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Verfahren zur Herstellung von 16 a-Methyl-11 a,17 a-dioxy-4-pregnen-3,20-dion
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Steroide, insbesondere
von 16x-Methyl-11x,17xdioxy-4-pregnen-3,20-dion aus 16;x-Methyl-4-pregnen-3,20-dion.
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Das neue 16x-Methyl-I1x,17n-dioxy-4-pregnen-3,20-dion kann in 16x-Methyl-17,x,21-dioxy-4-pregnen-3,11,20-trion
und 16x-Methyl-l1ß,17a,21-trioxy-4-pregnen-3,20-dion übergeführt werden, welche
in hohem Maße entzünducigshemmend wirken und besonders zur Behandlung von Arthritis
und ähnlichen Krankheiten wirksam sind.
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Erfindungsgemäß wird 16x-Methyl-4-pregnen-3,20-dion nach an sich bekannten
Methoden der Wirkung eines oxydierenden Enzyms, welches durch einen oxygenierend
wirkenden Stamm von Dactylium dendroides unter aeroben Bedingungen erzeugt wird,
unterworfen, wobei sich 16x-Methyl-lla,l7a-dioxy-4-pregnen-3,20-dion der Formel
bildet. Zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können Stämme von Dactylium
dendroides, welche auf 16x-Methyl-4-pregnen-3,20-dione oxygenierend wirken, aus
bekannten Kultursammlungen erhalten werden. Beispielsweise ist eine derartige Kultur
Dactylium dendroides Nr. NRRL 2574 von den Northern Regional Research Laboratories,
Peoria, Illinois, erhältlich. Der Mikroorganismus wird unter aeroben Bedingungen
in einem geeigneten Nährmedium in inniger Berührung mit dem zu oxygenierenden 16x-Methyl-4-pregnen-3,20-dion
gezüchtet; die Gärung oder das Wachstum des Mikroorganismus wird so lange fortgesetzt,
bis die erwünschte Oxygenierung erreicht ist. Somit kann das zu oxygenierende 16a-Methyl-4-pregnen-3,20-dion
unmittelbar in ein geeignetes Medium eingebracht werden, welches dann mit einem
oxygenierend wirkenden Stamm von Dactylium dendroides beimpft und unter aeroben
Bedingungen bebrütet wird, wobei die erwünschte Oxygenierung vor sich geht. Im allgemeinen
wird das Verfahren vorzugsweise dergestalt ausgeführt, daß man zunächst den Mikroorganismus
in einem geeigneten Gärmedium wachsen läßt, dann das 16x-Methyl-4-pregnen-3,20-dion
einträgt und die Kultivierung des Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen so lange
fortsetzt, bis die gewünschte Oxygenierung erreicht ist.
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Das Verfahren gemäß der Erfindung kann in stationären und submersen
Kulturen von Dactylium dendroides, die unter aeroben Bedingungen wachsen, vonstatten
gehen; aus praktischen Gründen ist es zweckmäßig, den Mikroorganismus submers in
einem geeigneten wäßrigen, das Steroid enthaltenden Gärmittel wachsen zu lassen.
Die Steroidmenge, welche oxygeniert wird, hängt zum Teil von dem jeweils angewandten
Medium ab.
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Wäßrige Nährmedien, welche für das Wachstum der oxygenierenden Stämme
von Dactylium dendroides geeignet sind, müssen Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff
und Stickstoff sowie kleinere Mengen anorganische Salze enthalten. Als Quelle für
assimilierbaren Kohlenstoff werden die üblicherweise benutzten Substanzen verwendet,
wie Dextrose, Cerelose (technische Dextrose), Glukose, invertierte Melasse usw.
Ähnlich werden komplexe Stickstoffquellen, die in technischen Gärprozessen üblicherweise
verwendet
werden, in die Gärmedien gemäß vorliegender Erfindung
eingebracht, wie technisches digeriertes Lactalbumin (bekannt unter dem Handelsnamen
»EdaminH) und Maismischflüssigkeit oder eine anorganische Stickstoffquelle, wie
Natriumnitrat oder Aminoniumnitrat. Geringe Mengen anorganischer Salze, wie lösliche
Salze von Magnesium, Kalium, Natrium und Eisen, stehen gewöhnlich in komplexen Kohlenstoff
und Stickstoffquellen zur Verfügung oder können in das Gärmedium in geringer Menge
eingebrachtwerden, um ein höchstmögliches Wachstum der oxygenierenden Mikroorganismen
zu sichern.
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1n folgendem wird ein Beispiel für ein wäßriges Nährmedium mitgeteilt,
welches zur Oxygenierung von Steroiden eingesetzt werden kann
| Medium Nr. 1 |
| Dextrose ............................. 50,0 |
| (NHQ)a HP04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7,5 |
| K,HP04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . 1,0 |
| KCl ...... ....... ............. 0,5 |
| M9S04 7H10 . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 |
| Fe S 04 7H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . 0,001 |
| Zn S 04 7H10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 |
Destilliertes Wasser wird bis zu einem Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt;
das pri wird mittels Natriumhydroxyd auf 6,5 eingestellt.
