DE1128854B

DE1128854B - Verfahren zur Herstellung von 11-hydroxylierten Steroiden der Pregnanreihe

Info

Publication number: DE1128854B
Application number: DESCH26968A
Authority: DE
Inventors: Fernando Carvajal; Jan Ilavsky; Hershel L Herzog
Original assignee: Scherico Ltd
Current assignee: Scherico Ltd
Priority date: 1958-11-13
Filing date: 1959-11-12
Publication date: 1962-05-03

Description

Verfahren zur Herstellung von 11-hydroxylierten Steroiden der Pregnanreihe Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von 11-hydroxylierten Steroiden der Pregnanreihe durch Bebrütung eines entsprechenden 11-Desoxysteroids mit den oxydierend wirkenden Enzymen von Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen und Abtrennung der Gärungsprodukte nach bekannten Verfahren, insbesondere durch Extraktion.
Es ist bekannt, Steroide auf mikrobiologischem Wege in 11 -Stellung direkt zu hydroxylieren und so die Vielzahl von Verfahrensstufen zu vermeiden, die mit den andernfalls erforderlichen höchst verwickelten organischen Synthesen verbunden sind. Die mikrobiologische Oxydation erfolgt, indem ein Steroid mit einer 11 -ständigen Methylengruppe der Wirkung Sauerstoff einführender Enzyme, wie sie durch verschiedene Mikroorganismen erzeugt werden, unterworfen sind.
Die bekannten Verfahren dieser Art haben jedoch eine Reihe von Nachteilen. So erhält man oft eine ganze Anzahl von Oxydationsprodukten, deren Trennung schwierig ist und auf jedem Fall einen zusätzlichen Verfahrensschritt erfordert. Ferner ist die Ausbeute, beispielsweise bei der Herstellung von 11-Epihydrocortison aus Verbindung S, oft recht klein. Eine typische Schwierigkeit besteht oft auch darin, daß - selbst bei Inkaufnahme geringer Ausbeuten an hydroxyliertem Produkt - derart niedrige Substratkonzentrationen und derart lange Reaktionszeiten erforderlich sind, daß diese Verfahren für die Praxis untragbar werden. Auch sind gewisse der bekannten hydroxylierenden Mikroorganismen so schwierig zu entwickeln und zu erhalten, daß dadurch die Wirtschaftlichkeit ihrer Anwendung ernsthaft eingeschränkt wird.
Erfindungsgemäß verwendet man nun als Mikroorganismus eine Species des Fungus einer der Gattungen Beauvaria, Phoma und Glomerella. Dies bringt den Vorteil, daß man bedeutend größere Konzentrationen eines 11-Desoxysteroidsubstrats mittels eines leistungsfähigen und schnellen Verfahrens zu einem wesentlichen Anteil und oftmals vollständig in die entsprechenden 11-hydroxylierten Derivate überführen kann.
Von besonderer wirtschaftlicher Bedeutung ist dabei auch, daß die genannten Mikroorganismen leicht zu züchten und zu erhalten sind.
Die Gattung Beauvaria gehört zu der Klasse Fungi imperfecti, Ordnung Moniliales, Familie Monilaceae. Die Isolate des Stammes ATCC 13144 sind besonders gut geeignet. Die Gattung Phoma gehört zu der Klasse imperfecti, Ordnung Sphaeropsidales, Familie Sphaerioidaceae. Zu dieser Gattung gehören Isolate der Kultursammlung sp. Sch M-774, sp. Sch M-775, sp. Sch M-778, sp. Sch M-912, sp. Sch M-934, sp. Sch M-984, sp. Sch M-985 und vorzugsweise die Isolate von ATCC 13145 oder oxydierende Enzyme davon. Die Gattung Glomerella gehört zur Klasse Ascomycetes, Ordnung Sphaeriales, Familie Sphaeriaceae, und umfaßt beispielsweise die Species G. fusaroides (ATCC 9552), G. legenarium, G. major, G. phacidiomorpha, G. rubicola sowie G. cingulata oder oxydierende Enzyme davon.
Diese Fungi zeichnen sich durch die besondere Spezifität aus, mit der sie Steroide mit 11-ständiger Methylengruppe bei Ausbeuten von über 5001, und üblicherweise im Bereich von 800/, im wesentlichen oder vollständig in die entsprechenden 11-hydroxylierten Verbindungen umwandeln. Während Isolate der Gattungen Beauvaria und Glomerellä im wesentlichen lla-hydroxylierte Verbindungen liefern, können mit den Organismen der Gattung Phoma 20 bis 300/, des llß-Epimeren erhalten werden. Beispiele für Stämme der Species Glomerella cingulata sind die folgenden: ATCC 10529, ATCC 10530, ATCC 10531, ATCC 10532, ATCC 10533, ATCC 10534 und QM 1407. Die genannten Mikroorganismen und ihre Mutanten sind haltbar und leicht zu züchten und können, wie gesagt, aus bekannten Quellen erhalten werden, beispielsweise von - der amerikanischen Typenkultursammlung (ATCC), Washington, D. C.; der Quarter Master Culture Cöllection, Matick, Massachussetts (QM); oder dem Central Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, .Holland. Sie können aber auch aus natürlichen Quellen unter ` Anwendung bekannter mikrobiologischer Verfahren erhalten werden.
Beispiele für die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren 11-Desoxysteroide sind: 4-Pregnen-17a,21-diol-3;20-dion (11-Desoxy-17x-hydroxycortison, Reichstein's Substanz S), 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3;20-dion (1-Dehydro-11-desoxy-17a-hydroxycortison), 16oc-Methyl-allopregnan-17a,21-diol-3,20 - dion, 16ß - Methyl - allopregnan - 17x, 21- diol-3,20-dion, 16a-tert.Butyl-allopregnan-17x,21-diol-3,20-dion, 16ß-Äthyl-allopregnan-17a,21-diol-3,20-dion, 16ß-Methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion, 16a- Methyl-1,4- pregnadien-17ec,21- diol- 3,20 - dion, 16ß-Methyl-1,4-pregnadien-17a,21- diol- 3,20- dion, 16a-tert.Butyl-1,4-pregnadien-17x,21-diol-3,20-dion, 16ß- Äthyl-1,4 - pregnadien-17 a, 21- diol- 3,20- dion, Pregnan - 17 a, 21 - diol - 3,20 - dion, Allopregnan -17a,21-diol-3,20-dion, Pregnan-17a,21-diol-3,20-dion-21 - acetat, 16a - Methyl - 4 - pregnen - 17a,21 - diol -3;20-dion, 1,4,6-Pregnatrien-17a,21-diol-3,20-dion, 16ß-Methyl-5-pregnen-3ß,17oc-diol-20-on, 3ß,21-Diacetoxy-16a-methyl-5-pregnen-17a-ol-21-on und 16ß-Methyl-5-pregnen-3ß,l7a-diol-20-on, ferner andere Alkylderivate, wie 16-Äthyl- und 16-tert.Butylhomologe sowie die 21-Acylderivate (z. B. Acetat, Propionat) und insbesondere die Acylderivate der niederen Alkansäuren.
