DD146051A5 - Mikrobiologisches verfahren zur herstellung von sekundaeren glykosiden - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von sekundaeren Digitalis-Glykosiden (Digitoxin, Gitoxin und Digoxin) aus den entsprechenden primaeren Glykosiden (Lanatosid A, B und C) und/oder aus den 3'''-Acetylderivaten der sekundaeren Glykoside (Acetyldigitoxin usw.); diese Ausgangsstoffe werden mit der submersen Kultur des neuen Mikroorganismenstammes Streptomyces griseolus MNG 168 oder mit einem aus dieser Kultur hergestellten Enzympraeparat fermentiert.

Description

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Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von sekundären Glykosiden . ..

let der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein mikrobiologisches "Verfahren zur Herstellung von sekundären Digitalisglykosiden der

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allgemeinen Formel I, worin R und R je ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe bedeuten« '

Bekanntlich befinden sich in dem aus den Blättern von Digitalis lanata gewonnenen Glykosidgemisch neben den primären Glykosiden oder Lanatosid-Verbindungen (Lanatosid A, B und C) und den sekundären Glykosiden (Digitoxin, Gitoxin und Digoxin) auch die Acetylderivate der letzteren .(Acetyldigitoxin, Acetylgitoxin und Acetyldigoxin),

Bei der Aufarbeitung der Blätter nach beliebigen bekannten Methoden werden immer solche Gemische von Glykosiden erhalten, von denen nicht alle Komponenten gleichermaßen als Arzneimittel verwendet werden könnenο Es ist also zweckmäßig, Methoden zu suchen, nach welchen die einzelnen Komponenten des Glykosidgemisches in die für therapeutische Zwecke am besten geeigneten Formen gebracht werden können.

Die Verbindungen der Lanatosidreihe unterscheiden sich von den sekundären Glykosiden wie folgt: Während bei den sekundären Glykosiden sich nur drei Digi~ toxose-Einheiten an den Aglykon-Teil des Moleküls anknüpfen, enthalten die Verbindungen der Lanatosidreihe außer diesen Zuckern eine an die dritten Digitoxose gebundene Glucose, wobei die 3'^!'-Hydroxylgruppe der dritten Digitoxose durch Essigsäure verestert ist«

.Zum Abspalten der in ß-Stellung stehenden Glucose bzw. der 3'^!'-Acetylgruppe der Lanatoside sind bereits mehrere Verfahren bekannt. So kann Z₀B. die 3''' '-Acetylgruppe durch sehr milde alkalische Behandlung abgespaltet werden«

Bei der sauren oder alkalischen Hydrolyse von Lanatosid-Verbindungen wird im allgemeinen auch die zwischen dem Aglykon und dem ersten Digitoxose vorhandene Bindung ge~ spalten, es wird also nicht nur die gewünschte termi&ale Glueοse~Abspaltung erreicht, sondern auch die erwähnte weitere, hier unerwünschte Spaltung zu Geninen (Digito.xigenin, Gitoxigenin und Digoxigenin),-'so daß auf diesem Weg sekundäre Herzglykoside aus Lanatosiden nicht erhalten werden können« Die gewünschten sekundären Herzglykoside können aus Lanatosiden vielmehr nur auf umständlichen chemischen Wegen hergestellt werden. ·

Zwar kann durch eine entsprechende Ferrnentierung der Blätter von Digitalis lanata erreicht werden, daß die Verbindungen der sekundären Reihe im Glykosidgemisch angereichert werden; in diesem Pail kann aber das als Arzneimittel wertvolle Lanatosid C nicht aus dem Glykosidgemisch gewonnen werden.

