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Verfahren zur Herstellung von 21-Oxypregnanen Die Entdeckung der bemerkenswerten
therapeutischen Eigenschaften von Cortison, Hydrocortison und ähnlichen verwandten
Verbindungen hat ein starkes Bedürfnis zur Auffindung einfacherer und wirtschaftlicherer
Verfahren zur Herstellung solcher Verbindungen hervorgerufen. Bei der Synthese dieser
Verbindungen muß man einen 21ständigen Oxysubstituenten einführen. Obwohl verschiedene
Verfahren zur Synthese von 21-Oxysteroiden entwickelt worden sind, sind diese doch
nicht völlig zufriedenstellend, und man hat versucht, andere Verfahren zur technischen
Herstellung von 21-Oxysteroiden mit hoher Ausbeute aufzufinden.
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Verfahren zur Einführung von Sauerstoff in Steroide durch Einwirkung
von Mikroorganismen sind an sich bekannt. So ist z. B. bekannt, daß verschiedene
Actinomyceten in eine Anzahl von Stellungen des Steroidmoleküls Sauerstoff einführen.
In ähnlicher Weise führen verschiedene Sorten von Stämmen, die zur Mucoralesreihe
gehören, Sauerstoff in verschiedene Stellungen der Steroidringstruktur ein. Obwohl
man bereits Mikroorganismen zur Einführung von Sauerstoff in verschiedene Stellungen
des Steroidkernes vorgeschlagen hat, ist doch bisher noch von keinem Mikroorganismus
bekannt, daß er Sauerstoff in eine an dem Steroidkern gebundene Seitenkette einführt.
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Erfindungsgemäß wird die Einführung von Sauerstoff in Steroide dadurch
bewirkt, daß man die Steroide der Wirkung eines Sauerstoff einführenden Pilzstammes
der Familie der Sphaeroidaceen oder der durch diese Mikroorganismen hervorgebrachten
Sauerstoff einführenden Enzyme aussetzt. Eine Gruppe dieser Pilze, die sich als
besonders wirksam erwiesen hat, ist das Genus Woj nowicia. Das Verfahren nach der
Erfindung eignet sich zur Umwandlung von 21-Desoxypregnenen oder -pregnanen ih die
entsprechenden 21-Oxypregnene oder -pregnane mit guter Ausbeute praktisch ohne Bildung
unerwünschter Nebenprodukte. Das Verfahren liefert also ein wertvolles Mittel zur
Einführung eines 21 ständigen Oxysubstituenten und damit zur Herstellung von Hormonen
wie Cortison und anderen Produkten, die sich als Zwischenprodukte zur Herstellung
verwandter Verbindungen, wie Hydrocortison, eignen.
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Es ist bekannt, 21-Desoxysteroide in die entsprechenden 21-Oxysteroide
durch Bebrütung mit Nebennierenrindenhomogenaten herzustellen. Dieses Verfahren
ist an eine bestimmte beschränkte Stoffklasse gebunden, die wegen ihrer Herkunft
einer besonderen Behandlung, z. B. durch Einfrieren mittels fester Kohlensäure bedarf,
um für den Einsatz bereit gehalten zu werden. Mit vorliegender Erfindung wird eine
große Mikrobiengruppe für die biologische Oxydation von 21-Desoxypregnanen zur Verfügung
gestellt und dadurch dieser Methode eine große Arbeitsbreite eröffnet. Die Vorteile
des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in folgendem beschrieben. Das erfindungsgemäße
Verfahren ist besonders wertvoll, weil die Verwendung von Pilzen der Familie der
Sphaeroidaceen (Phomaceen) und insbesondere des Genus Wojnowicia die Einführung
einer Oxygruppe in die 21-Stellung durch Fermentation ermöglicht. Die Erfindung
sieht also ein einfaches Fermentationsverfahren zur Einführung einer solchen Gruppe
vor, die bisher nur mit Hilfe umständlicher Synthesen möglich war, die eine Anzahl
verschiedener Stufen erforderten. Ein anderes Merkmal des Verfahrens liegt darin,
daß einige dieser Mikroorganismen Sauerstoff selektiv in die 21-Stellung einführen.