Als Ausgangsstoffe werden solche Steroide bevorzugt, bei denen der A-Ring eine 3-Ketokonfiguration und der D-Ring beim Kohlenstoffatom 17 eine Seitenkette mit 2 Kohlenstoffätomen enthält. Auch ist es erwünscht, daß wenigstens eine Doppelbindung vorhanden ist (z. B. 44(b) im A-Ring). Besonders bevorzugt sind jedoch 11-Desoxypregnane (einschließlich der entsprechenden Allopregnane) und deren ungesättigte Analoge (wobei in die Bezeichnung »Pregnane« und »Allopregnane«, wie sie hier verwendet wird, die substituierten Derivate eingeschlossen sind, wenn nicht ausdrücklich etwas anderes gesagt wird) sowie insbesondere jene Verbindungen, die durch die Strukturformel dargestellt werden, in der R ein Wasserstoffatom oder einen Acylrest, vorzugsweise von einer niederen Alkansäure abgeleitet, R1 ein Wasserstoffatom oder eine niedere a- oder ß-Alkylgruppe und R2 ein Wasserstoffatom bedeutet, wobei, wenn R1 eine Alkylgruppe ist, R2 vorzugsweise ein Allo-Wasserstoffatom bedeutet, und die 41-, 4 4-, d l#4 und d 1-4#s-Analogen davon.
In jedem Fäll ist das Verfahrensprodukt die entsprechende 11-Hydroxyverbindung, die in hoher, manchmal quantitativer Ausbeute erhalten wird, wobei jedoch zu beachten ist, daß bei der erfindungsgemäßen 11-Hydroxylierung beispielsweise am Kohlenstoffatom 21 acylierter Substrate häufig gleichzeitig die Acyloxygruppen zu den entsprechenden Hydroxygruppen hydrolysiert werden.
Bei Verwendung gewisser Steroide als Ausgangsstoffe kann Dihydroxylierung eintreten. So kann beispielsweise 4-Pregnen-3,20-dion mit hoher Ausbeute in die entsprechende 11,15-Dihydroxyverbindung übergeführt werden.
Die erfindungsgemäß erhaltenen 11-hydroxylierten Produkte sind wertvolle Zwischenprodukte bei der Herstellung der entsprechenden llß-Hydroxy- und 11-Keto-1,4-diene und anderer Steroide, die bei der Behandlung von Entzündungskrankheiten, wie Arthritis, wertvolle therapeutisch aktive Verbindungen darstellen.
Das Hydroxylierungsverfahren nach der Erfindung wird bequem durchgeführt; indem der Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen auf einem geeigneten Medium, wie es später beschrieben wird, in innigem Gemisch mit dem 11-Desoxysteroid, wie Substanz S, gezüchtet wird, wobei man den Fungus züchtet oder wachsen läßt, bis die gewünschte enzymatische Hydroxylierung erfolgt ist. Das Verfahren nach der Erfindung kann aber auch mit besonderem Vorteil derart durchgeführt werden, daß man den Mikroorganismus im Fermentationsmedium unter aeroben Bedingungen wachsen läßt, die Zellen des so gezüchteten Mikroorganismus isoliert und sie dann unter aeroben Bedingungen mit dem 11-Desoxysteroid, das hydroxyliert werden soll, versetzt und während einer Zeitspanne vereinigt hält, die für die gewünschte Einführung von Sauerstoff ausreicht. Das letztgenannte Verfahren vereinfacht die Aufarbeitung wesentlich, doch ist die Reihenfolge des Zusatzes ohne grundsätzliche Bedeutung. Es kann also auch das 11-Desoxysteroid zu dem Kulturmedium zugesetzt und dieses dann mit dem Fungus inokuliert werden.
Das eingesetzte 11-Desoxysteroid wird nach bekannten Verfahren, beispielsweise in Form einer wäßrigen Suspension oder in Form einer Lösung oder Suspension in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, das für den Mikroorganismus nicht toxisch ist, wie Methanol, Äthanol, Aceton, Propylenglykol, Dimethylformamid oder Dimethylacetamid, zu dem Nährmedium zugefügt. Es kann aber auch in Form eines festen, feinverteilten Pulvers od. dgl. zugesetzt werden. Die feinverteilte Form ergibt eine größere Oberfläche und infolgedessen optimalen Kontakt mit dem Enzym, das durch den Mikroorganismus erzeugt wird. Das Steroid kann wahlweise auf einmal oder allmählich, kontinuierlich oder portionenweise zugegeben werden.
'Gewöhnlich setzt man Steroidkonzentrationen zwischen 100 mg und 1 g pro Liter Gesamtfermentationsmischung ein, doch kann man unter Umständen auch mit Konzentrationen von bis zu 30 g pro Liter arbeiten.
Geeignete Nährmedien für die Züchtung der Beauvaria, Phoma und Glomerella sind: assimilierbarer Kohlenstoff, organische und anorganische Stickstoffquellen zusammen mit kleineren Mengen anorganischer Salze und Spurenelementen. Die Konzentration dieser Bestandteile kann innerhalb weiter Grenzen schwanken. Typische Kohlenstoffquellen, die in diesen Kulturmedien verwendet werden können, sind Kohlehydrate, wie Dextrose, Glucose, Stärke, invertierte Melassen u. dgl. Übliche organische Stickstoffquellen sind Proteinstoffe, wie Getreideweicheflüssigkeit, abgebautes Milchalbumin, Hefeextrakt oder Sojabohnenmehl, die etwa 10 bis 50 % Protein enthalten. Quellen für anorganischen Stickstoff sind Ammoniumnitrat, zweibasisches Ammoniumphosphat u. dgl. Spurenelemente kommen aus dem Leitungswasser, das dem Kulturmedium zugesetzt wird. Anorganische Salze (z. B. geeignete wasserlösliche Salze von Magnesium, Zink, Kalium, Natrium, Phosphor, Eisen u. dgl.) und andere derartige Stoffe, beispielsweise Nicotinamid, sind normalerweise in den Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und organischen Stickstoff in ausreichenden Mengen vorhanden, um optimales Wachstum des Mikroorganismus in der Kulturbrühe zu gewährleisten, aber sie können dem Wachstumsmedium auch gesondert zugeführt werden, wenn es erwünscht ist.