Zur Spaltung von Verbindungen der Lanatosidreihe sind seit längerer Zeit auch mikrobiologische Verfahren bekannt« So kann die terminale Glucose mit Hilfe von Schimmelpilz-Kulturen oder von daraus hergestellten ß-Glucosidaseen abgespalten werden,, A₀ Stoll und seine Mitarbeiter haben zuerst die lanatosidspaltende Aktivität von Schimmelpilzen untersucht-(vgl. HeIv₁₁ Chim, Acta ^A, 397-401 (1951))« Die terminale Glucose von Lanatosiden konnte mit Hil^fe des aus der Kultur von verschiedenen Schimmelpilzarten (meistens von Aspergillus-Arten). durch Behandlung mit Acetontrockenpulver abgespalten werden. So ist es bekannt (CS-PS 108 046)5 ein aus Aspergillus orizae gewon~ nenes Enzympräparat zur Herstellung von acetylierten sekundären Glykosiden zu verwenden. Die Acetylase-Aktivität der Schimmelpilzkulturen ist aber nicht mit ihrer ß~Glu~ cosidase-Aktivität vergleichbar; deshalb wird dieses Verfahren im allgemeinen nur zur Hersteilung von acetylierten Verbindungen der sekundären Reihe benutzt.

Ziel der Erfindung

Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von Verbindungen der sekundären Reihe aus Lanatosiden, und zwar mit Hilfe von solchen Mikroorganismen, die neben der ß-Glucosidase-Aktivitat auch eine entsprechende Acetylase-Aktivität aufweisen_f so daß sie das Substrat' mit großer Geschwindigkeit und in hoher Konzentration derart umsetzen können, daß dabei sowohl die Glucose als auch die Acetyl« gruppe in ein und derselben Permentation abgespalten werden«

Weiterhin wird von den zu diesem Zweck verwendbaren Mikroorganismen noch gefordert, daß die erwähnten beiden Aktivitäten, d.h. die ß-Glucosidase- und die Acetylase-Akti-Vitat, praktisch gleich stark sein sollen und daß während der Umsetzung sich keine Zwischenprodukte (Acetylderivate der sekundären Reihe, bzw» Desacetyl-lanatoside, auch als Purpurea-Glykoside bekannt) anhäufen sollen. Es ist also erwünscht, daß die zu verwendenden Mikroorganismen fähig sein sollen, sekundäre Glykoside sowohl aus den Acetylderivaten der sekundären Glykoside (wobei die Acetylase-Aktivität zur Geltung kommt) als auch aus den Purpurea-Glykosiden (wobei die ß-Glykosiden-Aktivität die entscheidende Rolle spielt) herzustellen.

Darlegung des Weseris der Erfindung;

Es wurde nun gefunden, daß es möglich ist, die den obigen Forderungen entsprechenden Ergebnisse mit Hilfe eines zum Genus Streptomyces gehörenden, sich durch eine hervorragend hohe Enzymaktivität auszeichnenden Mikroorganismenstammes zu erzielen. Dieser neue Mikroorganismenstamm wurde als Streptomyces griseolus identifiziert und von der Anmelderin in der Ungarischen Nationalen Mikroorganisraenstamm-Sammlung des Ungarischen Landesinstituts für Hygiene unter der Ur* MNG 168 hinterlegt.

Die Erfindung ist demnach ein neues Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von sekundären Digitalisglykosiden der oben definierten allgemeinen Formel I, worin

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R und R Wasserstoffatome oder Hydroxylgruppen bedeuten, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man primäre Glykoside der allgemeinen Formel II, worin R und R² je ein. Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe ₉ R^ ein Wasserstoffatom oder eine Acety!gruppe und R ein -Wasserstoffatom oder eine D-GlUcοsegruppe bedeuten, aber R und R nicht beide zugleich Wasserstoff bedeuten können, mit einer

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submeren Kultur des .Stammes Streptomyces griseolus ItETG l68 oder mit einem aus einer solchen Kultur hergestellten Enzympräparat in Berührung bringt und die erhaltenen sekundären Glykoside aus der Ferraentationsflüssigkeit in an sich bekannter V/eise isoliert.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsart des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Enzym an den Mikroorganismenzellen fixiert und die hydrolytische Umsetzung mit dem auf diese Weise gebundenen Enzympräparat -durchgeführte

Der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Mikroorganismenstamm wurde aus einem Bodenmuster isoliert; der Stamm zeigte die folgenden taxonomischen Eigenschaften:

Morp^oJ^o^iej^ Die Sporenträger zeigen sympodiale Verzweigungen, haben gerade Endungen; Spiralen oder Schlingen kommen nicht vor. Im Lichtmikroskop sind die Sporen eiförmig,ihre Größe ist 0,7-0,9 χ 0,9-1,1 ,u,

Wachstum an verschiedenen Nährböden:

§^££^§X2^zi3i£Eä£z^£Si!L£. Wachstum farblos, später grau; die Luftmyzelien sind dünn, weiß, später olivgrün« Schwaches braunes Pigment diffundiert in das Agar.

