door de in een fementeerinrichting van 100 liter gebrachte cultuur met een snelheid van 100 liter lucht /minuut te beluchten en haar te roeren met een snelheid van U00 omw. /minuut; soortgelijke resultaten worden echter verkregen met andere beluchtings- en roersnel-25 heden, die niet aanzienlijk van de bovengenoemde'waarden verschillen.

De substraten, die bij de werkwijze volgens de uitvinding worden toegepast, worden opgelost in een met water mengbaar organisch oplosmiddel, dat geen of'slechts een geringe ongunstige wer- king uitoefent op de funktie van biologische systemen (zoals in etha-30 nol, methanol, dimethylformamide, dimethylsulfoxyde, aceton of tetra-hydrofuran; bij voorkeur in methanol). De oplossing wordt door filtratie gesteriliseerd en dan toegevoegd aan de gekweekte cultuur, die de maximale enzymatische activiteit bezit. De omzetting wordt bij een temperatuur van 22 tot 37°C, bij voorkeur bij 28 - 32°C, uitgevoerd in 35 een vat, dat uitgêrust is met roer- en beluchtingsorganen.

790614® 7

Eet cmzettingsproces kan -worden gescheiden ran het fermenteringsproces -wanneer uit de voor omzetting gerede cultuur eerst een enzympreparaat wordt "bereid. Het enzympreparaat kan worden verkregen door de op zichzelf bekende techniek van het "bereiden van 5 "aceton-droge poeders". Eet resulterende "aeeton-droge poeder" behoudt ongeveer 70% van de oorspronkelijke B-glycosidase- en acetylase-enzymatische activiteiten. De activiteit van het enzympreparaat vermindert bij opslag gedurende 1 maand in een koelinrichting (4 - 6°C) niet.

10. Aan. het eind van de omzetting worden de secundaire glycosiden uit de fermenteringsvloeistof geëxtraheerd met een met water niet mengbaar organisch oplosmiddel (zoals chloroform, dichloor-ethaan, ethylaeetaat, methylisobutylketon, enz.), bij voorkeur met chloroform. De secundaire glycosiden, die aan de mycelia gebonden zijn, 15 kunnen met een met water mengbaar organisch oplosmiddel, zoals ethanol, methanol, aceton, enz., bij voorkeur met methanol, worden opgelost. Het verloop van de omzetting kan door middel van dunnelaagchromatogra-fie worden gevolgd.

De werkwijze volgens de uitvinding wordt met behulp 20 van de volgende voorbeelden nader toegelicht.

Voorbeeld I

Een steriele fysiologische zoutoplossing werd uitge-goten op een 1 week oude cultuur van Streptcmyces griseolus MG 168 (schuine cultuur op aardappei-glucose-agar), en het agaroppervlak ge-25 schraapt met een steriel oog. De uit het schraapsel verkregen suspensie werd toegepast voor het enten van een cultuurmilieu (1 liter, gebracht in een kolf van 3 liter) met de volgende samenstelling: glucose 2%, sojabonenmeel 1%, maisweekvloeistof 0,5% (nat gewicht, berekend voor een gehalte van 50% aan droge stof), pepton 0,2%, calciumcarbo-30 naat 0,3%. De cultuur werd bij 28°C gedurende 36 - H8 uur op een schudinrichting gekweekt. De inhoud van drie kolven werd bijeengevoegd en toegepast om een te gisten vloeistof, die in een Pilot-plant-fer-menteerinriehting met een netto capaciteit van 100 liter en uitgerust met een rcerder, te enten. Aan deze vloeistof werd spijsolie als 35 antischuimmiddel toegevoegd, terwijl de fermentatie werd uitgevoerd 790614¾ 8 ' bij 28°C met een beluchtingssnelheid van 100 liter/minuut en een roer-_ snelheid van ^00 omv./minuut. Ha 36 - U8 uur fermentatie bezat de cultuur de vereiste enzymatische activiteit.

