DE1267217B - Verfahren zur Herstellung von delta 1,4-3-Ketosteroiden - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

C07c

Deutsche KL: 12 ο-25/02

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

P 12 67 217.2-42 23. September 1963 2. Mai 1968

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Δ ^li4-3-Ketosterioden durch mikrobiologische Umsetzung der entsprechenden, in 1(2)-Stellung gesättigten Δ ⁴-3-Ketosteroide mit Alkaligenes sp., welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Umsetzung des Δ ⁴-3-Ketosteroids mit dem Stamm Nr. 21/1963, hinterlegt beim ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen, (»K 9-2«) der Spezies Alcaligenes faecalis durchführt und das gebildete Δ ^1>4-3-Ketosteroid nach bekannten Methoden isoliert.

Die mikrobiologische Umsetzung wird zweckmäßig auf einem Pepton, Fleischextrakt und Bierhefeextrakt oder Pepton und Asparagin enthaltenden Nährboden bei etwa 28 ⁰C durchgeführt. Als umzusetzendes Substrat können verschiedene Δ ⁴-3-Ketosteroide, z. B. 17-Methyltestosteron oder Reichsteins Verbindung S, verwendet werden.

Es ist bekannt, daß durch Ausbildung einer 1(2)-ständigen Doppelbindung im Molekül verschiedener Steroide, z. B. der Corticosteroide oder des 17-Methyltestosterons, eine wesentliche Erhöhung der therapeutischen Wirkung dieser Steroide erzielt werden kann. Eine andere wichtige Rolle kommt der 1-Dehydrierung insofern zu, als die aus Δ ⁴-3-Ketosteroiden durch 1-Dehydrierung herstellbaren Δ ^1>4-3-Ketosteroide nach Inhoffen aromatisierbar sind, wie z. B. das Δ ^li4-Androstadien-dion in östron übergeführt werden kann. Ferner können die Δ ^1>4-3-Ketosteroide mit p-Toluolsulfonsäure in Gegenwart von Essigsäureanhydrid in Verbindungen übergeführt werden, die in der 1-Stellung des aromatisierten Ringes A durch eine Methylgruppe substituiert sind.

Nach der bisher bekannten Literatur kann eine Doppelbindung in 1(2)-Stellung des Sterangerüsts durch die folgenden Mikroorganismen ausgebildet werden:

Corynebacterium simplex

USA.-Patentschrift 2 837 464
Septomyxa affinis

USA.-Patentschrift 2 902 410
Calonectria decora
Alternaria passiflorae

schweizerische Patentschrift 338 447
Ophiobolus heterostrophus Ophiobolus Miyabeanus
Bacillus subtilis

schweizerische Patentschrift 346 542
Dydimella sp.

HeIv. Chim. Acta, 38 (1955), S. 1502

Cylindrocarpon radicicola

USA.-Patentschrift 2 868 694 Verfahren zur Herstellung von Δ ^-S-Ketosteroiden

Anmelder:

Richter Gedeon Vegyeszeti Gyär RT., Budapest

Vertreter:

Dr.-Ing. J. Schmidt

und Dr. rer. nat. B. Reitzner, Patentanwälte, 8000 München 2, Hermann-Sack-Str.

Als Erfinder benannt: Dr. med. György Wix, Dipl.-Ing. Gabor Ambrus, Karoly Albrecht, Budapest

Beanspruchte Priorität:

Ungarn vom 5. März 1963 (GO-886)

Fusarium javanicum Bacillus sphaericus

USA.-Patentschrift 2 816 121 Micromonospora chalcea

USA.-Patentschrift 2 809 919 Streptomyces lavendulae

USA.-Patentschrift 2 793 164 Protaminobacter sp.

USA.-Patentschrift 2 776 927 Nocardia sp.

britische Patentschrift 789 363 Bacterium cyclooxydans

USA.-Patentschrift 2 822 318 Colletotrichum atramentarium

britische Patentschrift 805 563 Azotomonas sp.

USA.-Patentschrift 2 992 973 Azotobacter sp.
Mycobacterium sp.