Tyro sin-Agar: Melanin negativ_o Die Luftmyzelien und das gesamte Wachstum zeigen lockere Struktur,, Bin hellbraunes lösliches Pigment diffundiert in das Agar*

MHä^zäES^l, Kompaktes, starkes Wachstum, anfangs grau, später bräunlich.» Die Luftmyzelien sind dünn, staubig, hellgrau;, kein lösliches Pigment«

Bennett-Asar: Wachstum kremfarbig, dunkelt sich mit der Zeit zu bräunliche. Die Luftmyzelien sind dünn, aber kompakt

mit staubiger Struktur und von blaugrauer Farbeο

Glukose-Asparaffin-Aprar:, V/ach st um grau, dunkelgrau, später stellenweise schwarz» Luftmyzelien werden nur stellenweise gebildet, mit mausgrauer Farbe. Wenig braunes lösliches Pigment diffundiert in das Agar.

Bouillon-ÄffarI₁ Wachstum dick, grau, wird runzelig. Weder Luftmyzelien, noch lösliches Pigment werden gebildet.

Calciummalat^A^ar^ Rasches Wachstum, hellgrau, später dunkelgrauo Die Luftmyzelien sind blaugrau, stellenweise in Flecken olivgrün* Sehr wenig bräunliches, lösliches Pigment diffundiert in das Agar.

Kartoffel-Glucose-Agari Das Wachstum zeigt mittlere Ge-

—~Tt~——~— · ————"—— . °

sehwindigkeit, breitet sich aber stark aus, mit brauner Farbe* Die Luftmyzelien sind in der Mitte samtig, blaugrau, kriechen am Rand der Kolonie spinnengewebeartig auseinander_β Wenig, hellbraunes lösliches Pigment diffun~ . diert in das Agar_e

Maismeh1-Agarj_ Wachstum hellbraun, die Luftmyzelien sind staubig, dünn, anfangs hellgrau, später blaugrau. Kein lösliches Pigmente

&^££ΐ^ΐ^2Λ^3^Αβ2^1,, Wachstum grau, graubraun, zuletzt schwarz, stark gerunzelt,, Die Luftmyzelien sind gipsartig, staubig, gleichmäßig arschgrau. V/enig, aber ausgeprägt braunes lösliches Pigment diffundiert in das Agar»

^ ^Das wachsende

Bodenmyzel ist hellbraun, die-Luftmyzelien sind dünn, hellgrau, gipsartig* trocken, es entsteht ein schwach braunes lösliches Pigment«

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Kartoffelscheibe; Starkes und rasches Wachstum, mit sich grob runzelnder Oberfläche; anfangs grau, später schwarz« Die Luftmyzelien'sind aschgrau, das lösliche Pigment braun.

Löffler'scher geronnener Molke-Hährboden^^ braunes Wachstum, starke proteolytische Aktivität,

Cellulose als, einzige Kohlenstoffquelle; gutes Wachstum. Hitrat re d uk ti ο'η: _ι positiv» Gelatine-Verflüssigung: positiv.