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Im Bedarfsfall werden Antischaummittel in geringer Menge zugesetzt,
um das erwünschte oxygenierte Steroid in höchster Ausbeute zu erhalten. Es wurde
gefunden, daß der eines nichtflüchtigen substituierten Oxazolins, welches ein kationisches
oberflächenaktives Mittel vom Amintyp ist (Handelsname »Alkaterge O#), die Schaummenge
wirksam vermindert; natürlich können auch andere Antischaummittel benutzt werden.
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16a-Methyl-4-pregnen-3,20-dion kann beispielsweise folgendermaßen
oxygeniert werden: Ein steriles Kulturmedium, z. B. nach einer der obigen Zusammensetzungen,
wird zunächst mit einer geringen Menge einer Sporensuspension im vegetativen Wachstum
eines oxygenierenden Stammes von Dactylium dendroides beimpft. Das beimpfte Nährmedium
wird bei etwa 27 bis 28°C unter Bewegung in Gegenwart von Sauerstoff etwa 24 bis
48 Stunden bebrütet. Alsdann wird eine Lösung von 16x-Methyl-4-pregnen-3,20-dion
in Propylenglykol in das Gärmedium eingetragen und Bewegung nebst Belüftung des
Nährn@ediurr.s etwa 5 bis 30 Stunden bzw. bis zur Beendigung der Oxygenierungsreaktion
fortgesetzt.
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Nach Abschluß der Oxygenierung wird das oxygenierte Steroid mit einem
wasserunmischbaren organischen Lösungsmittel aus der Gärbrühe extrahiert. Geeignete
Lösungsmittel sind unter anderem Chloroform, Methylenchlorid, Ester organischer
Säuren, aromatische Kohlenwasserstoffe usw. Die das oxygenierte Steroid enthaltende
Lösungsmittellösungkann dann zur Gewinnung des erwünschten Produktes eingedampft
werden, welches durch Umkristallisieren oder in anderer Weise weiter gereinigt wird.
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Das folgende Beispiel erläutert das erfindungsgemäße Verfahren. Beispiel
Etwa 3,21 Nährmedium Nr. 1 gemäß obiger Zusammensetzung und ein substituiertes Oxazolin
(Alkaterge C) in geringer Menge zur Schaumverhütung wurde 1/a Stunde bei 100°C sterilisiert.
Danach wurde das Medium mit etwa 250 ml eines vegetativen Wachstums eines oxydierenden
Stammes Dactylium dendroides culture NRRL 2574 aus der Sammlung Northern Regional
Research Laboratories, Peoria, Illinois, beimpft. Das Gemisch wurde mit einem Zweiturbinenrührwerk
mit 560 U/min in Bewegung gehalten und Luft in einer Menge von 31/min unter Aufrechterhaltung
der Temperatur auf 28'C etwa 24 Stunden eingeleitet.
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Nach Ablauf von 24 Stunden wurden 1,28 g 16a-Methyl-4-pregnen-3,20-dion
in einer Lösung von 160 ml Propylenglykol in das Gärmedium eingetragen und das Medium
mit der gleichen Geschwindigkeit weiter in Bewegung gehalten. Die Belüftung des
Mediums wurde mit 3,01 1/min 6 Stunden fortgeführt und dann für 6 Stunden unterbrochen.
Nach Zusatz des Steroids wurde der Prozeß 36 Stunden fortgesetzt.
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Aus der Gärbrühe wurde lla,17a-Dioxy-16a-methyl-4-pregnen-3,20-dion
mittels Essigsäureäthylester isoliert und das organische Lösungsmittel im Vakuum
verdampft; der Rückstand wurde aus Essigsäureäthylester umkristallisiert.
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Die Verbindung wurde auf Grund der Ergebnisse papierchromatographischer
Untersuchungen identifiziert. Die Beweglichkeit der entsprechenden Verbindung ohne
die 16x-ständige Methylgruppe und die Wirkung des Eintritts einer 16,1c-ständigen
Methylgruppe in verschiedene andere Verbindungen war bekannt. Danach ließ sich die
Beweglichkeit von lla,17a-Dioxy-16a-methyl-4-pregnen-3,20-dion voraussagen; die
erwartete Beweglichkeit stimmte mit der an dieser Verbindung beobachteten Beweglichkeit
überein.
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Die absteigende Papierchromatographie mit Formamid-Methanol (50: 50)
als der stationären Phase und Benzol-Chloroform (50: 50) als der bewegten Phase
wurde in einem Zeitraum von 8 Stunden durchgeführt. Die Lösungsmittelfront war dann
um etwa 37,5 cm vorgerückt. Die Bezugssubstanz, 11n,17x-Dioxy-4-pregnen-3,20-dion,
hatte etwa die Hälfte dieser Entfernung zurückgelegt. Bei gleichzeitigem Start war
llcx,17@-Dioxy-16a-methyl-4-pregnen-3,20-dion beweglicher; es hatte sich auf dem
Papierstreifen etwa 1,2- bis 1,25m11 soweit nach unten bewegt wie die Bezugssubstanz.