USA.-Patentschrift 2 905 592 Pseudomonas sp.

USA.-Patentschrift 3 037 915

809 574/422

3 4

Serratia sp. zeigen graubeige Farbe, das Zentrum ist kompakter,

USA.-Patentschrift 3 037 915 in Durchsicht ist das dunklere Zentrum von einem

Bact. havaniensis lichteren Hof umgeben. Auf gelatinehaltigem Nähr-

USA.-Patentschrift 3 037 914 boden bilden die Organismen hellbeige, konkave,

Bact. mycoides 5 glänzende, durchscheinende, runde Kolonien.

USA.-Patentschrift 3 037 913 Auf Grund der untersuchten Eigenschaften ent-

Streptomyces sp. spricht dieser Organismus in seinen Hauptzügen den

USA.-Patentschrift 3 039 937 in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology,

6. Ausgabe, S. 412, beschriebenen Eigenschaften der

Aus der Literatur (J. Org. Chem., 22 [1957], S. 578) io Species Alcaligenes faecalis. Es bestehen aber die ist es weiterhin bekannt, daß ein nicht näher identifi- folgenden Abweichungen: nach den zur Identifizierter Alkaligenesstamm die Reichsteinsche Sub- zierung erforderlichen Daten ist die für das Wachstum

stanz S dehydrieren kann. Durch diesen Organismus des A. faecalis optimale Temperatur 37°C, die Zellen wird aber gleichzeitig mit der Einführung der Doppel- haben peritrische Flagellen, und die Kultur hat

bindung auch die 20-Ketogruppe reduziert. Die Aus- 15 keinen charakteristischen Geruch. Der Stamm K 9-2

beute beträgt nur 26%. wächst dagegen bei 24 und 28⁰C besser als bei 37°C,

Es wurde gefunden, daß ein neuer, aus einem Boden- hat bipolare lophotrische Flagellen, und die Kultur

muster isolierter und als »K 9-2« bezeichneter Mikro- hat Frischgeruch. Nach V. B. D. S k e r m a η,

Organismus, welcher am 1. 3.1963 beim Ungarischen »Guide to the Identification of the Genera of Bac-

Landesinstitut für Gesundheitswesen unter Nr. 21/1963 20 teria« (Williams & Wilkins Co., Baltimore 2, Mary-

deponiert wurde, sehr vorteilhaft zur Ausbildung land, 1959), sind die beiden ersten Abweichungen

der l(2)-ständigen Doppelbindung in A^-Keto- zulässig, der Geruch wird hier nicht erwähnt. Aus

steroiden, die in 1(2)-Stellung gesättigt sind, ange- diesem Grund ist der Stamm K 9-2 als ein neuer

wendet werden kann. Dieser neue Mikroorganismus Stamm der Species Alcaligenes faecalis identifizierbar.

K 9-2 zeichnet sich gegenüber den bekannten, zu 25 Dieser Organismus kann auf den verschiedensten,

diesem Zweck anwendbaren Mikroorganismen durch organische Stoffe enthaltenden Nährböden gezüchtet

die Eigenschaft aus, daß er das 17-Methyltestosteron werden. Er wurde vorteilhaft auf den mit SA 5-G

und das 17 a,21-Dihydroxyprogesteron (Reichsteinsche bzw. PA bezeichneten Nährböden gezüchtet, die die

Verbindung S) mit besonders gutem Wirkungsgrad folgende Zusammensetzung hatten:

