DE1005960B - Verfahren zur Herstellung von 17-Oxypregnanen - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung von 17-Oxypregnanen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 17-Oxypregnanen, nach dem man 17-Desoxypregnane der Einwirkung eines Sauerstoff einführenden Stammes eines Mikroorganismus der Art Trichoderma oder ihrer Sauerstoff einführenden Enzyme unterwirft.
• Die Entdeckung der bemerkenswerten therapeutischen Eigenschaften von Cortison, Hydrocortison und ähnlichen verwandten Verbindungen hat ein starkes Bedürfnis zur Auffindung einfacherer und wirtschaftlicherer Verfahren zur Herstellung solcher Verbindungen hervorgerufen. Bei der Synthese dieser Verbindungen muß man eine 17ständige Oxygruppe einführen. Obwohl verschiedene Verfahren zur Synthese von 17-Oxysteroiden entwickelt worden sind, sind diese doch nicht völlig zufriedenstellend, und man hat versucht, andere Verfahren zur technischen Herstellung von 17-Oxysteroiden mit hoher Ausbeute aufzufinden.
• Verfahren zur Einführung von Sauerstoff in Steroide durch Einwirkung von Mikroorganismen sind an sich bekannt. So ist z. B. bekannt, daß verschiedene Actinomyceten in eine Anzahl von Stellungen des Steroidmoleküls Sauerstoff einführen. In ähnlicher Weise führen verschiedene Sorten von Stämmen, die zur Mucoralesreihe gehören, Sauerstoff in verschiedene Stellungen des Steroidringgerüstes ein.
• Es ist auch schon vorgeschlagen worden, Sauerstoffsubstituenten in die 17-Stellung durch Einwirkung verschiedener Mikroorganismen einzuführen, aber es ist nicht ersichtlich, daß ein solches Verfahren technisch ausgeführt worden ist.
• Eine weitere Schwierigkeit besteht darin, daß viele Sauerstoff einführende Mikroorganismen, z. B. verschiedene Sorten der Mucorales, sehr wählerisch betreffs ihres Nahrungsbedarfs sind und daher die zur Züchtung solcher Mikroorganismen geeigneten Kulturmedien beschränkt sind. Fernerhin werden die Sporen vieler Phycomyceten, einschließlich der Mucorales, durch das Lyophilisierungsverfahren zerstört. Daraus ergibt sich eine erhebliche Schwierigkeit, die gewünschten Eigenschaften zu erhalten, da die Kulturen der Entartung unterliegen. Weiterhin geht das Wachstum der Mucorales in Submerskultur sehr schlecht vonstatten, und wenn man die Ansammlung von Schaum an der Oberfläche der Fermentationsflüssigkeit zuläßt, so sammeln sich die Mucorales in dem Schaum an und entwickeln sich zu einer über die Oberfläche der Kulturflüssigkeit ausgebreiteten Haut. Diese Bildung einer Oberflächenhaut ist von Nachteil, da ein solches Wachstum dem Mikroorganismus nicht gestattet, in innige Berührung mit dem Steroid zu kommen, welches sich in der Hauptmenge der Fermentationsbrühe befindet. Unter diesen Bedingungen sind daher große Mengen von Schaumverhinderungsmitteln erforderlich, die die Isolierung des gewünschten sauerstoffsubstituierten Steroids erschweren. Gegenstand der Erfindung ist die Erzeugung von 17-Oxypregnanen nach einem Verfahren, bei welchem die Schwierigkeiten, die sich bei den bisher bekannten Verfahren ergeben, nicht auftreten und welches durch Fermentation wirtschaftlich befriedigende Ausbeuten ohne Bildung unerwünschter Nebenprodukte ergibt. Andere Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung.
• Erfindungsgemäß wird die Einführung von Sauerstoff dadurch bewirkt, daß man Steroide der Pregnanreihe der Wirkung eines Sauerstoff einführenden Pilzstammes der Art Trichoderma oder der durch diese Mikroorganismen hervorgebrachten Sauerstoff einführenden Enzyme aussetzt. Das Verfahren nach der Erfindung eignet sich besonders zur Umwandlung von 17-Desoxypregnenen in die entsprechenden 17-Oxypregnene in guter Ausbeute ohne übermäßige Bildung unerwünschter Nebenprodukte. Die Fähigkeit von Mikroorganismen der Art Trichoderma, eine Hydroxylgruppe in die 17-Stellung des Steroidkerns einzuführen, muß als überraschend gelten, da andere Arten der gleichen Familie, wie Penicillium und Aspergillus, Sauerstoff in andere Stellungen des Steroidkernes einführen. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht also die Herstellung von Hormonen, wie Cortison, und anderen Produkten, die sich als Zwischenprodukte zur Herstellung verwandter Verbindungen, wie Hydrocortison, eignen. Ein anderer Vorteil der. Verwendung dieser Mikroorganismen besteht darin, daß der Teil des Ausgangsmaterials, der nicht zu 17-Oxysteroid umgesetzt wird, nicht durch Umwandlung in andere polyhydroxylsubstituierte Nebenprodukte zerstört wird und daher einfach durch Extraktion wiedergewonnen werden kann. Durch Zurückführung des wiedergewonnenen Ausgangsmaterials im Kreislauf erhält man das gewünschte 17-Oxysteroid in guter Ausbeute. Dies ist von besonderer Bedeutung, weil bei den bisherigen Herstellungsverfahren die teueren, als Ausgangsstoffe dienenden Steroide zerstört werden.