Dies ist wesentlich, weil sich daraus viel bessere Ausbeuten des gewünschten Produktes
ergeben und einfachere Gewinnungsverfahren angewandt werden können. Ein anderes
wichtiges Merkmal des Wojnowicia-Verfahrens besteht darin, daß dieser Mikroorganismus
in einer großen Anzahl von Kulturmedien auf Sterinen gezüchtet werden kann und dieselben
oxydiert. Weiterhin sind die Sauerstoff einführenden Stämme von Wojnowicia sehr
beständig und können lyophil gemacht und gelagert werden, ohne ihre oxydierenden
Eigenschaften zu verlieren.
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Die Sauerstoff einführenden Stämme der Pilze der Familie der Sphaeroidaceen
(Phomaceen), einschließlich des erfindungsgemäß verwendeten Genus Wojnowicia gehören
der Klasse der Fungi Imperfecti und der Reihe Sphaeropsidales (Phomales) an. Sorten
dieser Familie, die für das Verfahren nach der Erfindung gewählt werden können,
sind z. B. die folgenden: Die Sorten Wojnowicia graminis (MF-2419), Wojnowicia lophostoma,
Wojnowicia
tenella, Hendersonia acicola, Hendersonia herpotricha,
Hendersonia phragmitis, Hendersonia rubi, Hendersonia aberrans, Hendersonia abietus,
Phoma numicola, Phoma hibernica, Phoma betae, Pyrenochaeta decipiens, Coniothyrium
fuchelii, Septoria aesculi, Phopsis citri, Septoria apii, Septoria lycopersici.
Andere der Familie der Sphaeroidaceen angehörige erwähnenswerte Stämme sind Phoma,
Pyrenochaeta, Ceratopycnis, Eriosporina, Prosthemium, Cryptosticites, Coniothyrium,
Phopsis, Septoria, Dilophospora, Hendersonula, Uroconis, Pyrenochaeta, Gouturea,
Hendersonia, Goniothyrium, Phoma, Phomopsis, Diplodia, Stagnospora, Septoria.
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Diese Mikroorganismen können aus bekannten Quellen, wie z. B. aus
den Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, V. St. A., der American
Type Culture Collection, Washington, D. C., oder vom Centraalbureau voor Schimmelculture
in Baarn, Holland, bezogen werden. Andererseits können sie auch nach bekannten mikrobiologischen
Verfahren aus natürlichen Quellen erhalten werden.
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Bei der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Steroid,
in das Sauerstoff eingeführt werden soll, der Wirkung des Sauerstoff einführenden
Enzyms ausgesetzt, welches durch Züchtung eines Sauerstoff einführenden Stammes
von Pilzen der Familie der Sphaeroidaceen hervorgebracht wird. Dies geschieht am
besten durch Züchtung des Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einer geeigneten
Nährlösung in inniger Berührung mit dem durch Sauerstoff zu substituierenden Steroid,
wobei man die Züchtung des Mikroorganismus fortsetzt, bis die gewünschte Substitution
durch Sauerstoff stattgefunden hat. Wahlweise kann das Verfahren auch unter Verwendung
homogenisierter ruhender Zellen ausgeführt werden, indem man zunächst den Mikroorganismus
in einem geeigneten Fermentationsmedium unter aeroben Bedingungen züchtet, sodann
die Zellen von dem Fermentationsmedium abtrennt und schließlich das Steroid zu diesen
ruhenden Zellen zusetzt und die aeroben Bedingungen lange genug bestehen läßt, um
die gewünschte Einführung von Sauerstoff zu erreichen. Die Verwendung ruhender Zellen
hat den Vorteil, das Gewinnungsverfahren zu vereinfachen.
