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Verfahren zur Herstellung vonA-Steroiden
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Al -Dehydro-steroiden durch mikrobiologische Dehydrierung.
Es ist bekannt, dass durch Ausbildung einer Al-Doppelbindung im Molekül verschiedener Steroide, wie z. B. der Corticosteroide oder des 17-Methyltestosterons eine wesentliche Erhöhung der therapeutischen Wirkung dieser Steroide erzielt werden kann. Eine andere wichtige Anwendungsmöglichkeit der Al-Dehydrierung wurde durch die Erkenntnis geschaffen, dass die aus Al-3-Ketosteroiden auf diesem Weg herstellbare A 1,*-3-Ketosteroide nach Inhoffen aromatisierbar sind, so kann z. B. das A-Andro- stadien-dion auf diese Weise in Östron übergeführt werden.
Ferner können die A 1, 4 -3- Ketosteroide mit p-Toluolsulfonsäure in Gegenwart von Essigsäureanhydrid in Verbindungen übergeführt werden, die am aromatischen A-Ring in der 1-Stellung durch eine Methylgruppe substituiert sind.
Nach der bisherigen Literatur kann eine Al-Doppelbindung im Sterangerüst durch die folgenden Mikroorganismen ausgebildet werden :
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<tb>
<tb> 2,Bacterium <SEP> cyclo-oxydans <SEP> USA-Patentschrift <SEP> Nr. <SEP> 2, <SEP> 822,318
<tb> Colletotrichum <SEP> atramentarium <SEP> brit. <SEP> Patentschrift <SEP> Nr. <SEP> 805, <SEP> 563
<tb> Azotomonas <SEP> sp. <SEP> USA-Patentschrift <SEP> Nr. <SEP> 2, <SEP> 992,973
<tb> Azotobacter <SEP> sp. <SEP> USA-Patentschrift <SEP> Nr. <SEP> 2, <SEP> 992,973
<tb> Micobacterium <SEP> sp. <SEP> USA-Patentschrift <SEP> Nr. <SEP> 2, <SEP> 905,592
<tb> Pseudomonas <SEP> sp. <SEP> USA-Patentschrift <SEP> Nr. <SEP> 3, <SEP> 037,915
<tb> Serratia <SEP> sp. <SEP> USA-Patentschrift <SEP> Nr. <SEP> 3,037, <SEP> 915
<tb> Bact. <SEP> havaniensis <SEP> USA-Patentschrift <SEP> Nr.
<SEP> 3, <SEP> 037,914
<tb> Bact. <SEP> mycoides <SEP> USA-Patentschrift <SEP> Nr. <SEP> 3,037, <SEP> 913
<tb> Streptomyces <SEP> sp. <SEP> USA-Patentschrift <SEP> Nr. <SEP> 3, <SEP> 039,937
<tb>
Wir haben nun gefunden, dass ein neuer, von uns aus einem Bodenmuster isolierter und als "K9-2" bezeichneter Mikroorganismus, welcher am l. März 1963 beim Ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen unter Nr. 21/1963 deponiert wurde, sehr vorteilhaft zur Ausbildung der Al-Doppelbindung in verschiedenen Steroiden angewendet werden kann. Dieser neue Mikroorganismus K9-2 zeichnet sich gegenüber den bekannten, zu diesem Zweck anwendbaren Mikroorganismen durch die Eigenschaft aus, dass
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Stäbchen, die oft in Paaren beobachtbar sind.
Sie sind sich lebhaft bewegende, an den Elektronenmikroskop-Aufnahmen bipolar erscheinende Organismen mit lophotrichen Flagellen, welche länger als die Bakterienkörper und schwach gewellt sind. Unter dem Phasenkontrast-Mikroskop sind in den Zellen bipolare, mehr oder minder ausgeprägte Lichtbrechung zeigende Körnchen beobachtbar. Die Zellen färben sich gram-negativ. Sie zeigen an Kartoffel-Agar und an Pepton-Agar bei PH = 7,2 gleichmässig gutes, an Asparagin-Agar und Sabouraud-Agar weniger gutes bzw. schlechtes Wachstum. An Sorbit-Agar ist kein Wachstum beobachtbar. An Kartoffel-Schnitten entwickeln sie sich innerhalb von 5 Tagen.