Milche starke Koagulation und starke Peptonisation werden beobachtet. . -....· .

zi^Säiü. Wachstum runzelig, olivgrün; Luftmyzelien hellgrau; schwache Beta~Hämolyse_o

AssimilationvonKohlenstoffquellen:

D-Glucose: . . + D~Sorbit: schwach

D-Galaktose: ++ lösliche Stärke: ++

Saccharose: + D-Sylose +

Maltose:. < + L-Rhamnose: . -i-

Lactose: + Galaktits

Raffinose: " + D-Mannit; . +

L-Sorbοse: - Inosit: +

Cellobiose: + D-Fructose; +

Trehalose: ++ D-Männose: + Glycerin

Auf Grund der obigen charakteristischen Eigenschaften gehört der neue Stamm zur Art Streptomyces griseolus (Waksman) Waksman et Henrici 1948..(VgI. Waksman:.-The Actinomyce'tes, VoIe 2, The Williams Wilkins Company, Baltimore_? 1963ij

S. 22-223)·

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Zum Züchten der im erfindungsgemäßen Verfahren angewendeten Mikroorganismen können die bei dem Züchten von Strahlenpilzen allgemein üblichen Methoden angewendet werden. Die Züchtung erfolgt am vorteilhaftesten in submerser Kultur. Der zum Züchten geeignete Nährboden kann i η Wasser gelöste bzw. suspendierte, durch die Pilze assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze und sonstige übliche Zusätze (Biosstoffe, Antischaummittel usvi») enthalten. - ·

Als Kohlenstoffquelle können Malz, Glucose, Maltose_? Saccharose oder andere Zucker, Fette, Fettsäuren, Aminosäuren und Peptide eingesetzt werden· Als assimilierbare Stickstoffquellen kommen Stickstoffverbindungen mikrobialer, tierischer oder pflanzlicher Herkunt und/oder anorganische Stickstoffverbindungen^, wie Hefeextrakt, Peptcfn, Fleischextrakt,' hydrolysiert.es Kasein, Sojamehl, Mais« quellwasser, Ammoniumsalze und Nitrate in Betracht".

Unter Berücksichtigung auch von wirtschaftlichen Gesichtspunkten können am vorteilhaftesten Glucose als Kohlenstoff quelle und Sojamehl und/oder Maisquellwasser· als Stickstoffquelle im Nährboden verwendet werden« Die Bestandteile des Nährbodens werden in Leitungswasser gelöst bzw«, suspendiert und zusammen bei 121⁰C 20 bis 45 Minuten sterilisiert, mit Ausnahme der reduzierenden Zucker, da diese zweckmäßig separat sterilisiert werden.

Die Züchtung der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mikroorganismen kann bei 22 bis 37°C, vorzugsweise bei 28 C, erfolgen. Diese Mikroorganismen sind gegenüber der Belüftung und der Umdrehungszahl des Rührwerkers nicht besonders empfindlich; im allgemeinen können in einer 100 Permentierungseinrichtung mit einer Belüftungsgeschwindig- keit von 100 l/min mit einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/MIN gute, zur raschen Umsetzung geeignete Kulturen erhalten

werden; ähnlich gute Ergebnisse konnten aber, auch mit davon nicht allzusehr abweichenden anderen Belüftungsgeschwindigkeiten und Rührwerk-Umdrehungszahlen erzielt werden.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren umzusetzenden Substrate werden in mit Wasser mischbaren und die Funktion von biologischen Systemen nicht oder nur mäßig schädigenden organischen Lösungsmitteln (Methanol, Äthanol, Dimehtylformamid, Aceton, Tetrahydrofuran), vorteilhaft in Methanol, gelöst, die Lösung durch Filtrieren sterilisiert und dann der voll entwickelten, maximale Enzymaktivität zeigenden Kultur zugegeben« Die Umsetzung wird in einem belüfteten, mit Rührwerk ausgerüsteten Gefäß bei 22 bis 37 C, vorzugsweise bei 28 C bis 32 C, durchgeführt.