in die entsprechenden 1-Dehydroderivate überführt. 30

Der Mikroorganismus K9-2 bildet 2 bis 2,5 Mikron Nährboden SA 5-G

lange, etwa 0,8 Mikron breite, an den Enden abge- Pepton 250 g

rundete Stäbchen, die oft in Paaren beobachtbar Fleischextrakt 50 g

sind. Sie sind sich lebhaft bewegende, in den Elek- Bierhefeextrakt 9 ml

tronenmikroskopaufnahmen bipolar erscheinende Or- 35 Leitungswasser zu 51

ganismen mit lophotrichen Flagellen, welche länger PH 6,5 bis 7

als die Bakterienkörper und schwach gewellt sind. . Nährboden PA

Unter dem Phasenkontrastmikroskop sind in den Pepton 75 g

Zellen bipolare, mehr oder minder ausgeprägte Licht- Asparagin 25 g

brechung zeigende Körnchen beobachtbar. Die Zellen 40 Leitungswasser zu 51

färben sich gramnegativ. Sie zeigen auf KartofFel-Agar pH 7

und auf Pepton-Agar bei pH = 7,2 gleichmäßig

gutes, auf Asparagin-Agar und Sabouraud-Agar Die Erhaltung des Stammes erfolgte auf einem

weniger gutes bzw. schlechtes Wachstum. Auf Sorbit- Kartoffel-Agar-Nährboden mit wöchentlichen Um-

Agar ist kein Wachstum beobachtbar. Auf Kartoffel- 45 impfungen.

schnitten entwickeln sie sich innerhalb von 5 Tagen. Das umzusetzende Steroid wurde, in organischen Auf gelatinehaltigem Nährboden entwickeln sie Lösungsmitteln, z. B. in Aceton oder Alkohol, gelöst, sich gut und rufen keine Verflüssigung hervor. Das zur Kultur des Organismus zugesetzt. Die Umsetzung Peptonwasser wird von den Organismen leicht getrübt, der Steroide wurde durch qualitative und quantitative es wird ein reichliches Sediment, aber an der Oberfläche 50 Chromatographie verfolgt. Im letzteren Fall wurde keine Haut gebildet. Auch auf 6 % Alkohol enthalten- derart vorgegangen, daß das Fermentationsmedium der Bouillon können sich die Organismen entwickeln. mit einem organischen Lösungsmittel von entsprechen-Der Alkohol wird dabei nicht zu Essigsäure oxydiert. der Polarität, z. B. mit Dichloräthan, extrahiert Bei 24 und 28 ⁰C zeigen die Organismen gleich gutes, wurde. Der Extrakt wurde eingedampft, der Einbei 37° C aber nur schwaches Wachstum. Sie bilden 55 dampfungsrückstand z. B. in einem Gemisch von kein Indol, reduzieren das Nitrat nicht, die Lackmus- Aceton und Chloroform gelöst, und zwar derart, daß milch wird von ihnen schwach alkalisch gemacht, der Steroidgehalt des erhaltenen Konzentrats etwa aber nicht koaguliert. Sie beanspruchen zu ihrem 4 mg/ml beträgt. Aus dieser Lösung wurden 50 bis Wachstum keine Glukose; sie können sich auf Saccha- 100 μΐ auf ein vorher in Form eines überfließenden rose, Mannit, Glukose oder Maltose enthaltenden 60 Chromatogramms mit Äthanol gewaschenes Macherey-Nährböden gut entwickeln, in Gegenwart von Lactose Nagel-Papier Nr. 214 getropft, wobei das Impräist aber ihr Wachstum langsamer. In 8 Wochen wird gnieren des Papiers vor dem Auftropfen unter Berückaus diesen Zuckern keine Säure produziert. Die sichtigung der Polarität des zu untersuchenden Organismen bilden auf Kartoffel-Agarplatten glän- Steroidgemisches erfolgte. War der Ausgangsstoff zende, meistens radial geriffelte Kolonien, die am 65 z. B. Δ ⁴-Androstendion oder 17-Methyltestosteron, Rand gekerbt sind. Die Ränder der Kolonien sind dann wurde das Papier mit 30% Propylenglykol entdurchscheinend, die Mitte hebt sich hervor, in Seiten- haltendem Methanol imprägniert, wobei als mobile ansieht sind die Kolonien etwas kegelförmig. Sie Phase ein mit Propylenglykol gesättigtes Gemisch