• Ein anderes wichtiges Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß dieser Mikroorganismus in einer großen Anzahl von Kulturmedien auf Sterinen gezüchtet werden kann und dieselben oxydiert. Weiterhin sind die Sauerstoff einführenden Stämme von Trichoderma sehr beständig und können lyophil gemacht und gelagert werden, ohne ihre oxydierenden Eigenschaften zu verlieren. Außerdem kann die Fermentation mit Trichoderma in Medien ausgeführt werden, die nur geringe Mengen von Schaumverhinderungsmitteln enthalten, wodurch die Gewinnung der gewünschten sauerstoffsubstituierten Produkte weiter erleichtert wird.
• Die Sauerstoff einführenden Stämme der Art Trichoderma gehören der Klasse der Fungi Imperfecti, der Reihe der Moniliales und der Familie der Moniliaceen an. Sorten dieser Art, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren wirksam sind, sind z. B. die Sorten Trichoderma lignorum, F5-1688, album, glaucum, viride, nunbergii, narcissi, konigi, nigrovirens. Die Sorte F5-1688 scheint mit der Sorte lignorum eng verwandt zu sein, obwohl sie nicht mit Sicherheit in dieser Hinsicht identifiziert wurde.
• Diese Mikroorganismen können aus bekannten Quellen, wie z. B. aus den Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, V. St. A., der American Type Culture Collection, Washington, D. C., oder vom Centraalbureau voor Schimmelculture in Baarn, Holland, bezogen werden. Andererseits können sie auch nach bekannten mikrobiologischen Verfahren aus natürlichen Quellen erhalten werden.
• Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Steroid, in das Sauerstoff eingeführt werden soll, der `Wirkung des Sauerstoff einführenden Enzyms ausgesetzt, welches durch Züchtung eines Sauerstoff einführenden Stammes von Pilzen der Art Trichoderma hervorgebracht wird. Dies geschieht am besten durch Züchtung des Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einer geeigneten Nährlösung in inniger Berührung mit dem durch Sauerstoff zu substituierenden Steroid, wobei man die Züchtung des Mikroorganismus fortsetzt, bis die gewünschte Substitution durch Sauerstoff stattgefunden hat. Wahlweise kann das Verfahren auch unter Verwendung homogenisierter ruhender Zellen ausgeführt werden, indem man zunächst den Mikroorganismus in einem geeigneten Fermentationsmedium unter aeroben Bedingungen züchtet, sodann die Zellen von dem Fermentationsmedium abtrennt und schließlich das Steroid zu diesen ruhenden Zellen zusetzt und die aeroben Bedingungen lange genug bestehenläßt, um die gewünschte Einführung von Sauerstoff zu erreichen. Die Verwendung ruhender Zellen hat den Vorteil, das Gewinnungsverfahren zu vereinfachen.
• Das Steroid kann dem Nährmedium als Suspension in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Wasser, als Lösung in einem Lösungsmittel, .wie Aceton, Propylenglykol, Dimethylformamid oder Dimethylacetamid, oder in feinzerteilter Form, z. B. als staubfeines Pulver, zugesetzt werden. Im allgemeinen soll das Steroid in sehr fein verteilter Form zugegen sein, damit der größtmögliche Kontakt mit dem Sauerstoff einführenden Kulturmedium stattfindet und die Reaktion vollständig verläuft. Man kann das gesamte Steroid auf einmal zusetzen oder den Zusatz fortlaufend oder absatzweise über eine gewisse Zeitspanne verteilen.
• Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl mit stationären Kulturen als auch mit Submerskulturen von Trichoderma unter aeroben Bedingungen ausgeführt werden; für praktische Zwecke wird es jedoch am vorteilhaftesten ausgeführt, wenn man den Mikroorganismus unter submersen Bedingungen in einem das Steroid enthaltenden geeigneten wäßrigen Fermentationsmedium züchtet. Die Menge des Steroids, die nach dem vorliegenden Verfahren mit Sauerstoff substituiert werden kann, hängt zum Teil von dem jeweils verwendeten besonderen Medium ab.
• Wäßrige Nährmedien, die zur Züchtung Sauerstoff einführender Stämme von Trichoderma geeignet sein sollen, müssen sowohl assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff als auch geringe Mengen anorganischer Salze enthalten. Als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff können alle zu diesem Zwecke üblichen Stoffe verwendet werden, wie Dextrose, Cerelose, Glucose, invertierte Melasse u. dgl. Ebenso sind die üblicherweise in Fermentationsverfahren verwendeten komplexen Quellen für Stickstoff, wie angedautes Lactalbumin (»Edamine«) und Maismaischflüssigkeit, oder anorganische Quellen für Stickstoff, wie sek. Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat u. dgl., auch zur Verwendung in den Fermentationsmedien nach der Erfindung geeignet. Geringe Mengen anderer Stoffe, wie Nicotinamid, oder anorganischer Salze, wie geeigneter löslicher Salze von Magnesium, Zink, Kalium, Natrium, Phosphor und Eisen, sind gewöhnlich in komplexen Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff enthalten oder können in geringen Mengen dem Fermentationsmedium zugesetzt werden, um das schnellste Wachstum des Sauerstoff einführenden Mikroorganismus zu fördern.
• Im folgenden werden Beispiele für wäßrige Nährmedien angegeben, die in dem vorliegenden Verfahren zur Einführung von Sauerstoff in Steroide Verwendung finden können.
• Medium Nr. 1