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Das Steroid kann dem Nährmedium als Suspension in einem geeigneten
Lösungsmittel, wie Wasser, als Lösung in einem Lösungsmittel, wie Aceton, Propylenglykol,
Dimethylformamid oder Dimethylacetamid, oder in feinzerteilter Form, z. B. als staubfeines
Pulver, zugesetzt werden. Im allgemeinen soll das Steroid in sehr fein verteilter
Form zugegen sein, damit der größtmögliche Kontakt mit dem Sauerstoff einführenden
Kulturmedium ; stattfindet und die Reaktion vollständig verläuft. Man kann das gesamte
Steroid auf einmal zusetzen oder den Zusatz fortlaufend oder absatzweise über eine
gewisse Zeitspanne verteilen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl mit stationären Kulturen
als auch mit Submerskulturen von unter aeroben Bedingungen züchtbaren Sphaeroidaceen
ausgeführt werden; für praktische Zwecke wird es jedoch am vorteilhaftesten ausgeführt,
indem man den Mikroorganismus unter submersen Bedingungen in einem das Steroid enthaltenden
geeigneten wäßrigen Fermentatiönsmedium züchtet. Die Menge des Steroids; die nach
dem vorliegenden Verfahren mit Sauerstoff substituiert werden kann, hängt zum Teil
von dem j eweils verwendeten besonderen Medium ab.
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Wäßrige Nährmedien, die zur Züchtung Sauerstoff einführender Stämme
der Sphaeroidaceen geeignet sein sollen, müssen sowohl assimilierbaren Kohlenstoff
und Stickstoff als auch geringe Mengen anorganischer Salze enthalten. Als Quellen
für assimilierbaren Kohlenstoff können alle zu diesem Zwecke üblichen Stoffe verwendet
werden, wie Dextrose (Cerelose), Glukose, invertierte Melasse u. dgl. Ebenso sind
die üblicherweise in Fermentationsverfahren verwendeten komplexen Quellen für Stickstoff,
wie angedautes Lactalbumin (,)Edaminea) und Maismaischflüssigkeit, oder anorganische
Quellen für Stickstoff, wie sek. Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat u. dgl. auch zur
Verwendung in den Fermentationsmedien nach der Erfindung geeignet. Geringe Mengen
anderer Stoffe, wie Nicotinamid oder anorganischer Salze, wie geeigneter löslicher
Salze von Magnesium, Zink, Kalium, Natrium, Phosphor und Eisen, sind gewöhnlich
in komplexen Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff enthalten oder können in geringen
Mengen dem Fermentationsmedium zugesetzt werden, um das schnellste Wachstum des
Sauerstoff einführenden Mikroorganismus zu fördern.
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Im folgenden werden Beispiele für wäßrige Nährböden angegeben, die
in dem vorliegenden Verfahren zur Einführung von Sauerstoff in Steroide Verwendung
finden können.
| Nährboden Nr. 1 |
| Handelsübliche Dextrose (Cerelose) . . . . . . . . . . . 50,0
g |
| Handelsübliches angedautes Lactalbumin |
| (Edamine) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . 20,0 g |
| Maismaischflüssigkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . 5,0 g |
| Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein |
| Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt |
| und das p$ mit Natriumhydroxyd auf 6,5 ein- |
| gestellt. |
| Nährboden Nr. 2 |
| Invertierte Melasse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . 100,0 g |
| Handelsübliches angedautes Lactalbumin |
| (Edamine) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . 20,0 g |
| Maismaischflüssigkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . 5,0 g |
| Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein |
| Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt |
| und das pg mit Natriumhydroxyd auf 6,5 ein- |
| gestellt. |
| Nährboden Nr. 3 |
| Invertierte Melasse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . 100,0 g |
| Maismaischflüssigkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . 5;0 g |
| Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein |
| Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt |
| und das p$ mit Natriumhydroxyd auf 6,5 ein- |
| gestellt. |
| Nährboden Nr. 4 |
| Invertierte Melasse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . 100,0 g |
| Maismaischflüssigkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . 20,0 g |
| Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein |
| Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt |
| und das p" mit Natriumhydroxyd auf 6,5 ein- |
| gestellt. |
| Nährboden Nr. 5 |
| Invertierte Melasse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . 50,0 g |
| Maismaischflüssigkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . 6,3 g |
| Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein |
| Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt |
| und das pg mit Natriumhydroxyd auf 6,5 ein- |
| gestellt. |
| Nährboden Nr.6 |
| Dextrose .................................. 50,09 |
| (NH4)2HP04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . 7,5 g |
| K2HP04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 1,0 g |
| MgS04 - 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . 0,5 g |
| KCl ...................................... 0,59 |
| FeS04 - 7 11,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 0,01 g |
| ZnS04 - 7 H20 .... . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 0,01 g |
| Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein |
| Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt |
| und das p$ mit Natriumhydroxyd auf 6,5 ein- |
| gestellt. |
| Nährboden Nr. 7 |
| Invertierte cubanische Melasse . . . . . . . . . . . . . .