Die Umsetzung kann auch gesondert von dem Fermentationsvorgang durchgeführt werden, indem man aus der zur Umsetzung bereits geeigneten Kultur ein Enzympräparat herstellt und dieses zur Umsetzung verwendet» Das Enzympräparat kann nach der allgemein bekannten Methode der Herstellung von =durch Behandlung mit Aceton gewonnenen trockenen Pulvern" hergestellt werden« Etwa 70 % der gesamten ß-Glucosidase- und Acetylase-Aktivität der Kultur ist in diesem Acetontrockenpulver enthalten« Die Aktivität derartiger trockener Enzympräparate bleibt bei einmonatiger Lagerung bei 4 C bis 6 C voll erhalten«

Nach der Beendigung der Umsetzung werden die in der Fermentationsflüssigkeit anwesenden sekundären Glykoside mit einem mit V/asser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel (öloroform, Dichloräthan_f Äthylacetat,. Methylisobuty!keton uswo), besonders mit Chloroform,' aus der Fermentationsflüssigkeit extrahierte Das Ablösen der zum Myzel gebundenen sekundären Glykoside kann durch die Zugabe von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln (Methanol, Äthanol, Aceton usw«), besonders von Methanol, erleichtert werden. Während der Herstellung kann, das Fortschreiten der

Umsetzung mit Hilfe von Dünnschichtchromatographie verfolgt werden.

Au s fUh r u ngsb. eis.p:±elej__

Die praktische Durchführung und die näheren Einzelheiten des erfindungsgemäßen. Verfahrens werden durch die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht. ·

Beispiel _i 1

Eine auf schrägem Kartoffelglucose-Agar gezüchtete einwb'chige Kultur des Stammes Streptonryces griseolus MG 168 wird mit steriler physiologischer Kochsalzlösung überschüttet und die Oberfläche des Agar mit einer sterilen Platinschleife aufgekratzte Mit der auf diese Weise erhaltenen Mikroorganismensuspension wird ein Inokulum-lTährboden folgender Zusammensetzung eingeimpft: 2 % Glucose, 1 % Sojamehl, 0,5 % llaisquellwasser (feuchtes Gewicht, auf 50 % Trockensubstanz berechnet), 0,2 % Pepton, 0,3 % Calciumcarbonate Gesamtvolumen 1 Liter sterilisiert in 3 1 Erlenmeyerkolben. Die Kultur wird auf einer Schüttelmaschine bei 28 G 36 bis 48 Stunden geschüttelt« Drei solche Inokulum-Kulturen werden parallel hergestellt und die auf diese Weise gewonnenen 3 Liter Inokulum-Kulturen werden zum Einimpfen des in einer mit einem Rührwerk ausgerüsteten Permentiei'ungseinrichtung von 100 Liter Rauminhalt zubereiteten Ifährmediums gleicher Zusammensetzung verwendet* Während der Fermentation wird das Medium mit 400 U/min gerührt und mit 100 l/min Luftstrom belüftet. Als Antischaummittel wird Speiseöl verwendet« Die Fermentation wird bei 28⁰C 36 bis 48 Stunden lang fortgeführt,, um die zur Umsetzung erforderliche Enz.ymaktivität zu erreichen* ' · ' '

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500 g Lanatosid A werden in 10 1 heißem Methanol gelöst, die Lösung durch einen Seitz-Filter abfiltriert und dann unter sterilen Bedingungen und Rühren der auf obige Y/eise zubereiteten Perraentationsflüssigkeit zugesetzte Das Portschreiten der Unisetzung wird mit Hilfe von Dünnschichtchromatographie (auf Merck "Kieselgel G·¹¹ Platten; Laufmittels 55:35^10 Gemisch von Äthylacetat, Cyclohexan und abs,, Äthanol) verfolgte Der Fleck des Substrats verschwindet nach 48 bis 60 Stunden und auf der Platte ist nur mehr die entstandene Verbindung der sekundären Reihe, dasDigitoxin sichtbar« Nach voller Umsetzung wird die. Fermentationsflüssigkeit filtriert* Das Myzel wird mit 80 1 Methanol 2 Stunden gerührt, filtriert und mit weiteren 80 1 Methanol wieder 2 Stunden gerührt. Die methanolischwäßrigen' Waschflüssigkeiten werden vereinigt, im Vakuum bei höchstens 40⁰C auf 5 Liter eingeengt und bei O⁰C 24 Stunden zum Kristallisieren stehen gelassen«, Die erhaltenen Kristalle werden mit 70 %igem wäßrigem Methanol gewaschen (rohjces Produkt I), Die Mutterlaugen und Waschflüssigkeiten der Kristallisierung werden mit je 1/2 VoI₀ Chloroform dreimal extrahiert und die vereinigten Extrakte zur Trockne eingedampft (rohes Produkt II)_e

Das Filtrat der Fermentationsflüssigkeit wird ebenfalls mit je 1/2_tVoI₆ Chloroform dreimal extrahiert und die vereinigten Extrakte zur Trockne eingedampft (rohes Produkt III).