  Handelsübliche Dextrose (,)Cerelose«) . . . . . . . . 50,0 g

  Handelsübliches angedautes Lactalbumin

  (»Edamine«) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20,0 g

  Maismaischflüssigkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g

  Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein

  Gesamtvolumen von 11 Nährmedium zugesetzt

  und das p$ mit Natriumhydroxyd auf 6,5 einge-

  stellt.

  Medium Nr. 2

  Invertierte Melasse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100,09

  Handelsübliches angedautes Lactalbumin

  (»Edamine«) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20,0 g

  Maismaischflüssigkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g

  Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein

  Gesamtvolumen von 11 Nährmedium zugesetzt

  und das pa mit Natriumhydroxyd auf 6,5 einge-

  stellt.

  Medium Nr. 3

  Invertierte Melasse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100,0 g

  Maismaischflüssigkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g

  Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein

  Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt

  und das pg mit Natriumhydroxyd auf 6,5 einge-

  stellt.

  Medium Nr. 4

  Invertierte Melasse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100,0 g

  Maismaischflüssigkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20;0 g

  Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein

  Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt

  und das pH mit Natriumhydroxyd auf 6,5 einge-

  stellt.

  Medium Nr. 5

  Invertierte Melasse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50,0 g

  Maismaischflüssigkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6,3 g

  Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein

  Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt

  und das pH mit Natriumhydroxyd auf 6,5 einge-

  stellt.

  Medium Nr. 6

  Dextrose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50,00 g

  (N H4)2 H P 04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7,50 g

  KZ H P 04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,00 g

  MgS04 - 7H20 ... .. . ... . .. . .. .. . ... . ... .. . . 0,50g

  K Cl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,50 g

  FeS04 - 7H20 . ... . .. . ... ... .. . ... ... . ... .. 0,01 g

  Zn S 04 7 HZ O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,01 g

  Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt und das PH mit Natriumhydroxyd auf 6,5 eingestellt.
• Medium Nr. 7