Im folgenden werden Beispiele für Nährmedien angegeben, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können

Medium Nr. 1

Hefeextrakt (»Difco«) . . . . . . . . . . . . . . . 10/,*

Dextrose (»Cerelose«o . . . . . . . . . . . . . . . 10/,

Leitungswasser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 980/,

px ............................... 6,5

* Gewichtsprozent, wenn nicht ausdrücklich etwas anderes

gesagt ist.

Medium Nr. 2

Asparagin ...................... 10 g

Glucose ........................ 25 g

KH,P04 ....................... 0,5 g

M9S04 - 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . : . 0,25 g

Leitungswasser auf 1 1

Medium Nr. 3

Natriumnitrat .................... 2 g

K,HP04 ........................ 1 g

M9S04 . 7 H20 .. .... ..... ... .... 0,59

Hefeextrakt ...................... 1 g

K Cl............................. 0,5 g

Glucose ......................... 50,0 g

Leitungswasser auf 1 1

Medium Nr. 4

Pepton .......................... 5 mg

Sojabohnenmehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 mg

Hefeextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 mg

Glucose ......................... 20 mg

KH,P04 . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . 5 mg

NaCl ........................... 5 mg

Leitungswasser auf 1 1

pH .............................. 6,3

Das px des Kulturmediums ist nicht entscheidend, obgleich es bekannt ist, daß Fungi besser in einem schwach sauren als in einem alkalischen Milieu gedeihen. So ist ein pg zwischen 4 und 8 durchaus geeignet, ein solches zwischen 5,3 und 7,5 bevorzugt. Der Zusatz geringer Mengen an Antischaummitteln ist insbesondere im technischen Betrieb zwar erwünscht, aber nicht erforderlich. Die Kultur wird zweckmäßig geschüttelt und/oder belüftet und gerührt.