. 50,0 g |
| Maismaischflüssigkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . 5,0 g |
| Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein |
| Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt |
| und das p. mit Natriumhydroxyd auf 5,9 ein- |
| gestellt. |
| Nährboden Nr.8 |
| Investierte cubanische Melasse . . . . . . . . . . . . . .
. 100,0 g |
| Maismaischflüssigkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . 5,0 g |
| Destilliertes Wasser wird zur Auffüllung auf ein |
| Gesamtvolumen von 1 1 Nährmedium zugesetzt |
| und das p$ mit Natriumhydroxyd auf 5,8 ein- |
| gestellt. |
Bei manchen Fermentationsmedien ist der Zusatz von Schaumverhinderungsmitteln, wenn
auch nicht wesentlich, so doch von Vorteil. Es hat sich herausgestellt, daß im Falle
gewisser Fermentationsmedien der Zusatz eines substituierten Oxazalins, eines nichtflüchtigen,
kationischen oberflächenaktiven Amins, welches im Handel unter dem Namen »Alkaterge
Ca erhältlich ist, die Menge des Schaumes besonders stark herabsetzt; man kann jedoch
auch andere Schaumverhinderungsmittel verwenden, die sich für diesen Zweck nützlich
erwiesen haben.
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Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Ausgangsverbindungen
können unsubstituiert sein oder Keto-, Hydroxyl-, Acyloxy-, Halogenid-, Alkyl- und
ähnliche Substituenten in verschiedenen Stellungen des Cyclopentanpolyhydrophenenthrenkerns
enthalten. Außerdem können diese Verbindungen zusätzlich in der 17-Stellung eine
Ketol-Seitenkette oder eine Carbonsäure-Seitenkette enthalten. So kann man beispielsweise
nach dem vorliegenden Verfahren die folgenden 21-Desoxysteroide in der 21-Stellung
mit Sauerstoff substituieren und so die entsprechenden 21-Oxyderivate erhalten:
Progesteron, 4-Pregnen-17a-ol-3, 20-dion, 4-Pregnan-17a-ol-3, 20-dion, 4-Pregnen-3p-ol-20-on,
5, 6-Dichlorpregnan-3ß-ol-20-on, 5, 6-Dichlorpregnan-3, 20-dion, 5, 6-Dichlorpregnan-17
a-ol-3, 20-dion, 4-Pregnen-11 a,17adiol-3, 20-dion, 4-Pregnen-11 a-ol-3,20-dion,
4-Pregnen-17a-ol-3, 11,10-trion, 4-Pregnen-11, 17a-diol-3, 20-dion, Pregnan - 3,
11, 20-trion oder Pregnan -17a - o1 - 3, 11, 20-trion u. dgl.
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Ein 21-Desoxypregnen kann beispielsweise nach dem folgenden Verfahren
mit Sauerstoff substituiert werden: Ein steriles Kulturmedium, z. B. eines der oben
angegebenen, wird zunächst durch Einführung einer kleinen Menge einer Sporensuspension
oder einer vegetativen Zucht eines Sauerstoff einführenden Stammes der Wojnowicia
beimpft. Das beimpfte Nährmedium wird dann bei der Temperatur von etwa 20 bis 45°
bebrütet, wobei es für die Dauer von einigen Stunden bis zu mehreren Tagen in Gegenwart
von Sauerstoff in Bewegung gehalten wird. Dann gibt man eine Lösung eines 21-Desoxypregnens
in einem Lösungsmittel, wie Propylenglykol, zu dem Fermentationsmedium zu und setzt
die Bewegung und Belüftung des Nährmediums etwa 5 bis 30 Stunden, oder bis die Reaktion
der Sauerstoff-: Substitution vollständig ist, fort.