von Kohlenstofftetrachlorid und Methylcyclohexan (1: 1) angewendet wurde. In diesem System zeigte das Δ ⁴-Androstendion einen Ri-Wert von 0,68, das /J^1>4-Androstadiendion von 0,41, das 17-Methyltestosteron von 0,20 und das l-Dehydro-17-methyltestosteron von etwa 0,10. Der den Steroiden entsprechende Fleck wurde am Papierchromatogramm durch ultraviolette Kontaktphotographie nachgewiesen, der den Fleck enthaltende Papierteil wurde ausgeschnitten, mit 10 ml absolutem Äthanol p. a. eluiert, die Extinktion des Eluats bei 242 ηιμ gemessen und der dem Meßwert nach Abzug des entsprechenden Blindwertes (d. h. des mit einem aus einem steroidfreien Papierausschnitt hergestellten Eluat erhaltenen Meßwertes) entsprechende Steroidgehalt der Lösung von der Standardkurve abgelesen. — Wenn aber z. B. die Reichsteinsche Verbindung S der Ausgangsstoff war, dann wurde das Papier mit 30% Äthylenglykol enthaltendem Methanol imprägniert, wobei ein mit Äthylenglykol gesättigtes Gemisch von Tetrachlorkohlenstoff und Dichloräthan (1:1) als mobile Phase angewendet wurde; im weiteren war die Verfahrensweise gleich der oben beschriebenen. In diesem System zeigte die Reichsteinsche Verbindung S einen Ri-Wert von etwa 0,9, das 1-Dehydroderivat der Reichsteinsehen Verbindung S von etwa 0,72. Wenn das produzierte 1-Dehydrosteroid aus dem Fermentationsprodukt isoliert werden soll, wird die Menge des gebildeten Steroids nach der in der ungarischen Patentschrift 150 244 (veröffentlicht am 1. 10. 1962) beschriebenen Thiosemicarbazonmethode bestimmt. Diese Methode ist zur Bestimmung von Zl⁴-3-Ketosteroiden und Δ ^1>4-3-Ketosteroiden nebeneinander geeignet. Die Steroide werden aus der Fermentationsflüssigkeit mit organischen Lösungsmitteln extrahiert; ein bestimmter Teil des Extrakts wird verdampft. Die im Rückstand vorhandenen Steroide werden in alkoholischem Medium mit salzsaurem Thiosemicarbazid umgesetzt. Die entstandenen Δ ⁴-3-Thiosemicarbazon- bzw. z!^1>4-3-Thiosemicarbazon-Verbindungen können durch Ultraviolettspektrophotometrie auf Grund ihrer verschiedenen Spektren nebeneinander quantitativ bestimmt werden.

Die folgenden Beispiele erläutern das Verfahren der Erfindung.

Beispiel 1

Eine in einer Kartoffel-Agar enthaltenden Roux-Flasche gezüchtete, 2 Tage alte Kultur des Stammes K 9-2 wurde mit 100 ml sterilem Wasser abgewaschen. Mit 50 ml der so erhaltenen Suspension wurden 5 1 SA5-G-Nährboden in einem 10-1-Glasfermenter unter sterilen Bedingungen beimpft. Der Fermenter wurde in ein Wasserbad von 28° C gestellt, mit 300 Umdrehungen pro Minute gerührt und die Kultur mit 5 1 Luft pro Minute belüftet. Nach 16 Stunden Inkubation wurde 1 g 17-Methyltestosteron, in 50 ml Aceton gelöst, der Kultur zugesetzt. In Zeitintervallen von 6 Stunden wurden aus dem Fermenter Proben von je 100 ml entnommen. Diese wurden dreimal mit je ¹J₃ Volumen Dichloräthan extrahiert, die Extrakte wurden getrocknet, eingedampft, und der Eindampfrückstand wurde zur quantitativen papierchromatographischen Analyse aufgetropft. Der 1-Dehydro-17-methyltestosteron-Gehalt im Fermenter hat sich nach diesen Messungen folgendermaßen gestaltet:

nach 6 Stunden 425 mg

nach 12 Stunden 640 mg

nach 18 Stunden 1000 mg

Das 17-Methyltestosteron wurde also durch den Mikroorganismus quantitativ in das 1-Dehydroderivat übergeführt.