Beispiel einer geeigneten Arbeitsweise Sporen, wie sie aus der Kultursammlung oder dem vegetativen Wachstum eines geeigneten Stammes erhalten werden, werden bei einer bevorzugten Temperatur von 22 bis 28'C, obgleich so niedrige Temperaturen, wie 15°C, oder so hohe, wie 35°C, nicht nachteilig sind, auf einem Agarmedium gezüchtet (z. B. 0,3 % Hefeextrakt, 1,0 % »Cereloseu, 0,1 % Getreideweicheflüssigkeit). Nach etwa 3 bis 10, gewöhnlich etwa 7 Tagen tritt Sporenbildung ein. Das Kulturmedium und die Sporen werden dann verdünnt und mit sterilem Wasser gewaschen; nach mehrmaligem Waschen bleibt eine starke Sporensuspension zurück, die für die Inoculation des flüssigen Fermentationsmediums verwendet wird. DerÜbergangvon dem Sporenzustand in den Zustand des vegetativen Myceliums erfolgt im allgemeinen in 12 bis 48 Stunden, kann aber auch schon nach 3 bis 5 Stunden erfolgen. Am Ende dieser Wachstumsperiode, das durch das Auftreten eines dicken, vegetativen Myceliums angezeigt wird, wird ein Inoculum, das aus etwa 1 % vegetativem Mycelium besteht, in Schüttelkolben mit Fermentationsmedium gegeben, und die Kolben werden geschüttelt, bis ein wesentliches Wachstum beobachtet wird (im allgemeinen nach 12 bis 24 Stunden). Nun wird das zu hydroxylierende Steroid, wie oben beschrieben, zugesetzt. Die Steroidkonzentration beträgt beispielsweise in einem Alkoholmedium etwa 2 bis 3 mg pro Gramm Lösungsmittel. Höhere Steroidkonzentrationen werden erhalten, indem der Alkohol erwärmt oder durch ein anderes Lösungsmittel, beispielsweise Dimethylformamid, ersetzt wird, worin Konzentrationen bis zu 100 mg/g und mehr vollständig gelöst werden. Die Steroidkonzentration in dem Gesamtfermentationsgemisch liegt gewöhnlich zwischen 100 mg und 1 bis 2 g pro Liter, kann aber im Falle von Glomerella bis zu 30 g pro Liter betragen. Das Fermentationsgemisch wird geschüttelt, bis vollständige Umwandlung erfolgt ist (z. B. 6 bis 96 Stunden). Die Umwandlung in das 11-hydroxylierte Derivat wird in der üblichen Weise, z. B. durch Papierchromatographie, bestimmt.
Anstatt eines 1 °/oigen Inoculums des vegetativen Myceliums kann aber auch direkt eine Sporensuspension verwendet werden. Dies wird jedoch weniger bevorzugt, da dabei längere Zeiten für das eigentliche Wachstum des Myceliums und die Umwandlung des 11-Desoxysteroids erforderlich sind.
Am Schluße des Fermentationsprozesses wird das gewünschte 11-hydroxylierte Steroid, etwa wie folgt, isoliert: Das Gemisch wird extrahiert (gewöhnlich drei- oder mehrmal), wobei pro Extraktion beispielsweise zwei Volumteile organisches Lösungsmittel pro Volumteil Fermentationsbrühe verwendet werden. Das Lösungsmittel, z. B. ein Halogenchlorwasserstoff, wie Chloroform oder Methylenchlorid; ein Ester, wie Äthylacetat; ein Alkohol, wie Butanol; ein Äther, wie Diäthyläther oder Dibutyläther; ein aromatisches Lösungsmittel, wie Toluol od. dgl., wird dann gekühlt, über Natriumsulfat od. dgl. getrocknet, filtriert, das Filtrat fast oder ganz zur Trockne eingedampft und der Rückstand zur Bestimmung des Steroidgehalts, wie im folgenden beschrieben; verwendet. Das vorstehend beschriebene Wachstums- und Fermentationsverfahren kann allgemein bei Verfahren in kleinem Maßstab angewendet werden, bei denen Schüttelkolben auf umlaufenden Schüttelapparaten verwendet werden, und kann größeren Ansätzen angepaßt werden, wobei man die Fermentation in Tanks durchführt und mit viel größerer Geschwindigkeit arbeitet.
Das vegetative Mycelium kann dem frischen Nähr-Boden in einer Konzentration von etwa 1 bis 10"/, und mehr zugesetzt werden, und man läßt es vorzugsweise bei etwa 28'C annähernd 24 Stunden wachsen.
Niedrigere Konzentrationen des Myceliums werden wegen der dabei möglichen besseren Belüftung bevorzugt. Im letztgenannten Fall kann man ein submeres Inoculum verwenden, in das man Luft einleitet. Da Wachstumsmischungen dieser Art leicht große Schaummengen bilden, verwendet man hierbei gewöhnlich ein Entschäumungsmittel. Man kann dabei, sobald die Wachstumsperiode im wesentlichen zu Ende ist, das Steroid in Form einer alkoholischen Lösung zufügen, wobei die Konzentration bis zu 30 g Steroid pro Liter Brühe beträgt. Dann läßt man die Fermentation ablaufen, bis die papierchromatographische Analyse zeigt, daß alles Ausgangsmaterial verbraucht ist. Dann wird filtriert und mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel für die Reaktionsprodukte extrahiert. Geeignete Extraktionsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid oder Tetrachloräthan; Ester organischer Säuren, wie tertiäres Butylacetat; aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol oder Toluol; Ketone, wie Diäthylketon; oder cyclische Amine, wie 2-Methyl-5-äthyl-pyridin. Bevorzugt werden Chloroform und Äthylacetat. Der Extrakt wird eingedampft und das gewünschte Produkt durch Umkristallisieren oder chromatographisch isoliert. Beispielsweise wird der Steroidextrakt nach Eindampfen über Aluminiumoxyd, Magnesiumsilikat (bekannt unter dem Handelsnamen Florisil) od. dgl. chromatographiert, wobei das Gewichtsverhältnis von Steroidextrakt zu Magnesiumsilikat gewöhnlich bei etwa 1 : 2 bis 1 : 500 liegt. Das Magnesiumsilikat oder dergleichen Material wird mit Hexan präpariert. Der Steroidextrakt wird in Methylenchlorid gelöst in die Säule gebracht und die Säule nacheinander in einer Vielzahl von Fraktionen von Methylenchlorid, 0,5 °/o Methanol in Methylenchlorid, 10/, Methanol in Methylenchlorid, 1,5 °/o Methanol in Methylenchlorid usw. bis zu etwa 3;0 bis 501, Methanol in Methylenchlorid eluiert. Die Elution wird normalerweise mit jeder Fraktion 10- bis 20mal wiederholt, bis kein weiters Öl oder Steroid mehr extrahiert wird. Öle und nicht umgesetztes 11-Desoxysteroid werden hierbei mit der Methylenchloridfraktion entfernt; etwa vorhandenes 6ß-hydroxyliertes Steroid, das in dem lla-hydroxylierten Produkt vorhanden ist, wird mit einer eingeschobenen zweiten Fraktion entfernt, und das reine 11 a-hydroxylierte Steroid wird mit der dritten Fraktion gewonnen. Die reinen Fraktionen werden durch Vergleich ihrer Ultrarotabsorption mit authentischen Proben identifiziert.