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Wenn die Einführung des Sauerstoffes beendet ist, kann das durch Sauerstoff
substituierte Steroid aus der Fermentationsbrühe durch Extraktion mit einem geeigneten,
mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel für das durch Sauerstoff substituierte
Steroid gewonnen werden. Zu diesem Zweck geeignete Lösungs-' mittel sind z. B. Chloroform,
Methylenchlorid, 2-Methyl-5-äthylpyridin, Ester organischer Säuren, aromatische
Kohlenwasserstoffe, Ketone oder Amide. Die Lösung, des durch Sauerstoff substituierten
Steroids kann dann eingedampft werden, wobei man das gewünschte Produkt erhält,
welches durch Umkristallisieren oder andere übliche Verfahren gereinigt werden kann.
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Wahlweise kann das erfindungsgemäße Verfahren auch so ausgeführt werden,
daß man das Sauerstoff einführende Enzym, welches durch Fermentation von Wojnowicia
erzeugt wurde, mit dem durch Sauerstoff zu substituierenden Steroid in Berührung
bringt. Dies kann erfolgen, indem man die Sauerstoff einführenden Enzyme aus der
Fermentationsbrühe nach an sich bekannten Verfahren gewinnt und sie mit dem Steroid
in einem wäßrigen Medium in innige Berührung bringt.
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Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Erfindung.
Beispiel 1 Etwa 50 ccm des Nährbodens Nr. 1 wurden 20 Minuten bei 120° in einem
250-ccm-Kolben sterilisiert. Dann wurde das Medium mit etwa 5 ccm eines vegetativen
Wachstums einer Kultur von Hendersonia acicola beimpft. Die Mischung wurde auf einer
rotierenden Schüttelmaschine mit einer Geschwindigkeit von 220 Umdrehungen/Min.
etwa 72 Stunden in Bewegung gehalten, wobei die Temperatur auf 23° gehalten wurde.
Am Ende dieser Zeitdauer wurde eine sterile Lösung von etwa 10 mg 4-Pregnen-11 ß-ol-3,
20-dion in i/2 ccm Dimethylformamid zu dem Fermentationsmedium zugesetzt und die
Belüftung und Bewegung mit der gleichen Geschwindigkeit noch 48 Stunden fortgesetzt.
Das fermentierte Medium wurde dann sterilisiert und die Brühe filtriert und mit
Äthylacetat extrahiert. Der konzentrierte Extrakt wurde auf Papier chromatographiert
und mit einem Chloroform-Formamid-System nach dem Verfahren von Z a f f a r o n
i mit Mitarbeitern (Science, Bd. 11I, [1950], S. 6) entwickelt. Es wurde ein Fleck
erhalten, der die gleiche Beweglichkeit besaß wie ein Muster von reinem 4-Pregnen-11
ß, 21-diol-3, 20-dion. Beispiel 2 Das Verfahren nach Beispiel 1 wurde mit der Ausnahme
wiederholt, daß etwa 5 ccm eines vegetativen Wachstums einer Kultur von Hendersonia
herpotricha verwendet und 10 mg 4-Pregnen-11 ß, 17 a-diol-3, 20-dion an Stelle des
4-Pregnen-11 ß-ol-3, 20-dions zugesetzt wurden. Nach 72stündiger Fermentation wurde
das Produkt in ähnlicher Weise isoliert und ergab einen chromatographischen Fleck
in der Gegend von 4-Pregnen-L1 ß, 17 a, 21-triol-3, 20-dion.
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Beispiel 3 Es wurde ähnlich wie nach Beispiel 1 unter Verwendung eines
vegetativen Wachtums einer Kultur von Hendersonia phragmitis gearbeitet, wobei 10
mg 4-Pregnen-17 a-ol-3, 20-dion, gelöst in 2,5 ccm Propylenglykol, an Stelle des
in Dimethylformamid gelösten 4-Pregnen-
11 ß-ol-3, 20-dions zugesetzt
wurden. Das nach 48stündiger Bebrütung gebildete Produkt gab einen chromatographischen
Fleck in der Gegend von 4-Pregnen-11ß, 21-diol-3, 20-dion.