  »Edamine« . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20,009

  Maismaischflüssigkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,62 g

  Dextrose .................................. 50,00 g

  Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt und das pH auf 6,5 eingestellt. Bei manchen Fermentationsmedien ist der Zusatz von Schaumverhinderungsmitteln wenn auch nicht wesentlich, so doch von Vorteil. Es hat sich herausgestellt, daß im Falle gewisser Fermentationsmedien der Zusatz eines substituierten Oxazalins, eines nichtflüchtigen, kationischen oberflächenaktiven Amins, welches im Handel unter dem Namen »Alkaterge C« erhältlich ist, die Menge des Schaumes besonders stark herabsetzt; man kann jedoch auch andere Schaumverhinderungsmittel verwenden, die sich für diesen Zweck nützlich erwiesen haben.
• Als Ausgangsstoffe für das erfindungsgemäße Verfahren können z. B. Progesteron, 4-Pregnen-21-ol-3, 20-dion-21-acetat, Desoxycorticosteron oder 4-Pregnen-3, 20-dion, 4-Pregnen-3ß-ol-20-on, 5, 6-Dichlorpregnan-3ß-ol-20-on, S, 6-Dichlorpregnan-21-ol-3, 20-dion u. dgl. verwendet werden.
• Ein 17-Desoxypregnen kann beispielsweise nach dem folgenden Verfahren mit Sauerstoff substituiert werden: Ein steriles Kulturmedium, z. B. eines der oben angegebenen, wird zunächst durch Einführung einer kleinen Menge einer Sporensuspension oder einer vegetativen Zucht eines Sauerstoff einführenden Stammes von Trichoderma beimpft. Das beimpfte Nährmedium wird dann bei der Temperatur von etwa 20 bis 45° bebrütet, wobei es für die Dauer von einigen Stunden bis zu mehreren Tagen in Gegenwart von Sauerstoff in Bewegung gehalten wird. Dann gibt man eine Lösung eines 17-Desoxypregnens in einem Lösungsmittel, wie Propylenglykol, zu dem Fermentationsmedium zu und setzt die Bewegung und Belüftung des Nährmediums etwa 5 bis 30 Stunden oder bis die Reaktion der Sauerstoffsubstitution vollständig ist, fort. Wenn die Einführung des Sauerstoffes beendet ist, kann das durch Sauerstoff substituierte Steroid aus der Fermentationsbrühe durch Extraktion mit einem geeigneten, mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel für das durch Sauerstoff substituierte Steroid gewonnen werden. Zu diesem Zweck geeignete Lösungsmittel sind z. B. Chloroform, Methylenchlorid, 2-Methyl-5-äthylenpyridin, Ester organischer Säuren, aromatische Kohlenwasserstoffe, Ketone oder Amine u. dgl. Die Lösung des durch Sauerstoff substituierten Steroids kann dann eingedampft werden, wobei man das gewünschte Produkt erhält, welches durch Umkristallisieren oder andere übliche Verfahren gereinigt werden kann.
• Wahlweise kann das erfindungsgemäße Verfahren auch so ausgeführt werden, daß man das Sauerstoff einführende Enzym, welches durch Fermentation von Trichoderma erzeugt wurde, mit dem durch Sauerstoff zu substituierenden Steroid in Berührung bringt. Dies kann erfolgen, indem man die Sauerstoff einführenden Enzyme aus der Fermentationsbrühe nach an sich bekannten Verfahren gewinnt und sie mit dem Steroid in einem wäßrigen Medium in Berührung bringt.
• Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.