An gelatinehaltigem Nährboden entwickeln sie sich gut und rufen keine Verflüssigung hervor. Peptonwasser wird von den Organismen leicht getrübt, es wird ein reichliches Sediment, aber an der Oberfläche keine Haut gebildet. Auch an 6% Alkohol enthaltendem Bouillon können sich die Organismen entwickeln. Der Alkohol wird dabei nicht zu Essigsäure oxydiert. Bei 24 und 280 C zeigen die Organismen gleich gutes, bei 370 C aber nur schwaches Wachstum. Sie bilden kein Indol, reduzieren das Nitrat nicht, Lakmusmilch wird von ihnen schwach alkalisch gemacht, aber nicht koaguliert. Sie beanspruchen zu ihrem Wachstum keine Glukose ; sie können sich an Saccharose, Mannit, Glukose oder Maltose enthaltenden Nährböden gut entwickeln, in Gegenwart von Lactose ist aber ihr Wachstum langsamer. In acht Wochen wird aus diesen Zuckern keine Säure produziert.
Die Organismen bilden an Kartoffel-Agarplatten glänzende, meistens radial geriffelte Kolonien, die am Rand gekerbt sind. Die Ränder der Kolonien sind durchscheinend, die Mitte hebt sich hervor, in Seitenansicht sind die Kolonien etwas kegelförmig. Sie zeigen graulichdrappe Farbe, das Zentrum ist kompakter, in der Durchsicht ist das dunklere Zentrum von einem lichteren Hof umgeben. An gelatinehaltigem Nährboden bilden die Organismen lichtdrappe, konkave, glänzende, durchscheinende, runde Kolonien.
Auf Grund der untersuchten Eigenschaften entspricht dieser Organismus in seinen Hauptzügen den in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 6. Ausgabe, S. 412 beschriebenen Eigenschaften des AIcaligenes faecalis. Es bestehen aber die folgenden Abweichungen : nach den zur Identifizierung erforderlichen Daten ist die für das Wachstum des A. faecalis optimale Temperatur 370 C, die Zellen haben peritriche Flagellen und die Kultur hat keinen charakteristischen Geruch. Der Stamm K9-2 wächst dagegen bei 24 und 280 C besser als bei 370 C, hat bipolare lophotriche Flagellen und die Kultur hat Fischgeruch. Nach V. B. D. Skerman,"A Guide to the Identification of the Genera of Bacteria" (Williams & Wilkins Co., Baltimore 2, Maryland [1959]) sind die beiden ersten Abweichungen zulässig, der Geruch wird hier nicht erwähnt.
Auf diesem Grund ist der Stamm K9-2 als ein neuer Stamm Alcaligenes faecalis identifizierbar.
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Dieser Organismus kann an den verschiedensten, organische Stoffe enthaltenden Nährböden gezüchtet werden. Er wurde von uns vorteilhaft an den mit SA 5-G bzw. PA bezeichneten Nährböden gezüchtet, die die folgende Zusammensetzung hatten :
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<tb> Nährboden <SEP> SA <SEP> 5-G <SEP> : <SEP> Pepton <SEP> 250 <SEP> g <SEP>
<tb> Fleischextrakt <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Bierhefeextrakt <SEP> 9 <SEP> ml
<tb> Leitungswasser <SEP> zu <SEP> 51
<tb> PH <SEP> 6, <SEP> 5-7
<tb> Nährboden <SEP> PA <SEP> : <SEP> Pepton <SEP> 75 <SEP> g
<tb> Asparagin <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> zu <SEP> 5 <SEP> I <SEP>
<tb> PH <SEP> 7
<tb>
Die Erhaltung des Stammes erfolgte an einem Kartoffel-Agar Nährboden mit wöchentlichen Umimpfungen.
Das umzusetzende Steroid wurde in organischen Lösungsmitteln, z. B. in Aceton oder Alkohol, gelöst zur Kultur des Organismus zugesetzt. Die Umsetzung der Steroide wurde durch qualitative und quantitative Chromatographie verfolgt. Im letzteren Fall wurde derart vorgegangen, dass das Fermentationsmedium mit einem organischen Lösungsmittel von entsprechender Polarität, z. B. mit Dichloräthan, extrahiert wurde. Der Extrakt wurde verdampft, der Verdampfungsrückstand z. B. im Gemisch von Aceton und Chloroform gelöst, u. zw. derart, dass der Steroidgehalt des erhaltenen Konzentrats etwa 4 mg/ml sein soll.