Die vereinigten rohen Produkte II und II werden mit. 5 Liter 50 %igem wäßrigem Methanol aufgenommen und mit 2 Liter Petroläther extrahiert» Die wäßrig*methanolische Phase wird zur Trockne eingedampft (halbfertiges Produkt. II-III); die Petroläther-Phase wird verworfen* '

Das rohe Produkt I wird mit dem halbfertigen Produkt H-III vereinigt« pulverisiert und in 5 Liter eines 1;1 Gemisches

von Mehtanol und Benzol gelöst» Die Lösung wird mit Aktivkohle gerührt und durch eine Aluminiumoxydschicht filtriert» Das Piltrat wird unter Rühren mit 2,5 Liter Leitungswasser versetzt und bei O⁰G 48 Stunden zum Kristallisieren stehen gelassen. Die Benzolphase wird verworfen, die Kristalle werden abfiltriert, mit Benzol und dann mit einem 1:1 Gemisch von Methanol und Wasser gewaschen und schließlich bei 50⁰C bis auf Konstantgewicht getrocknete Auf... diese Weise werden 310 g Digitoxin (Reinheit mindestens 97 %) erhaltene Die Mutterlaugen und ,Waschflüssigkeiten der

auf Kristallisierung werden vereinigt und ebenfalls die obige Weise aufgearbeitet, wobei weitere 25 g Digitoxin erhalten werden* Gesamtausbeute; 85 %. .

Beispiel 2 .

Sine nach der im Beispiel 1 beschriebenen Weise erhaltene, zur Umsetzung bereits geeignete Kultur des Mikroorganismenstammes wird abfiltriert, das Myzel mit Wasser gewaschen, dann in eine solche Menge von auf -20 C abgekühltem Aceton eingelegt, daß die Flüssigkeit die Myzelmasse überdefekt„ Das MyzeX wird in dem bei -20 C gehaltenen Aceton eine Stunde gerührt, dann kalt abfiltriert und bei Raumtemperatur auf Konstantgewicht getrocknet* Auf diese Weise werden 70 g trockenes Enzympräparat erhalten«

70 g Enzympräparat ( das nicht älter ist, als 1 Monat) werden in 80 Liter 0,01 M Phosphat-Pufferlösung (pH = 7) unter Rühren suspendiert5 dann wird unter weiterem Rühren die heiße konzentrierte methanolische. Lösung von 350 g Lanatosid A zugegeben« Das Gemisch wird bei 28⁰O weiter gerührt und das Fortschreiten der Umsetzung durch Dünnschichtchromatographie verfolgt» lach 45 bis 60 Stunden zeigt sich der Fleck des Ausgangsatoffes nicht mehr, es ist nur der Fleck von Digitoxin sichtbare Das Reaktionsgemisch wird auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet; es

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--13- Z 1 4- 8 Pi

werden 236 g Digitoxin (85 % d. Th„) erhalten. Beispiel ^₁

Zu 1 Liter nach Beispiel 1 erhaltenem Enzymaktiven Permentationsmedium werden 5 g Lanatosid B zugegeben. Nach .der Beendigung der Umsetzung wird das Reaktionsgemisch in der beschriebenen Weise aufgearbeitet; es werden 3,37 g Gitoxin (85 % d. Th.) erhalten.

Ähnliche Ergebnisse werden erhalten, wenn man das Lanatosid B zu 1 Liter nach Beispiel 2 erhaltenem, in Phosphat-Pufferlösung suspendiertem Enzympräparat zugibt.

