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Verfahren zur mikrobiologischen Hydrierung, Dehydrierung,
Hydroxylierung und Seitenkettenspaltung von Steroiden
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gebildeten Sporen können in der Weise gewonnen werden, dass zuerst, um die Hauptmenge des Mycels abzutrennen, durch ein Filtertuch, und dann, um das übrige Mycel zu entfernen, durch Glaswolle filtriert wird. Die Sporen im Filtrat können durch Zentrifugieren abgetrennt und dann zur Entfernung etwa zurückgehaltener Nährstoffe mit Wasser gewaschen werden. Eine Lagerung der Sporen kann in trockener Form oder nach erneuter Suspendierung in destilliertem Wasser bei 4 C vorgenommen werden. Die Suspension kann standardisiert und z. B. auf einen Wert von einer Billion Sporen je ml eingestellt werden.
Die Sporen können auch auf einer Oberflächenkultur, z. B. Nähragar, gezüchtet werden ; nach Abschaben der Sporen und erneuter Suspendierung in Wasser können die Sporen in im wesentlichen reiner Form durch Filtrieren, Abzentrifugieren u. dgl. wie oben beschrieben gewonnen werden. Oberflächenkulturen sollen angewendet werden, wenn der Pilz in der Submerskultur keine Sporen oder diese nicht leicht abgibt.
Stämme von Pilzen aus der Klasse Mucorales, z. B. Rhizopus nigricans, geben die Sporen in der Submerskultur nicht ab und die Sporen dieses Pilzes sollen daher für die Verwendung gemäss der Erfindung durch Oberflächenzüchtung gewonnen werden. Das beste Verfahren für eine Sporenherstellung kann, falls es nicht bekannt ist, durch vorhergehende Versuche leicht bestimmt werden.
Zur raschen Umwandlung durch die Sporen sollen die Verbindungen in fein verteilter Form vorhanden sein. Dies wird leicht dadurch erreicht, dass das Steroid, z. B. in einem inerten, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie niedrigen Alkoholen (Methanol, Äthanol u. dgl.), mit Wasser mischbaren Glykolen, Aceton od. dgl., gelöst wird und die organische Lösung zur wässerigen Suspension der Sporen gegeben wird. Wenn dies geschehen ist, fällt das Steroid aus der Lösung in der gewünschten Form als feine Suspension aus.
Die Rückgewinnung des umgewandelten Steroids in der gewünschten hohen Ausbeute kann unter Verwendung organischer Lösungsmittel, in welchen das Steroid löslich ist, bequem erreicht werden, da vegetatives Material (Mycel) und Kulturflüssigkeit mit überschüssigen Nährstoffen ebenso abwesend sind wie komplexe, während der Fermentation gebildete Nebenprodukte.
Von besonderer Bedeutung ist es, dass die Sporen nach der Verwendung leicht rückgewonnen und erneut verwendet werden können. Zu diesem Zweck wird das Steroid in der Reaktionsmischung vorzugsweise mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Propylenglykol, in Lösung gebracht und die entstehende Mischung wird zentrifugiert, wobei die Sporen und ein Lösungsmittelextrakt des sporend tien Mediums rückgewonnen werden, aus dem das Steroid, wie oben angegeben, abgeschieden werden kann.
Die zurückerhaltenen Sporen, welche vorzugsweise mit Wasser gewaschen werden, können erneut verwendet werden, wenn sie in einem im wesentlichen nährstofffreien Medium aufbewahrt werden, in welchem die Sporen nicht keimen können.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann unter Verwendung von reinem Sauerstoff ebenso ausgeführt werden wie unter Anwendung von Luft. Die Belüftung kann auch unter Rühren durchgeführt werden, wobei die sauerstoffhaltigen Gase unter Druck angewendet werden. Während der Umwandlung kann dem sporenenthaltenden Medium eine geringe Menge von Kaliumcyanid (0, 65 Mol) oder CO und gegebenen falls eine geringe Menge (z. B. 0, 5%) Glukose einverleibt werden. Im allgemeinen erhöhen kleine Mengen eines oxydierbaren Stoffes, wie Glukose, Essigsäure, Milchsäure u. dgl., die Ausbeute. Diese Modifikationen können auch eine rasche oder vollständige Umwandlung der Steroide begünstigen ; wenn jedoch Glukose od. dgl. verwendet wird, ist es wichtig, das Medium von verwertbare Stickstoff freizuhalten, um einer Keimbildung vorzubeugen.
Durch die nachstehenden Beispiele wird das Verfahren gemäss der Erfindung näher erläutert : Beispiel l : Ein Glukose-Pepton-Nährmedium (flüssiger Sabouraud-Nähi'boden) wird mit 20/0 Agar verfestigt und zuerst mit Aspergillus ocharceus beimpft, wobei nach den üblichen Verfahren vorgegangen und etwa 5 Tage bei etwa 300C gezüchtet wird. Die während dieser Zeit gebildeten Sporen werden von der Oberfläche des entstandenen vegetativen Mycels mit destilliertem Wasser abgeschwemmt. Die erhaltene wässerige Suspension, die mit etwas Mycel und Nährmedium verunreinigt ist, wird durch Glaswolle filtriert, um das Mycel sowie etwa vorhandene unlösliche Nährstoffe abzutrennen. Dann wird zur Gewinnung der Sporen zentrifugiert.