Aus dieser Lösung wurden 50 - 100 ut auf ein vorher in Form eines überfliessenden Chromatogrammes mit Äthanol gewaschenes Macherey-Nagel Papier Nr. 214 getropft, wobei das Imprägnieren des Papiers vor dem Auftropfen unter Berücksichtigung der Polarität des zu untersuchenden Steroidgemisches erfolgte. War der Ausgangsstoff z. B. A4-Androstendion oder 17-Methyltestosteron, dann wurde das Pa-
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: 1de. In diesem System zeigte das A-Androstendion einen Rf-Wert von 0,68, das A-Androstadiendion 0, 41, das 17-Methyltestosteron 0, 20 und das A-17-Methyltestosteron von etwa 0, 10.
Der den Steroiden entsprechende Fleck wurde am Papierchromatogramm durch Ultraviolett-Kontakt-Photographie nachgewiesen, der den Fleck enthaltende Papierteil wurde ausgeschnitten, mit 10 ml abs. Äthanol p. a. eluiert, die Extinktion des Eluats bei 242 mp gemessen und der dem Messwert nach Abzug des entsprechenden Blindwertes (des mit einem aus steroidfreiem Papierausschnitt hergestellten Eluat erhaltenen Messwertes) entsprechende Steroidgehalt der Lösung wurde von der Standardkurve abgelesen. Wenn aber z.
B. die Reichstein'sche Verbindung S der Ausgangsstoff war, dann wurde das Papier mit 300/0 Äthylenglykol enthaltendem Methanol imprägniert, wobei ein mit Äthylenglykol gesättigtes Gemisch von Kohlenstofftetrachlorid und Dichloräthan 1 : 1 als mobile Phase angewendet wurde ; im weiteren war das Verfahren gleich dem oben beschriebenen. In diesem System zeigte die Reichstein'sche Verbindung S einen
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den sollte, wurde die Menge des entstandenenSteroids nach der in der ungarischen Patentschrift Nr. 150244 beschriebenen Thiosemicarbazon-Methode bestimmt.
Der Gegenstand der Erfindung ist also ein Verfahren zur Herstellung von 6. 1 - Dehydro-steroiden durch mikrobiologische Umsetzung von 1, 2-gesättigten Steroidverbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umsetzung mit einem Alcaligenes faecalis K9-2 Stamm durchführt und das entstandene Al-Dehydro- - steroid nach an sich bekannten Methoden isoliert. Die mikrobiologische Umsetzung wird an einem Pepton, Fleischextrakt und Bierhefeextrakt oder Pepton und Asparagin enthaltenden Nährboden, bei etwa 280 C durchgeführt. Als umzusetzendes Substrat können verschiedene Steroide, z. B. 17-Methyltestosteron, die Reichstein'sche Verbindung S usw. angewendet werden.
Das Verfahren wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiel l : Eine in Kartoffel-Agar enthaltenden Roux-Flasche gezüchtete, 2 Tage alte Kultur des Stammes K9-2 wurde mit 100 ml sterilem Wasser abgewaschen. Mit 50 ml der so erhaltenen Suspension wurden 5 1 SA 5-G Nährboden in einem 10 1 Glasfermentor unter sterilen Bedingungen eingeimpft. Der Fermentor wurde in ein Wasserbad von 280 C gestellt, mit 300 Umdr/min gerührt und die Kultur mit 5 1
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Luft pro min belüftet. Nach 16 h Inkubation wurde 1 g Methyltestosteron in 50 ml Aceton gelöst der Kultur zugesetzt. In Zeitintervallen von 6 h wurden aus dem Fermentor Muster von je 100 ml entnommen, diese wurden dreimal mit je 1/3 Volumen Dichloräthan extrahiert, die Extrakte wurden getrocknet, verdampft und der Verdampfungsrückstand wurde zur quantitativen papierchromatographischen Analyse aufgetropft.