Beispiel 2

Der Mikroorganismus wurde in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise gezüchtet. Nach 16 Stunden Inkubation wurde die Kultur in sterile 500-ml-Erlenmeyer-Kolben in Portionen von je 100 ml verteilt. Zu fünf Kolben wurden je 20 mg 17-Methyltestosteron in je 1 ml Aceton, zu anderen fünf Kolben je 40 mg 17-Methyltestosteron in je 2 ml Aceton gelöst zugesetzt. Die Kolben wurden dann in einem bei 28⁰C gehaltenen Schüttelraum an einem flachen Schütteltisch, der in einer Kreisbahn von 2 cm Ausschlag mit 200 Umdrehungen pro Minute bewegt wurde, inkubiert; der Methyltestosteron- bzw. 1-Dehydromethyltestosterongehalt der Kolben wurde auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise zu den nachstehend angegebenen Zeitpunkten bestimmt.

Nach

tunden	4 Stunden	8 Stunden	12 Stunden	16 Stunc
20	0,4	0	0	0
1,4	21,1	21,7	21,2	20
38,8	23,8	13,7	9,0	6,0
4,4	24,5	29,2	38,2	42,2
		B eisp i	el 4

Einwaage 20 mg

17-Methyltestosteron, mg/100 ml

l-Dehydro-17-methyltestosteron, mg/100 ml

Einwaage 40 mg

17-Methyltestosteron, mg/100 ml

l-Dehydro-17-methyltestosteron, mg/100 ml

Beispiel 3

Es wurde in der im Beispiel 2 beschriebenen Weise vorgegangen, aber als Steroid wurde Δ ⁴-Androstendion, Progesteron bzw. Desoxycorticosteron der Kultur zugesetzt; es wurde mit guter Ausbeutet ^1>4-Androstadiendion, 1-Dehydroprogesteron bzw. 1-Dehydrodesoxycorticosteron erhalten.

Der Mikroorganismus wurde in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise gezüchtet, aber anstatt des Nährbodens SA 5-G wurde der Nährboden PA angewendet. Nach 16 Stunden Inkubation wurden je 100 ml der Kultur unter sterilen Bedingungen in Erlenmeyer-Kolben von 500 ml verteilt. Zu fünf Kolben wurden

je 20 mg Reichsteinsche Verbindung S zugesetzt, und nach 12, 24, 36 und 48 Stunden wurde der Gehalt an 1-Dehydro-Reichstein S durch papierchromatographische Analyse bestimmt. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

nach 12 Stunden,
nach 24 Stunden,
nach 36 Stunden,
nach 48 Stunden.

3,2 mg pro 100 ml Kultur
12,2 mg pro 100 ml Kultur
22,2 mg pro 100 ml Kultur
21,7 mg pro 100 ml Kultur

Zu weiteren Kolben wurde anstatt der Reichsteinschen Verbindung S deren Acetat zugesetzt; der Gehalt der Kulturen an 1-Dehydroderivat gestaltete sich folgendermaßen:

nach 24 Stunden 10,8 mg pro 100 ml Kultur

nach 36 Stunden 14,6 mg pro 100 ml Kultur

nach 48 Stunden 18,2 mg pro 100 ml Kultur

Nach 36 und 48 Stunden war in der Kultur kein Reichstein S-Acetat mehr nachweisbar. ao

Beispiel 6

Der Mikroorganismus wurde in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise gezüchtet, aber statt des Nährbodens SA 5-G wurden 51 Nährboden PA angewendet. Nach 16 Stunden Inkubation wurde 1 g 17-Methyltestosteron, in 100 ml Methanol gelöst, der Kultur zugesetzt. Die Menge des während der Fermentation gebildeten l-Dehydro-17-methyltestosterons wurde nach der Thiosemicarbazonmethode ermittelt. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

nach 0 Stunden 65 mg
nach 6 Stunden 445 mg
nach 12 Stunden 540 mg
nach 18 Stunden 720 mg
nach 24 Stunden 830 mg
nach 28 Stunden 650 mg