In 10 liter hete methanol werd 500 g lanatoside A op-5 gelost, de oplossing gefiltreerd door een Seits-filter, en het fil-traat onder steriele condities in een geroerde cultuur geleid. Het verloop van de omzetting werd gevolgd door dunnelaagchromatografie (kie-zelgel G-platen; onder toepassing van een 55 : 35 : 10 mengsel van ethylacetaat, cyelohexaan en absolute ethanol als oplosmiddel). Ha 10 1*8 - 60 uur fermenteren verdween het substraat,, terwijl slechts de vlek van de resulterende secundaire verbinding, d.i. digitoxine, op de chromatografische plaat kon worden waargenomen. Aan het einde van de omzetting werd de fermentatievloeistof gefiltreerd. De mycelia werden gemengd met 80 liter methanol, en de suspensie 2 uur geroerd, 15 waarna zij werd gefiltreerd; deze bewerking werd nogmaals herhaald met 80 liter verse methanol, De waterige methanoloplossingen werden bijeengevoegd, bij een temperatuur van beneden 40°C onder verminderde druk ingedampt tot een eindvolume van 5 liter· en het resulterende concentraat 2h uur op 0°C gehouden. De afgescheiden kristallen werden 20 gewassen met 70$*s waterige methanol. De resulterende kristallijne stof wordt in het nu volgende aangeduid als "ruw produkt I". ·

De moederloog en de wasvloeistof die bij de kristal-lisatiestap waren toegepast, werden bijeengevoegd, driemaal geëxtraheerd met telkens 1/2 volume chloroform en de extrakten drooggedampt.

25 De resulterende stof wordt in. het nu volgende aangeduid als "ruw produkt 11".

Het filtraat werd driemaal met telkens 1/2 volume chloroform geëxtraheerd en de extrakten drooggedampt. De resulterende stof is in het nu volgende aangeduid als "ruw produkt III".

30 De ruwe produkten II en III werden bijeengevoegd, op gelost in 5 liter 50$ *s waterige methanol en deze oplossing geschud met 2 liter petroleumether. De petroleumetheroplossing werd verwijderd en de waterige methanolfase drooggedampt. De resulterende stof is in het nu volgende aangeduid als "halfgereed produkt II-III".

35 Het ruwe produkt I werd met het half-gerede produkt II- 7906140 9 4

III gemengd, het mengsel verstoven, opgelost in 5 liter van een 1 : 1 mengsel van henzeen en methanol, onder roeren ontkleurd met houtskool en tenslotte gefiltreerd door een aluminiumoxydelaag. Aan het fil-traat werd onder roeren 2,5 liter leidingwater toegevoegd, waarna 5 men het resulterende mengsel hij 0°C ^8 uur liet kristalliseren. De henzeenfase werd verwijderd, de kristallen werden afgefiltreerd, gewassen met henzeen en daarna met 50$ waterige methanol, en vervolgens hij 50°C gedroogd tot constant gewicht. Verkregen werd 310 g digitoxine met een zuiverheidsgraad van ten minste 97$. Wanneer de moederloog 10 en de was vloeistoffen werden bijeengevoegd en verwerkt, werd nog 25 g extra digitoxine verkregen, waardoor de totale opbrengst 85$ bedroeg. Voorbeeld II

De voor omzetting gerede miero-organisme-cultuur, die volgens voorbeeld I was bereid, werd gefiltreerd, de mycelia met wa-15 ter gewassen en vervolgens in aeeton van -20°C gebracht, waarbij deze aceton de mycelia nog juist bedekte. De suspensie werd 1 uur bij -20°C geroerd, waarna zij koud werd gefiltreerd en de inycelia bij kamertemperatuur werden gedroogd tot constant gewicht. Op deze wijze werd 70 g van een enzympreparaat verkregen.

20 Van dit enzympreparaat, dat maximaal gedurende 1 maand was opgeslagen, werd 70 g onder roeren gesuspendeerd in 80 liter van een 0,01 molaire fosfaatbuffer (pH = 7)» waarna de hete geconcentreerde methanoloplossing van 350 g lanatoside A aan de geroerde suspensie werd toegevoegd. Eet mengsel van het enzympreparaat en het 25 substraat werd bij 28°C geroerd en het verloop van de omzetting gevolgd door middel van dunnelaagChromatografie. ïla li-8 - $0 uur verdween het substraat en kon slechts de voor digitoxine karakteristieke vlek in het chromatogram worden waargenomen. Het mengsel werd verwerkt op de in voorbeeld I beschreven wijze, waarbij 236 g (85$) digitoxine werd 30 verkregen.

Voorbeeld III

Aan de fermentatievloeistof, bereid op de in voorbeeld I beschreven wijze, of aan het enzympreparaat, dat gesuspendeerd was in fosfaatbuffer, bereid op de in voorbeeld II beschreven wijze, werd 35 5 g/l lanatoside 3 toegevoegd. Eet resulterende gitoxine werd uit het 7906140 t 10 milieu afgescheiden volgens een op zichzelf bekende methode. Verkregen werd 3,37 g (85$) gitoxine.