Der Al-Dehydro-methyltestosteron-Gehalt im Fermentor hat sich nach diesen Messungen folgendermassen gestaltet :
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<tb>
<tb> nach <SEP> 6h <SEP> 425 <SEP> mg <SEP>
<tb> nach <SEP> 12 <SEP> h <SEP> 640 <SEP> mg <SEP>
<tb> nach <SEP> 18 <SEP> h <SEP> 1000 <SEP> mg. <SEP>
<tb>
Das 17-Methyltestosteron wurde also durch den Organismus quantitativ in das A-Dehydro-Derivat übergeführt.
Beispiel 2: Der Organismus wurde in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise gezüchtet. Nach 16 h Inkubation wurde die Kultur in sterile 500 ml Erlenmeyer-Kolben in Portionen von je 100 ml verteilt. Zu fünf Kolben wurden je 20 mg 17-Methyltestosteron in je 1 ml Aceton, zu andern fünf Kolben je 40 mg 17-Methyltestosteron in je 2 ml Aceton gelöst zugesetzt. Die Kolben wurden dann in einem bei 280 C gehaltenen Schüttelzimmer an einem flachen Schütteltisch, der an einer Kreisbahn von 2 cm Ausschlag mit 200 Umdr/min bewegt wurde, inkubiert und der Methyltestosteron- bzw Al-Dehydro- - methyltestosteron-Gehalt der Kolben wurde auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise in den nachstehend angegebenen Zeitpunkten bestimmt.
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<tb>
<tb>
Nach <SEP> 0 <SEP> 4 <SEP> 8 <SEP> 12 <SEP> 16 <SEP> Stunden
<tb> Einwaage <SEP> 20 <SEP> mg
<tb> Methyltestosteron
<tb> mg/100 <SEP> ml <SEP> 20 <SEP> 0,4 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> A-Dehydromethyltestosteron
<tb> mg/lOOmI <SEP> 1,4 <SEP> 21,1 <SEP> 21,7 <SEP> 21,2 <SEP> 20
<tb> Einwaage <SEP> 40 <SEP> mg
<tb> Methyltestosteron
<tb> mg/100 <SEP> ml <SEP> 38,8 <SEP> 23,8 <SEP> 13,7 <SEP> 9,0 <SEP> 6,0
<tb> A'-Dehydromethyltestosteron
<tb> mg/100 <SEP> ml <SEP> 4,4 <SEP> 24, <SEP> 5 <SEP> 29,2 <SEP> 38,2 <SEP> 42,2
<tb>
Beispiel 3: Es wurde in der im Beispiel 2 beschriebenen Weise vorgegangen, aber als Steroid wurde A-Androstendion, Progesteron bzw. Desoxycorticosteron der Kultur zugesetzt ; es wurde mit guter Ausbeute A'-Androstadiendion, Al-Dehydroprogesteron bzw. #1-Dehydro-desoxycorticosteron erhal- ten.
Beispiel 4 : Der Organismus wurde in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise gezüchtet, aber anstatt des Nährbodens SA 5-G wurde der Nährboden PA angewendet. Nach 16 h Inkubation wurden je 100 ml der Kultur unter sterilen Bedingungen in Erlenmeyer-Kolben von 500 ml verteilt. Zu fünf Kolben wurden je 20 mg Reichstein'sche Verbindung S zugesetzt und nach 12,24, 36 und 48 h wurde der Gehalt an A-Reichstein S durch papierchromatographische Analyse bestimmt.
Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten :
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<tb>
<tb> nach <SEP> 12 <SEP> h <SEP> 3,2 <SEP> mg <SEP> pro <SEP> 100 <SEP> ml <SEP> Kultur
<tb> nach <SEP> 24 <SEP> h <SEP> 12,2 <SEP> mg <SEP> pro <SEP> 100 <SEP> ml <SEP> Kultur
<tb> nach <SEP> 36 <SEP> h <SEP> 22,2 <SEP> mg <SEP> pro <SEP> 100 <SEP> ml <SEP> Kultur
<tb> nach <SEP> 48 <SEP> h <SEP> 21,7 <SEP> mg <SEP> pro <SEP> 100 <SEP> ml <SEP> Kultur.