Beispiel. 4,

5 g Lantosid G werden nach Beispiel 3 behandelt; es werden 3,34 g Digoxin (84 % d_o Th.) erhalten»

5. g Acetyldigitoxin werden nach Beispiel 3 behandelt; es werden 3?95 g (85 % d. Th.) Digitoxin erhalten..

5 g Acetiylgitoxin werden auf die im Beispiel 3 beschriebene Weise umgesetzt; es werden 3,92 g (84 % d₀ Th.) Gitoxin erhalten.

5 g Acetyldigoxin werden nach der im Beispiel 3 beschrie benen Weise umgesetzt; es werden 3_s90 g Digoxin (84 % d₀ erhalten.

„ 14 „

Beispiel·.....8' ·'

5 g Desacetyl-lanatosid A werden auf die im Beispiel 3 beschriebene V/eise umgesetzt; es werden 3,54.g Digitoxin (84 % d, Th.) erhalten«,

Beispiel 9

5 g Desacetyl-lanatosid B werden nach der im Beispiel 3 beschriebenen Weise umgesetzt; es werden 3,55 g Gitoxin (84 % do Th₀) erhalten.

Beispiel 10

5 g Desacetyl-lanatosid C werden auf die im Beispiel 3 beschriebene V/eise umgesetzt; es werden 3,51 g Digoxin (83 % d. Th.) erhalten.

Beispiel .11

Es wird in allen Einzelheiten nach der in den Beispielen 1 oder 2 beschriebenen Weise gearbeitet, mit dem Unterschied, daß anstelle von reinem Lanatosid A beliebige Gemische von Lanatosid'A, Lanatosid B, Lanatosid 0, Desacetyl-lanatosid A, Desacetyl-lanatosid B, Desacetyl-lanatosid Cj" Acetyldigitoxin, Acetylgitoxin und/oder Acetyldigoxin als Ausgangsstoffe eingesetzt werden. Als Endprodukte 'werden in jedem Pail entsprechende Gemische von Digitoxin als Verbindung der Reihe A, Gitoxin als Verbindung der Reihe B und Digoxin als Verbindung der Reihe C erhalten, wobei die Mengenverhältnisse dieser drei sekundären Glykoside jeweils jenen Mengenverhältnissen entsprechen_? in welchen die Verbindungen der Reihe A (Lanatosid Aj Desacetyl-lanatosid A, Acetyldigitoxin)_s die Ver~- bindungen der Reihe B (Lanatosid B, Desacetyl-lanatosid B,

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Acetylgitoxin) und die Verbindungen der Reihe C (Lanatosid C, Desacetylvlanatosid 0, Acetyldigoxin) in dem als Ausgangsstoff eingesetzten Glykosidgemisch vorhanden waren. Die Ausbeute an sekundären Glykosiden beträgt im allgemeinen 84 %<,

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Claims (1)

1. -IS-

   Erfindungsan spruch

   Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von sekundären Digitalis-Glykosiden der allgemeinen Formel 1,

   12

   worin R und R je ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe bedeuten, gekennzeichnet dadurch, daß man primäre Digitalisglykoside und/oder Acetylderivate von sekundären Digitalis-Glykosiden der allgemeinen Formel II,

   12 3

   worin R und R die obigen Bedeutungen haben, R ein Wasserstoffatom oder eine·Acetylgruppe und R ein Wasser-

   3 stoffatom oder eine D-Glucosegruppe bedeuten, aber R und R nicht beide zugleich Wasserstoff bedeuten können, mit einer submeren Kultur des Stammes Streptomyces griseolus MNG- 168 oder mit einem aus einer solchen Kultur hergestellten Enzympräparat fermentiert und die erhaltenen sekundären Glykoside aus der Fermentationsflüssigkeit in an sich bekannter Weise isoliert.

   Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man das Enzym auf den Mikroorganismenzellen fixiert und die hydrolytische Umsetzung mit dem auf diese Weise fixierten Enzympräparat durchführt.

   ^...Seiten Formell