• Beispiel 1 Etwa 50 ccm des Mediums Nr. 1 wurden 30 Minuten bei 120° in einem 250-ccm-Kolben sterilisiert. Dann wurde das Medium mit ungefähr 3 ccm eines vegetativen Wachstums einer Kultur von Trichoderma F5-1688 beimpft. Die Mischung wurde auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit einer Geschwindigkeit von 220 Umdr./Min. etwa 72 Stunden in Bewegung gehalten, wobei die Temperatur auf 28° gehalten wurde. Dann wurde eine sterile Lösung von 10 mg 4-Pregnen-3, 20-dion in 2,5 cm Propylenglykol zu dem Fermentationsmedium zugesetzt und die Belüftung und Bewegung mit der gleichen Geschwindigkeit noch 48 Stunden fortgesetzt. Dann wurde der Ansatz filtriert und mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte wurden als Papierchromatogramm unter Anwendung des Verfahrens von Zaffaroni (Science, Bd. 11I, 1950 S. 6) mit Hilfe des Lösungsmittelsystems Propylenglykol-Methanol entwickelt. Es wurde ein chromatographischer Fleck mit einem Rf-Wert beobachtet, welcher 4-Pregnen-17a-ol-3, 20-dion entsprach, und der die für 4-Pregnen-17a-ol-3, 20-dion charakteristische Vanillin-Schwefelsäurereaktion gab. Die Ausbeute betrug annähernd 15 °/o.
• Beispiel 2 .
• Es wurde ähnlich wie nach Beispiel 1 mit 5 ccm eines vegetativen Wachstums der Kultur album gearbeitet und die Fermentation nach Zusatz des Steroids 24 Stunden fortgesetzt. Das von der Brühe abgeschiedene Produkt ergab einen chromatographischen Fleck in der Gegend von 4-Pregnen-17a-ol-3, 20-dion. Die Ausbeute betrug annähernd 15 °/,.
• Beispiel 3 Es wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 1 mit 5 ccm eines vegetativen Wachstums der Kultur glaucum gearbeitet, und es wurden an Stelle des 4-Pregnen-3, 20-dions 10 mg 4-Pregnen-21-ol-3, 20-dion zugesetzt. Die Fermentation wurde 24 Stunden fortgesetzt, und das von der Brühe abgeschiedene Produkt gab einen chromatographischen Fleck in der Gegend von 4-Pregnen-17a-21-diol-3, 20-dion. Beispiel 4 Es wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 mit 5 ccm eines vegetativen Wachstums der Kultur viride gearbeitet, und es wurden an Stelle des 4-Pregnen-3, 20-dions 10 mg 4-Pregnen-11 ß-ol-3, 20-dion zugesetzt. Die Fermentation wurde 48 Stunden fortgesetzt, und das von der Brühe abgeschiedene Produkt gab einen chromatographischen Fleck in der Gegend von 4-Pregnen-11 ß, 17 a-diol-3, 20-dion.
• Beispiel 5 Es wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 mit 5 ccm eines vegetativen Wachstums der Kultur nigrovirens gearbeitet. Die Fermentation wurde 48 Stunden fortgesetzt, und das von der Brühe abgeschiedene Produkt gab einen chromatographischen Fleck in der Gegend von 4-Pregnen-17 a-ol-3, 20-dion.
• Beispiel 6 Es wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 mit 5 ccm eines vegetativen Wachstums der Kultur königi gearbeitet. Die Fermentation wurde 48 Stunden fortgesetzt, und das von der Brühe abgeschiedene Produkt gab einen chromatographischen Fleck in der Gegend von 4-Pregnen-17 a-ol-3, 20-dion.
• Beispiel 7 Ungefähr 50 ccm des Mediums Nr. 7 wurden 30 Minuten bei 120° in einem 250-ccm-Kolben sterilisiert. Dann wurde das Medium mit etwa 3 ccm eines vegetativen Wachstums einer Kultur von Trichoderma F5-1688 beimpft. Die Mischung wurde etwa 48 Stunden mit Hilfe einer rotierenden Schüttelmaschine mit einer Geschwindigkeit von 220 Umdr./Min. in Bewegung gehalten, wobei die Temperatur auf 28° gehalten wurde. Dann wurde eine sterile Lösung von 10 mg 4-Pregnen-3, 20-dion in 2,5 ccm Propylenglykol zu dem fermentierten Medium zugesetzt und die Bewegung mit der gleichen Geschwindigkeit noch 48 Stunden fortgesetzt. Danach wurde der Ansatz filtriert und mit Chloroform extrahiert, und der gesamte Extrakt . wurde als Papierchromatogramm entwickelt, wie im Beispiel 1 beschrieben. Der Extrakt zeigte hierbei merkliche Mengen des Oxydationsproduktes an einer Stelle gegenüber 4-Pregnen-17a-ol-3, 20-dion. Das gegenüber 4-Pregnen-17a-ol-3, 20-dion gelegene Band wurde ausgeschnitten und mit Methanol eluiert. Das Methanoleluat wurde im Vakuum konzentriert und der Rückstand in konzentrierter Schwefelsäure aufgenommen. Das UV-Spektrum in konzentrierter Schwefelsäure war ähnlich demjenigen des 4-Pregnen-17a-ol-3, 20-dion.