Wie oben erwähnt, lassen sich die erfindungsgemäß vorwiegend erhältlichen lla-Hydroxysteroide bequem nach bekannten Verfahren in die entsprechenden 11-Keto- und l lß-Hydroxyderivate umwandeln, z. B. nach dem Verfahren von Peterson, Eppstein u. a. in »Journal of the American Chemical Society, Bd. 75, S. 412 bis 415, nach dem Verfahren von O 1 i v e t o, R au s s e r u. a., Journal of the American Chemical Society, Bd. 78, S. 1736 bis 1738, oder nach denn Verfahren von Herzog, Payne u. a., Journal of the American Chemical Society, Bd. 77, S. 4781 bis 4784.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert: Beispiel 1 4-Pregnen-1 la,17a,21-triol-3,20-dion und 4-Pregnen-1 iß,17a,21-triol-3,20-dion Agarböden, die das oben beschriebene Medium Nr. 3 und 1,5°/o Agar enthalten, werden 15 Minuten bei 121°C unter einem Druck von 1,05 kg/em2 sterilisiert. Die Agarböden werden dann auf etwa 28°C gekühlt, geneigt, mit einem vegetativen Wachstum einer Kultur der Gattung Phoma (ATCC 13 145) inoculiert und bei einer Temperatur von 28'C incubiert, bis starke Sporenbildung eintritt.
Ein 2-1-Erlenmeyerkolben, der 500 ccm einer in ähnlicher Weise sterilisierten und gekühlten Brühemischung von Medium Nr. 3 enthält, wird dann mit Sporen von einem der starke Sporenbildung zeigenden Agarböden inoculiert und 24 bis 36 Stunden bei 28°C auf einem umlaufenden Schüttelapparat bei 280 Umdrehungen pro Minute incubiert. Am Ende dieser Zeit werden 6 g 4-Pregnen-17x,21-diol-3,20-dion in 60 ccm Äthanol zugesetzt. Der Kolben wird auf den Schüttelapparat zurückgebracht und die Incubation 24 bis 30 Stunden fortgesetzt; dabei werden 10-ccm-Proben in Abständen aus dem Erlenmeyerkolben entnommen, mit Chloroform extrahiert und papierchromatographiert, wobei als Lösungsmittelsystem Toluol-Äthylacetat verwendet wird und das Papier mit Wasser und Aceton imprägniert wurde. Die Incubation wird fortgesetzt, bis die Chromatographie vollständige Umwandlung des 4-Pregnen-17x,21-diol-3,20-dions anzeigt. Dann wird die Brühemischung mit Chloroform extrahiert, das Chloroform im Vakuum abgedampft; 20 g des Rückstandes werden in Methylenchlorid gelöst und über »Florisil« (Magnesiumsilikat), das mit Hexan präpariert ist, chromatographiert, wobei die Säule nacheinander mit Methylenchlorid 0,5°/a Methanol in Methylenchlorid, 10/(, Methanol in Methylenchlorid, 1,5010 Methanol in Methylenchlorid usw. eluiert und die Elution mit jeder dieser Mischungen so lange wiederholt wird, gewöhnlich etwa 10mal, bis kein weiteres Steroid mehr mit der betreffenden Fraktion entfernt wird. Man eluiert mit jeweils um 0,5% zunehmendem Methanolgehalt in Methylenchlorid bis einschließlich 5 °/o Methanol. Öle werden mit der Methylenchloridfraktion entfernt. 4-Pregnen-lIß,17x,21-triol-3,20-dion (Fp.217 bis 220°C) wird mit der 1,5°/o Methanol enthaltenden Fraktion entfernt; es kann mittels Essigsäureanhydrid-Pyridin in das 21-Acetat übergeführt werden. Aus den 2,5 und 3,00/, Methanol enthaltenden Fraktionen werden 3,3 g eines Gemisches von 4-Pregnen-6ß,17a,21-triol-3,20-dion, 4-Pregnen-15ß,17x,21-triol-3,20-dion, 4-Pregnen-11a,17a,21-triol-3,20-dion und 4-Pregnen-llß,17x,21-triol-3,20-dion erhalten. Aus den späteren 3 °/o Methanolfraktionen werden 2,5 g 4 - Pregnen -11 x,17oc,21- triol - 3,20 - dion (Fp. 122 bis 214°C) gewonnen.
Die reinen Fraktionen werden durch Umkristallisieren aus Aceton gereinigt und werden durch Vergleich ihrer Ultrarotspektren mit authentischen Proben identifiziert. Das Gemisch wird papierchromatographisch und durch Vergleich mit reinen Standardmustern identifiziert.
Weiteres 4 - Pregnen - l lß,17oc,21 - triol - 3,20 - dion wird aus dem oben in den 2,5 °/o und 3,0 °/o Methanolfraktionen enthaltenen Gemisch durch Acetyherung isoliert, indem das hydroxylierte Steroidgemisch mit 5 ccm Essigsäureanhydrid und 10 ccm Pyridin in ein Becherglas gebracht wird. Man läßt dieses Gemisch über Nacht stehen. Dann wird Wasser zu dem Gemisch zugesetzt und durch Kristallisation aus Aceton-Hexan das 4-Pregnen-llß, 17a,21-triol-3,20-dion-21-acetatleicht abgetrennt. Insgesamt gelangtman derart zu einer Ausbeute des genannten 21-Acetats von 1,2 g, das ist etwa 20 °/o der Theorie. Es wird durch Vergleich des Ultrarotspektrums mit einer authentischen Probe identifiziert.
Das gleiche Resultat wird erhalten, wenn anstatt des Mediums Nr. 1 das Medium Nr. 3 oder 4 verwendet wird.
Beispiel 2 4-Pregnen-11 a,17a,21-triol-3,20-dion Agarböden, die das oben beschriebene Medium Nr. 1 und 1,5 Gewichtsprozent Agar enthalten, werden 15 Minuten bei 121'C unter einem Druck von 1,05 kg/cm2 sterilisiert. Sie werden dann auf etwa 28'C abgekühlt, geneigt, mit einem vegetativen Wachstum einer Kultur von Beauvaria (ATCC 13144) inoculiert und bei einer Temperatur von 28'C incubiert, bis starke Sporenbildung eintritt.