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Beispiel 4 Es wurde ähnlich wie nach Beispiel 1 unter Verwendung eines
vegetativen Wachstums einer Kultur von Hendersonia rubi gearbeitet, wobei 10 mg
4-Pregnen-3, 20-dion, gelöst in 2,5 ccm Propylenglykol, an Stelle des 4-Pregnen-11
ß-ol-3, 20-dions zugesetzt wurden.. Das nach 48stündiger Bebrütung gebildete Produkt
gab einen chromatographischen Fleck in der Gegend von 4-Pregnen-21-ol-3, 20-dion.
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Beispiel 5 Es wurde ähnlich wie nach Beispiel 1 unter Verwendung eines
vegetativen Wachstums einer Kultur von Hendersonia aberrans gearbeitet, wobei 10
mg 4-Pregnen-11 a-ol-3, 20-dion, gelöst in 2,5 ccm Propylenglykol, an Stelle des
4-Pregnen-11 ß-ol-3, 20-dions zugesetzt wurden. Das von der Brühe nach 48 Stunden
abgeschiedene Produkt ergab einen chromatographischen Fleck in der Gegend von 4-Pregnen-11
a, 21-diol-3, 20-dion.
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Beispiel 6 Etwa 50 ccm des Nährbodens Nr. 1 wurden 20 Minuten bei
120° in einem 250-ccm-Kolben sterilisiert. Dann wurde das Medium mit etwa 3 ccm
eines vegetativen Wachstums einer Kultur von Wojnowicia graminis beimpft. Die Mischung
wurde etwa 72 Stunden mit Hilfe einer rotierenden Schüttelmaschine mit einer Geschwindigkeit
von 220 Umdr./Min. in Bewegung gehalten, wobei die Temperatur auf 28° gehalten wurde.
Am Ende der 72 Stunden wurde eine sterile Lösung von etwa 10 mg 4-Pregnen-3, 20-dion
in 2,5 ccm Propylenglykol zu dem Fermentationsmedium zugesetzt und die Belüftung
und Bewegung mit der gleichen Geschwindigkeit noch etwa 24 Stunden fortgesetzt.
Nach Beendigung der Oxydationsstufe wurde das steroidhaltige fermentierte Medium
sterilisiert und der Ansatz filtriert und mit Äthylacetat extrahiert. Der konzentrierte
Extrakt wurde auf Papier chromatographiert und in dem Chloroform-Formamid-System
nach der Methode von Zaffaroni und Mitarbeitern (Science, Bd. 111, [1950], S. 6),
entwickelt. Der hierbei erhaltene Fleck besaß die Beweglichkeit einer Probe von
reinem 4-Pregnen-21-ol-3, 20-dion. Beispiel 7 Es wurde ähnlich wie nach Beispiel
6 gearbeitet mit der Ausnahme, daß an Stelle der 10 mg 4-Pregnen-3, 20-dion 4 mg
4-Pregnen-11 a-ol-3, 20-dion zugesetzt wurden und die Fermentation 48 Stunden statt
24 Stunden fortgesetzt wurde. Das Produkt ergab einen chromatographischen Fleck
in der Gegend von 4-Pregnen-11 a, 21-diol-3, 20-dion.
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Beispiel 8 Es wurde ähnlich wie nach Beispiel 6 mit zwei verschiedenen
Proben von je 10 mg 4-Pregnen-3,20-dion gearbeitet. Die beiden Proben wurden 48
bzw. 72 Stunden fermentiert. Sie wurden aus dem fermentierten Medium mit Äthylacetat
extrahiert, und der Extrakt wurde auf Papier mit Hilfe eines Systems von Ligroin
und Propylenglykol chromatographiert. Dieses Verfahren ergab Flecke auf dem Papierchromatogramm,
aus denen auf ein Produkt geschlossen werden konnte, das die Beweglichkeit von 4-Pregnen-21-ol
3, 20-dion besaß, Tetrazolium reduzierte (ein Anzeichen für ein 20-Keto-21-oxysteroid)
und einen Jod-Jodkalitest ähnlich demjenigen gab, den man mit Desoxycorticosteron
erhält. Das aus dem Papierchromatogramm eluierte Material gab in konzentrierter
Schwefelsäure ein UV-Spektrum ähnlich demjenigen des 4-Pregnen-21-ol-3, 20-dions.