Voorbeeld IV

De in voorbeeld III beschreven werkwijze werd her-5 haald, doch met dit verschil, dat als uitgangsstof 5 g lanatoside C werd toegepast. Verkregen werd 3,34 g (84$) digoxine.

Voorbeeld V

De in voorbeeld III beschreven werkwijze werd herhaald, doch met dit verschil, dat als uitgangsstof nu 5 g acetyldigi-10 toxine werd toegepast. Verkregen werd 3,95 g (85$) digitoxine. Voorbeeld VI

De in voorbeeld. IH beschreven werkwijze werd herhaald, doch met dit verschil, dat nu 5 g acetyl - gitoxine als uitgangsstof werd toegepast. Verkregen werd 3,92 g (84$) gitoxine.

15 Voorbeeld VII

De in voorbeeld III beschreven werkwijze werd herhaald, doch met dit verschil, dat nu 5 g acetyldigoxine als uitgangsstof werd toegëpast. Verkregen werd 3,90 g (85$) digoxine.

Voorbeeld VIII " ..... .....

20 De in voorbeeld III beschreven werkwijze werd her

haald, doch met dit verschil, dat nu 5' g deacetyl-lanatoside A als uitgangsstof werd toegepast. Verkregen werd 3,54 g (84$) digitoxine. Voorbeeld IX

De in voorbeeld III beschreven-werkwijze werd her-25 haald, echter met dit verschil,, dat als uitgangsstof nu 5 g deacetyl-lanatoside B werd toegepast. Verkregen werd 3,55 g (84$) gitoxine. Voorbeeld X

De in. voorbeeld III beschreven werkwijze werd herhaald, doch met dit verschil, dat als uitgangsstof nu 5 g deacetyl-30 lanatoside C werd toegepast. Verkregen werd'3,51 g (83$) digoxine. Voorbeeld XI

De in voorbeelden I of II beschreven werkwijze werd herhaald, met dit verschil dat een mengsel van lanatoside A, lanatoside B, lanatoside C, acetyl-digoxine, acetylgitoxine, acetyldigoxine, 35 deacetyllanatoside A, deacetyllanatoside B en deacetyl-lanatoside C

79 0 6 1 4 0 11 > als substraat werd toegepast in plaats van zuiver lanatoside A. ïïet eindprodukt was een mengsel van digitoxine van de nA"-serie, gitoxine van de ''B"-serie en digoxine van de "C,T-serie, welk mengsel deze verbindingen bevatte in een verhouding overeenkomende met die van de 5 verbindingen van de ,TA"-serie (lanatoside A, deacetyl-lanatoside A, acetyldigitoxine), de "B"-serie (lanatoside B, deacetyl-lanatoside 3, acetylgitoxine), en de "C"-serie (lanatoside C, deacetyl-lanatoside C, acetyldigoxine), welke verbindingen in het uitgangssubstraat aanwezig waren. De omzetting verliep met een opbrengst van Sk%.

790614©

Claims (6)

1. Microbiologische werkwijze voor het bereiden van secundaire digitalis glycosides met de algemene formule 1, waarin en Rg waterstof of hydroxyl voorstellen, met het kenmerk, dat een primair glycoside met de algemene formule 2 waarin:

5 R.j en Rg waterstof of een hydroxylgroep voorstellen, R^ waterstof of een acetylgroep is, en R^ 'waterstof of een D-glucose-eenheid vertegenwoordigt, waarbij ten minste een van de groepen R^ en R^ geen waterstof voorstelt, gefermenteerd wordt met een submerse cultuur van Streptcsmyces 10 griseolus (MNG- 168) of met een enzympreparaat, dat daaruit is verkregen, waarna de resulterende secundaire glyeosiden uit de fermentatie-vloeistof onder toepassing van op zichzelf bekende methoden worden afgescheiden.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het'kenmerk, dat 15 bet enzym op de cel geïmmobiliseerd wordt en de hydrolytische omzetting- met dit geïmmobiliseerde enzympreparaat wordt uitgevoerd.

3. Werkwijze voor het bereiden van secundaire digitalis glycosides met de algemene formule 1 als beschreven in de voorbeelden I t/m XI.

20 U. Secundaire digitalis glycosides met de algemene for mule 1, bereid onder toepassing van de werkwijze volgens een der conclusies 1-3. 7906140 oA

1 LJ H.ji ch3 ,*h fH 'Ή CH5 H _ ck, ii 0H oh3 h \ oV/K^ A&v ' Ηθ\|_/ OH OH 0 A L i__I CHlLH 1 ·H GH3 CH, j *4° I-' OH OH, Richter Gedeon Vegyêszeti Gyar Rt. 7906140