Ein 2-1-Erlenmeyerkolben, der 500 ccm einer in ähnlicher Weise sterilisierten und gekühlten Brühe von Medium Nr. 1 enthält, wird dann mit Sporen von einem der starke Sporenbildung zeigenden Agarböden inoculiert und 24 bis 36 Stunden bei 28°C auf einem umlaufenden Schüttelapparat bei 280 Umdrehungen pro Minute incubiert. Dann werden 500 mg 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion in 5 ccm Äthanol zugesetzt. Der Kolben wird auf den Schüttelapparat zurückgebracht und die Incubation 24 bis 30 Stunden fortgesetzt; dabei werden in Abständen 10-ccm-Proben aus dem Erlenmeyerkolben entnommen, mit Chloroform extrahiert und, wie oben angegeben, papierchromatographisch untersucht. Die Incubation wird fortgesetzt, bis die Chromatographie die vollständige Umwandlung des 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dions in 4-Pregnen-lla,17a,21-triol-3,20-dion anzeigt. Dann wird mit Chloroform extrahiert, das Chloroform im Vakuum abgedampft und der Rückstand aus Aceton umkristallisiert, wobei 460 mg 4-Pregnen-lla,17a,21-triol-3,20-dion erhalten wird, das einen Schmelzpunkt von 212 bis 214°C hat und in jeder Hinsicht mit einer authentischen Probe identisch ist.
Beispiel 3 4-Pregnen-11 x,17a,21-triol-3,20-dion Agarböden, die das oben beschriebene Medium Nr. 1 und 1,5 Gewichtsprozent Agar enthalten, werden 15 Minuten bei 121'C bei einem Druck von 1,05 kg/cm2 sterilisiert. Die Agarböden werden dann auf etwa 28'C abgekühlt, geneigt, mit einem vegetativen Wachstum einer Kultur Glomerella cingulata (ATCC 10 534) inoculiert und bei 28'C incubiert, bis starke Sporenbildung eintritt. Ein 2-1-Erlenmeyerkolben, der 500 ccm einer in ähnlicher Weise sterilisierten und gekühlten Brühe von Medium Nr. 1 enthält, wird dann mit Sporen von einem der starke Sporenbildung zeigenden Agarböden inoculiert und 24 bis 36 Stunden bei 28°C auf einem umlaufenden Schüttelapparat bei 280 Umdrehungen pro Minute incubiert. Dann wird eine Lösung von 500 mg 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion in 5 ccm Äthanol zugesetzt. Der Kolben wird wieder auf den Schüttelapparat gebracht und die Incubation 24 bis 30 Stunden fortgesetzt; während dieser Zeit werden in Abständen 10-ccm-Proben aus dem Erlenmeyerkolben entnommen, mit Chloroform extrahiert und papierchromatographiert, wobei als Lösungsmittelsystem Toluol-Athylacetat verwendet wird und das Papier mit Wasser und Aceton imprägniert wurde. Die Incubation wird fortgesetzt, bis die Papierchromatographie einen vollständigen Übergang des 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dionsin 4-Pregnen-lla, 17,21-triol-3,20-dion anzeigt. Dann wird derKolbeninhalt mit Chloroform extrahiert, der Extrakt im Vakuum abgedampft und der Rückstand aus Aceton umkristallisiert, wobei man 450 mg 4-Pregnen-11a, 17oc,21-triol-3,20-dion erhält; Schmelzpunkt 212 bis 214°C; es ist in jeder Hinsicht identisch mit einer authentischen Probe.
Derselbe Versuch wird sechsmal wiederholt, indem anstatt Glomerella cingulata (ATCC 10534) irgendeiner der folgenden Organismen verwendet wird: Glomerella cingulata (ATCC 10531), Glomerella cingulata (ATCC 10532), Glomerella major (Baarn), Glomerella phacidiomorpha (Baarn), Glomerella rubicola (Baarn) und Glomerella cingulata (ATCC 10530). Der Chloroformextrakt der hydroxylierten Verbindung wird chromatographiert, aus einer Säule, wie im Beispiel 1 beschrieben, eluiert und schließlich aus Aceton umkristallisiert, wobei man 4-Pregnen-11 a;17a,21-triol-3,20-dion erhält.
Beispiel 4 4-Pregnen-11 a,17a,21-triol-3,20-dion Agarböden, die das oben beschriebene Medium Nr. 2 und 1,5 Gewichtsprozent Agar enthalten, werden 15 Minuten bei 121'C unter einem Druck von 1,05 kg/cm2 sterilisiert. Die Agarböden werden auf etwa 28'C abgekühlt, geneigt, mit einem vegetativen Wachstum einer Kultur von Glomerella cingulata (ATCC 10 534) inoculiert und bei einer Temperatur von 28'C incubiert, bis starke Sporenbildung eintritt.
Ein 2-1-Erlenmeyerkolben, der 500 ccm einer in ähnlicher Weise sterilisierten und gekühlten Brühe des Mediums Nr. 2 enthält, wird dann mit Sporen von einem der starke Sporenbildung zeigenden Agarböden inoculiert, mit 10 ccm eines Antischaummittels, bestehend aus 10/0 Octadecanol in Schmalzöl, versetzt und 24 bis 36 Stunden bei 28'C auf einem Schüttelapparat bei 280 Umdrehungen pro Minute incubiert. Dann werden 500 mg 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion in 5 ccm Äthanol zugesetzt. Der Kolben wird wieder auf den umlaufenden Schüttelapparat gebracht und die Incubation 24 bis 30 Stunden fortgesetzt; dabei werden in Abständen 10-ccm-Proben aus dem Erlenmeyerkolben entnommen, mit Chloroform extrahiert und, wie oben angegeben, papierchromatographiert. Die Incubation wird fortgesetzt, bis die Papierchromatographie die vollständige Umwandlung des. 4-Pregnen-17a,21-diol-3;20-dions in 4-Pregnen-lla, 17a,21-triol-3,20-dion anzeigt. Dann wird mit Chloroform extrahiert, das Chloroform im Vakuum abgedampft und der Rückstand aus Aceton umkristallisiert.
Beispiel 5 4-Pregnen-1 l a,17x,21-triol-3,20-dion Agarböden, die das oben beschriebene Medium Nr. 3 und 1,5 °/o Agar enthalten, werden 15 Minuten bei 121'C unter einem Druck von 1,05 kg/cm', sterilisiert. Die Agarböden werden dann auf etwa 28°C gekühlt, geneigt, mit einem vegetativen Wachstum einer Kultur von Glomerella lagenarium (Baarn) inoculiert und bei einer Temperatur von 28'C ineubiert, bis starke Sporenbildung eintritt.