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Zu weiteren Kolben wurde anstatt der Reichstein'schen Verbindung S deren Acetat zugesetzt ; der Gehalt der Kulturen an Al, 4-Derivat gestaltete sich folgendermassen :
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<tb>
<tb> nach <SEP> 24 <SEP> h <SEP> 10,8 <SEP> mg <SEP> pro <SEP> 100 <SEP> ml <SEP> Kultur
<tb> nach <SEP> 36 <SEP> h <SEP> 14,6 <SEP> mg <SEP> pro <SEP> 100 <SEP> ml <SEP> Kultur
<tb> nach <SEP> 48 <SEP> h <SEP> 18,2 <SEP> mg <SEP> pro <SEP> 100 <SEP> ml <SEP> Kultur.
<tb>
Nach 36 und 48 h war kein Reichstein S-Acetat mehr in der Kultur nachweisbar.
Beispiel 5 : Der Organismus wurde in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise gezüchtet, aber anstatt des Nährbodens SA 5-G wurden 5 l Nährboden PA angewendet. Nach 16 h Inkubation wurde 1 g Reichstein'sche Verbindung S in 100 ml Methanol gelöst der Kultur zugesetzt. Die Menge des entstandenen ssl, 4 -Derivates der Reichstein'schen Verbindung S wurde nach der Thiosemicarbazon-Methode ermittelt.
Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten :
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<tb>
<tb> nach <SEP> 0 <SEP> h <SEP> 85 <SEP> mg <SEP> A4 <SEP> -Reichstein <SEP> S <SEP> pro <SEP> 5 <SEP> l <SEP> Fermentationsprodukt
<tb> nach <SEP> 3 <SEP> h <SEP> 380 <SEP> mg <SEP>
<tb> nach <SEP> 6 <SEP> h <SEP> 465 <SEP> mg
<tb> nach <SEP> 9 <SEP> h <SEP> 735 <SEP> mg <SEP>
<tb>
Die Umsetzung wurde nach 9 h beendet und das Fermentationsprodukt wurde zuerst mit 11, dann zweimal mit je 800 ml Dichloräthan extrahiert. Der Extrakt wurde unter vermindertem Druck verdampft ; es wurden 4,22 g Verdampfungsrückstand erhalten. Nach Extrahieren des Verdampfungsrückstandes mit
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authentischen A-Dehydro-Derivat der Reichstein'schen Verbindung S ; fremde Steroide waren im Produkt nicht nachweisbar.
Beispiel 6 : Der Organismus wurde in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise gezüchtet, aber anstatt des Nährbodens SA 5-G wurden 5 l Nährboden PA angewendet. Nach 16 h Inkubation wurde 1 g 17-Methyltestosteron in 100 ml Methanol gelöst der Kultur zugesetzt. Die Menge des während der Fermentation gebildeten A-Dehydro-methyltestosterons wurde nach der Thiosemicarbazon-Methode ermittelt.
Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten :
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<tb>
<tb> nach <SEP> Oh <SEP> 65 <SEP> mg <SEP> A-Methyltestosteron <SEP> pro <SEP> 5 <SEP> 1
<tb> nach <SEP> 6 <SEP> h <SEP> 445 <SEP> mg <SEP>
<tb> nach <SEP> 12 <SEP> h <SEP> 540 <SEP> mg
<tb> nach <SEP> 18 <SEP> h <SEP> 720 <SEP> mg
<tb> nach <SEP> 24 <SEP> h <SEP> 830 <SEP> mg
<tb> nach <SEP> 28 <SEP> h <SEP> 650 <SEP> mg
<tb>
Nach 28 h wurde das Fermentationsprodukt zweimal mit je 1/6 Volumen Kohlenstofftetrachlorid extrahiert. Der vereinigte Extrakt wurde unter vermindertem Druck verdampft. Das Gewicht des Verdampfungsrückstandes war 2, 7 g ; nach Zugabe von Äther konnte das Produkt aus diesem Rückstand in kristalliner Form erhalten werden. Das erhaltene rohe kristalline Produkt wurde abfiltriert und aus Kohlenstofftetrachlorid umkristallisiert.
Es wurden 430 mg A-Methyltestosteron erhalten : F. 161-164 C,
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PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von A-Steroiden durch mikrobiologische Umsetzung von 4-3-Ke- to-Steroidverbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass man die Al-Dehydrierung mit dem beim Ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen unter Nr. 21/1963 deponierten Alcaligenes faecalis K9-2 Stamm durchführt und das entstandene A 1, 4-asteroid nach an sich bekannten Methoden isoliert.