• Beispiel 8 Es wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 7 mit der Ausnahme gearbeitet, daß an Stelle des 4-Pregnen-3, 20-dions 10 mg 4-Pregnen-11 ß-ol-3, 20-dion zugesetzt wurden. Das nach Beispiel 1 chromatographierte und entwickelte Produkt ergab bedeutende Mengen des Oxydationsproduktes an einer Stelle gegenüber 4-Pregnen-11ß, 17-diol-3, 20-dion.
• Beispiel 9 60 Muster von je 50 ccm des Mediums Nr. 1 wurden in 250-ccm-Kolben 30 Minuten bei 120° sterilisiert. Jedes der Medien wurde dann mit etwa 5 ccm eines vegetativen Wachstums der Kultur Trichoderma F5-1688 beimpft. Die beimpften Kolben wurden dann auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei einer Geschwindigkeit von 220 Umdr. /Min. bei einer Temperatur von 28° etwa 48 Stunden in Bewegung gehalten. Dann wurde zu jedem der 60 fermentierten Medien eine sterile Lösung von 10 mg 4-Pregnen-3, 20-dion in 2,5 ccm Propylenglykol zugesetzt und die Bewegung der Kolben noch 48 Stunden fortgesetzt. Die Fermentationsbrühen wurden dann filtriert und zusammengegossen. Die filtrierte Brühe wurde zweimal mit je 21 Äthylacetat und das Mecyl mit 1 1 Äthylacetat extrahiert. Die Extraktlösungen wurden vereinigt und zur Trockne gedampft. Dann wurde der Rückstand zwischen 70°%igem Äthanol und Petroläther verteilt. Die Petrolätherschicht wurde verworfen, die Äthanolschicht im Vakuum konzentriert und der wäßrige Rückstand mit Chloroform extrahiert. Der Chloroformextrakt wurde auf Silicagel chromatographiert, wobei zunächst mit Benzol und dann nacheinander mit 5()/oigem, 25°/oigem und 50-l)/oigem Äthylacetat in Benzol ausgewaschen wurde. Die aus dem Eluat des 50%igen Äthylacetats erhaltene kristalline Fraktion erwies sich als 4-Pregnen-17 a-ol-3, 20-dion. Die Ausbeute betrug annähernd 150/,.
• Beispiel 10 Etwa 30 ccm des Mediums Nr. 1 wurden 20 Minuten bei 120° in einem 250-ccm-Kolben sterilisiert. Dann wurde das Medium auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit einer Geschwindigkeit von 220 Umdr./Min. ungefähr 48 Stunden unter Einhaltung einer Temperatur von 28° in Bewegung gehalten. Darauf wurde eine sterile Lösung von 10 mg 4-Pregnen-21-ol-3, 20-dion in 2,5 ccm Propylenglykol zu dem fermentierten Medium zugesetzt und die Bewegung mit der gleichen Geschwindigkeit 48 Stunden fortgesetzt. Nach dieser Zeit wurde der Ansatz filtriert und mit Chloroform extrahiert und der gesamte Extrakt nach Beispiel 1 chromatographiert und entwickelt. Der Extrakt gab bedeutende Mengen des Oxydationsproduktes an einer Stelle gegenüber 4-Pregnen-17 a, 21-diol-3, 20-dion. Das UV-Spektrum in konzentrierter Schwefelsäure war ähnlich demjenigen von 4-Pregnen-17 a, 21-diol-3, 30-dion. Die Ausbeute betrug annähernd 15 %.

Claims (3)

1. PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Herstellung von 17-Oxypregnanen durch biologische Oxydation der entsprechenden 17-Desoxypregnane, dadurch gekennzeichnet, daß man die biologische Oxydation mit der Kultur eines Sauerstoff einführenden Stammes eines Mikroorganismus der Art Trichoderma oder mit dem durch diese erzeugten Sauerstoff einführenden Enzym in bekannter Weise durchführt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Sorte Trichoderma album, glaucum, viride, nigrovirens oder konigi verwendet.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man 4-Pregnen-3, 20-dion, 4-Pregnen-llß-ol-3, 20-dion oder 4-Pregnen-21-ol-3, 20-dion als Ausgangsverbindung verwendet. In Betracht gezogene Druckschriften: Rec. Progress Horm. Res., Bd. VI, 1951, S. 215; USA.-Patentschrift Nr. 2 602 769.