Die löslichen Nährstoffe des Mediums, die von den Sporen zurückgehalten werden, werden durch Suspendieren der Sporen in destilliertem Wasser und Abzentrifugieren der Sporen abgetrennt. Diese Waschung (erneutes Suspendieren der Sporen in destilliertem Wasser und Abzentrifugieren) kann, falls erforderlich, wiederholt werden, um zu gewährleisten, dass die Sporen im wesentlichen von allen verunreinigend wirkenden Nährstoffen und ebenso von Mycel & ei sind.
Die so erhaltenen Sporen werden in destilliertem Wasser, das mit 10/0igem Phosphatpuffer auf einen PH-Wert von 6,5 bis 7,0 abgepuffert ist, suspendiert, wobei eine Suspension hergestellt wird, die etwa 1 - 10 Billionen Sporen/ml enthält. Zu etwa 20 ml dieser Suspension werden in einem 125 ml Erlenmeyerkolben 1 mg Progesteron zugesetzt, das in 1 ml Propylenglykol aufgelöst ist. Da das Glykol mit
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c) Reichstein's Verbindung S (#4-Pregnen-17α,21-diol-3,20-dion) zu Hydrocortison (A-Pregnen- - lss, 17a, 21-triol-3,20-dion) mit Cunninghamella blakesleana. (F. R. Hanson et al., J. Am. Chem. Soc.
75 [1953], S. 5369 ; s. auch G.M. Shull et al., J.Am. Chen. Soc, 77[1955], S. 763, und Thoma et al., USA-Patentschrift Nr. 2, 793, 162 betreffend ähnliche Reaktionen mit Curvularia lunata, Trichothecium
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Progesteron zu Adecora. (A. Schubertetal., Ber. 90 [1957], S. 2576.)
8. Einführung einer Hydroxygruppe in andere Stellungen, wie es bei P. D. Meister et al., Absts. 123rd
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Chem. Soc. [1953] ;S. 6213, welche Septomyxa affinis wie in Beispiel 2 zur Einführung einer Doppelbindung in Stellung 1, 2 verwenden.
10. Seitenkettenabbau.
Progesteron zu A-Androstadien-3, 20-dion mit Streptomyces lavendulae. (G. E. Peterson etal., J. Bact. 74 [1957], S. 684. S. auch E. Vischer und Mitarb., Bericht über Fusarium solani und F. caucasi- cum in Experienta 9 [1953], S. 371, wobei eine 1, 2-Doppelbindung mit der Seitenkettenspaltung einge-
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in einem von Nährstoffen für das vegetative Wachstum freien Medium im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens verwendet werden können.
Bei den angeführten Umsetzungen unter Verwendung von Sporen wird die Reaktionsdauer (welche im Einzelfalle durch vorhergehende Versuche ermittelt werden kann) im allgemeinen wesentlich abgekürzt und die Ausbeute ist erheblich erhöht gegenüber jener, wie sie bei den bekannten Verfahren erzielt wird. Ausser einem Zeitgewinn wird der weitere Vorteil erhalten, dass die Rückgewinnung der Steroide in guten Ausbeuten aus der relativ reinen Reaktionsmischung gemäss der Erfindung viel leichter ist als aus den bekannten Fermentationsmischungen, die vegetativ gewachsenes Material, organische Nährstoffe, Nebenprodukte derselben u. dgl. enthielten.
(Die Rückgewinnung kann gemäss den in den genannten Literaturstellen angegebenen Verfahren durchgeführt werden. ) Die Reinigung der modifizierten Verbindungen nach der Isolierung ist beim Verfahren gemäss der Erfindung ebenfalls viel leichter als aus den stark verunreinigten Mischungen, wie sie nach den bekannten Verfahren erhalten werden.
Das Verfahren gemäss der Erfindung, bei welchem Sporen verwendet werden, kann überall dort Anwendung finden, wo Mycel und Kulturflüssigkeit während der Fermentation des Pilzes bisher verwendet worden sind. Die Verwendung eines Steroids mit einer 11-Methylengruppe und Sporen, die von Aspergillus (s. USA-Patentschrift Nr. 2,649, 402) und Penicillum (s. USA-Patentschrift Nr. 2, 649,400) sowie Or ganismen, wie Septomyxa affinis, welche 1,2-Doppelbindungen einführen, erhalten worden sind, sind erläuternde Beispiele für eine bevorzugte Ausführungsform.
Es können auch zwei Umwandlungen gleichzeitig durchgeführt werden, indem Sporen von verschiedenen Pilzen gemeinsam zur Anwendung kommen, wobei auch gegebenenfalls verschiedene Stämme des gleichen Pilzes mit unterschiedlichem Verhalten oder aber auch Pilze aus verschiedenen Klassen verwendet werden. Die Verschiedenheit kann auch durch Mutation eines speziellen Organismenstammes hervor-
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