Ein 2-1-Erlenmeyerkolben, der 500 ccm einer in ähnlicher Weise sterilisierten und gekühlten Brühemischung von Medium Nr. 3 enthält, wird dann mit Sporen von einem der starke Sporenbildung zeigenden Agarböden inoculiert und 24 bis 36 Stunden bei 28°C auf einem umlaufenden Schüttelapparat bei 280 Umdrehungen pro Minute incubiert. Am Ende dieser Zeit werden 500 mg 4-Pregnen-17oc,21-diol-3,20-dion in 5 ccm Äthanol zugesetzt. Der Kolben wird auf den Schüttelapparat zurückgebracht und die Incubation 24 bis 30 Stunden fortgesetzt; dabei werden 10-ccm-Proben in Abständen aus dem Erlenmeyerkolben entnommen, mit Chloroform extrahiert und, wie oben angegeben, papierchromatographisch untersucht. Die Incubation wird fortgesetzt, bis die Chromatographie vollständige Umwandlung des 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dions anzeigt. Dann wird die Brühemischung mit Chloroform extrahiert, das Chloroform im Vakuum abgedampft; 20 g des Rückstandes werden in Methylenchlorid gelöst und über 500 g »Florisil« (Magnesiumsilikat), das mit Hexan präpariert ist, chromato-: graphiert. Die Säule wird nacheinander mit Methylenchlorid, 0,501, Methanol in Methylenchlorid usw. eluiert, wobei, wenn nötig, jede Elution mit jeder dieser Mischungen wiederholt wird, bis in der betreffenden Fraktion kein Steroid mehr entfernt wird. Man eluiert mit jeweils um 0,5010 ansteigenden Methanolgehalten in Methylenchlorid bis einschließlich 5,001, Methanol in Methylenchlorid. Öle und nicht umgesetztes 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion werden mit der Methylenchloridfraktion entfernt; 4-Pregnen-lla,l7x,21-triol-3,20-dion wird aus den 2,5 und 3,00/, Methanol enthaltenden Fraktionen gewonnen und aus Aceton umkristallisiert.
Wenn Glomerella lagenarium (Baarn) durch Glomerella fusaroides (ATCC 9552) ersetzt wird, wird dasselbe Produkt, 4-Pregnen-llx,17oc,21-triol-3,20-dion, F. 212 bis 214°C, erhalten.
Beispiel 6 1,4-Pregnadien-11 a,17a,21-triol-3,20-dion Nach dem im Beispiels beschriebenen Verfahren wird 1,4-Pregnadien-11cx,17a,21-triol-3,20-dion(Fp.245 bis 246° C) erhalten, indem man 500 mg 1,4-Pregnadien-17ca,21-diol-3,20-dion anstatt der gleichen Menge 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion einsetzt.
Dieselbe Verbindung wird erhalten, wenn Glomerella lagenarium (Baarn) durch Glomerella cingulata (ATCC 10 529) ersetzt wird. Beispiel 7 1,4-Pregnadien-I l oc,17a,21-triol-3,20-dion Agarböden, die das oben beschriebene Medium Nr. 3 und 1,5 °/o Agar enthalten, werden 15 Minuten bei 121'C unter einem Druck von 1,05 kg/em2 sterilisiert. Der Agarboden wird dann auf etwa 28'C gekühlt, geneigt, mit einem vegetativen Wachstum einer Kultur von Glomerella cingulata (ATCC 10 534) inoculiert und bei einer Temperatur von 28'C incubiert, bis starke Sporenbildung eintritt.
Ein 2-1-Erlenmeyerkolben, der 500 cem einer in ähnlicher Weise sterilisierten und gekühlten Brühe von Medium Nr.3 enthält, wird dann mit Sporen von einem der starke Sporenbildung zeigenden Agarböden inoculiert und 24 bis 36 Stunden bei 28'C auf einem umlaufenden Schüttelapparat bei 280 Umdrehungen incubiert. Dann werden 500 mg 1,4-Pregnadien-17x,21-diol-3,20-dion-21-acetat in 5 ccm Äthanol zugesetzt. Der Kolben wird auf den Schüttelapparat zurückgebracht und die Ineubation 24 bis 30 Stunden fortgesetzt; dabei werden in Abständen 10-ccm-Proben aus dem Erlenmeyerkolben entnommen, mit Chloroform extrahiert und, wie oben angegeben, papierchromatographisch untersucht. Die Incubation wird fortgesetzt, bis die Chromatographie eine vollständige Umwandlung des 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion-21-acetats in 1,4-Pregnadien-11x,17x,21-triol-3,20-dion anzeigt. Das Produkt wird mit Chloroform extrahiert, das Chloroform im Vakuum abgedampft und der Rückstand aus Aceton umkristallisiert. Beispiel 8 16x-Methyl-allopregnan-11 a,17oe,21-triol-3,20-dion Agarböden, die das oben beschriebene Medium Nr. 1 und 1,5 °/p Agar enthalten, werden 15 Minuten bei 121'C unter einem Druck von 1,05 kg/em' sterilisiert. Sie werden dann auf etwa 28'C abgekühlt, geneigt, mit einem vegetativen Wachstum einer Kultur von Glomerella cingulata (ATCC 10 534) inoculiert und bei einer Temperatur von 28'C incubiert, bis starke Sporenbildung eintritt.
Ein 2-1-Erlenmeyerkolben, der 500 ccm einer in ähnlicher Weise sterilisierten und gekühlten Brühe von Medium Nr. 1 enthält, wird dann mit Sporen von einem der starke Sporenbildung zeigenden Agarböden inoculiert und 24 bis 36 Stunden bei 28°C auf einem umlaufenden Schüttelapparat bei 280 Umdrehungen pro Minute incubiert. Dann werden 500 mg 16a-Methylallopregnan-17a,21-diol-3,20-dion in 5 ccm Äthanol zugesetzt. Der Kolben wird auf den Schüttelapparat zurückgebracht und die Incubation 24 bis 30 Stunden fortgesetzt; dabei werden 10-ccm-Proben in Abständen finit Chloroform extrahiert und, wie oben angegeben, papierehromatographisch untersucht. Die Incubation wird fortgesetzt, bis die Chromatographie die vollständige Umwandlung des 16x-Methylallopregnan-17a,21-diol-3,20-dions in 16a-Methylallopregnan-l l x,17a,21-triol-3,20-dion anzeigt. Das Brühegemisch in dem Erlenmeyerkolben wird dann mit Chloroform extrahiert, das Chloroform im Vakuum abgedampft, der Rückstand aus Aceton umkristallisiert und, wie im Beispiel 5 beschrieben, chromatographiert und eluiert. Man gelangt so zum gewünschten 16a-Methylallopregnan-11 cx,17a,21-triol-3,20-dion. Analog erhält man aus einer Reihe anderer Verbindungen, wie 16x-Methyl-1,4-pregnadien-17x,21-diol-3,20-dion oder 16x-Methyl-4-pregnen-17x,21-diol-3,20-dion, die entsprechenden 11 x-hydroxylierten Verbindungen, also z. B. 16x-Methyl-1,4-pregnadienllx,17x,21-triol-3,20-dion (Fp. 236 bis 238°C) bzw. 16x - Methyl - 4 - pregnen -11 x,17x,21- triol - 3,20 - dion (Fp. 214 bis 216'C).