Beispiel 5

Der Mikroorganismus wurde in der im Beispiel 1 as beschriebenen Weise gezüchtet, aber statt des Nährbodens SA 5-G wurden 5 1 Nährboden PA angewendet. Nach 16 Stunden Inkubation wurde 1 g Reichsteinsche Verbindung S in 100 ml Methanol gelöst der Kultur zugesetzt. Die Menge des entstandenen 1-Dehydroderivats der Reichsteinschen Verbindung S wurde nach der Thiosemicarbazonmethode ermittelt. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

1-Dehydrotestosteron
1-Dehydrotestosteron
1-Dehydrotestosteron
1-Dehydrotestosteron
1-Dehydrotestosteron
1-Dehydrotestosteron

17-methylpro 51
17-methylpro 51
17-methylpro 51
17-methylpro 5 1
17-methylpro 51
17-methylpro 51

35

40

45

nach 0 Stunden 85 mg 1-Dehydro Reichstein S
pro 51 Fermentationsprodukt

nach 3 Stunden 380 mg 1-Dehydro Reichstein S
pro 51 Fermentationsprodukt

nach 6 Stunden 465 mg 1-Dehydro Reichstein S
pro 51 Fermentationsprodukt

nach 9 Stunden 735 mg 1-Dehydro Reichstein S
pro 51 Fermentationsprodukt

Die Umsetzung wurde nach 9 Stunden beendet, und das Fermentationsprodukt wurde zuerst mit 11, dann zweimal mit je 800 ml Dichloräthan extrahiert. Der Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingedampft; es wurden 4,22 g Eindampfrückstand erhalten. Nach Extrahieren des Eindampfrückstandes mit Hexan wurden 850 mg eines im Hexan unlösbaren, kristallinen Produkts erhalten. Das Umkristallisieren dieses Produkts aus Aceton ergab 490 mg 1-Dehydroderivat der Reichsteinschen Verbindung S F. 234 bis 242°C, [a]|? = +74° (c = 1 in Aceton). Das Produkt erwies sich papierchromatographisch als identisch mit dem authentischen 1-Dehydroderivat der Reichsteinschen Verbindung S; fremde Steroide waren im Produkt nicht nachweisbar.

Nach 28 Stunden wurde das Fermentationsprodukt zweimal mit je V₆ Volumen Kohlenstofftetrachlorid extrahiert. Der vereinigte Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingedampft. Das Gewicht des Eindampfrückstandes war 2,7 g; nach Zugabe von Äther konnte das Produkt aus diesem Rückstand in kristalliner Form erhalten werden. Das erhaltene rohe kristalline Produkt wurde abfiltriert und aus Kohlenstofftetrachlorid umkristallisiert. Es wurden 430 mg l-Dehydro-17-methyltestosteron erhalten; F. 161 bis 164° C, [«]!? = 0° (c = 2 in Chloroform).

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Δ ^li4-3-Ketosteroiden durch mikrobiologische Umsetzung der entsprechenden, in 1(2)-Stellung gesättigten Zl⁴-3-Ketosteroide mit Alkaligenes sp., dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung des Δ ⁴-3-Ketosteroids mit dem Stamm Nr. 21/1963, hinterlegt beim ungarischen Landesinstitut für Gesundheitswesen, (»K9-2«) der Spezies Alkaligenes faecalis durchführt und das gebildete Δ ¹'⁴-3-Ketosteroid nach bekannten Methoden isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mikrobiologische Umsetzung an einem Pepton, Fleischextrakt und Bierhefeextrakt oder Pepton und Asparagin enthaltenden Nährboden durchgeführt wird.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung bei einer Temperatur um 28° C durchgeführt wird.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man 17-Methyltestosteron oder Reichsteins Verbindung S als umzusetzende Ausgangsstoffe verwendet.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Deutsche Auslegeschrift Nr. 1 060 391;
HeIv. Chim. Acta, Bd. 38 (1955), S. 835 bis 840.

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