Claims

PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Herstellung von 11-hydroxylierten Steroiden der Pregnanreihe durch Bebrütung eines entsprechenden 11-Desoxysteroids mit den oxydierend wirkenden Enzymen von Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen und Abtrennung der Gärungsprodukte nach bekannten Verfahren, insbesondere durch Extraktion, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus eine Species des Fungus einer der Gattungen Beauvaria, Phoma oder Glomerella verwendet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Isolate des Stammes ATCC 13144, ATCC 13145 oder ATCC 10534 verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Fungus der Species Glomerella cingulata, Glomerella fusaroides, G. lagenarium, G. major, G. phacidiomorpha oder G. rubicola verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als 11-Desoxysteroid ein 3-Ketopregnan, ein 3-Ketoallopregnan oder ein ungesättigtes Analoges davon, insbesondere ein 4-Pregnen-17x,21-diol-3,20-dion, ein 1,4-Pregnadien-17x,21-diol-3,20-dion, ein 16-A1-kylallopregnan-17x,21-diol-3,20-dion, ein 16-Alkyl-4-pregnen-17x,21-diol-3,20-dion, ein 16-Alkyl-1,4-pregnadien-17x,21-diol-3,20-dion oder ein 21-Acetat eines derartigen 11-Desoxysteroids verwendet.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das als Ausgangsverbindung verwendete 11-Desoxysteroid als 16-Alkylgruppe eine 16x-Methylgruppe enthält.