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Beispiel 9 Vier Proben von je etwa 50 ccm des Nährbodens Nr. 7 wurden
20 Minuten bei 120° sterilisiert. Jedes der Medien wurde dann mit etwa 5 ccm eines
vegetativen Wachstums der Kultur Wojnowicia graminis beimpft. Die Proben wurden
auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei einer Geschwindigkeit von 220 Umdr./Min.
72 Stunden in Bewegung gehalten, wobei die Temperatur auf 28° gehalten wurde. Zu
jeder der vier Proben wurde eine sterile Lösung von 10 mg 4-Pregnen-3, 20-dion in
2,5 ccm Propylenglykol zugesetzt. Die Bewegung und Belüftung der vier Proben wurde
24, 48, 60 bzw. 72 Stunden fortgesetzt. Dann wurden die Proben im Autoklav erhitzt
und die Zellen von den Brühen abgetrennt. Jede Brühe wurde dreimal mit je 25 ccm
Chloroform extrahiert. Die Zellen einer jeden Probe wurden getrennt zweimal mit
je 25 ccm Aceton gewaschen, und jeder Anteil Aceton wurde zu dem entsprechenden
Anteil Chloroform zugesetzt. Die Extrakte der Proben wurden dann bei Zimmertemperatur
getrocknet, mit Methanol extrahiert und auf Wattman-Filterpapier Nr. 1 chromatographiert.
Bei der Entwicklung der Chromatogramme wurde zur Sättigung des Papiers Propylenglykol-Methanol
und als bewegliche Phase Hexankohlenwasserstoffe (»Skelly D«) verwendet. Das nicht
umgesetzte 4-Pregnen-3, 20-dion und die Umwandlungsprodukte wurden mit einem Ultraviolettstrahler
festgestellt und die Produkte mit Methanol eluiert, worauf ihre optische Dichte
bei 2400 bestimmt wurde, Die Ergebnisse zeigen, daß 4-Pregnen-3, 20-dion in 4-Pregnen-21-ol
3, 20-dion umgewandelt wurde. Beispiel 10 Vier Proben von je etwa 50 ccm des Nährbodens
Nr. 8 wurden 20 Minuten bei 120° sterilisiert. Dann wurde jeder Nährboden mit etwa
5 ccm eines vegetativen Wachstums der Kultur Wojnowicia graminis beimpft. Die Proben
wurden auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei einer Geschwindigkeit von 220
Umdr./Min. unter Einhaltung einer Temperatur von 28° 72 Stunden in Bewegung gehalten.
Dann wurde zu jeder der vier Proben je eine sterile Lösung von 10 mg 4-Pregnen-3,
20-dion in 2,5 ccm Propylenglykol zugesetzt. Die Bewegung und Belüftung der vier
Proben wurde danach noch 24, 48, 60 und 72 Stunden fortgesetzt. Dann wurden die
Proben im Autoklav erhitzt und die Zellen von den Brühen abgetrennt. Jede der Brühen
wurde dreimal mit je 25 ccm Chloroform extrahiert. Die Zellen einer jeden Probe
wurden besonders je zweimal mit Portionen von 25 ccm Aceton gewaschen, welches dann
zu den entsprechenden Anteilen Chloroform zugesetzt wurde. Die Extrakte der Proben
wurden dann bei Zimmertemperatur getrocknet, mit Methanol extrahiert und auf Wattman-Filterpapier
Nr. 1 chromatographiert. Die Chromatogramme wurden unter Verwendung von Propylenglykol-Methanol
zur Sättigung des Papiers und von »Skelly D« als bewegliche Phase entwickelt. Das
nicht umgesetzte 4-Pregnen-3, 20-dion und die Umwandlungsprodukte wurden mit einem
Ultraviolettstrahler festgestellt, die Produkte mit Methanol eluiert und die optische
Dichte bei 2400 Ä. bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, daß das 4-Pregnen-3, 20-dion
in 4-Pregnen-21-ol-3, 20-dion umgewandelt wurde.
Beispiel 11 59
Muster von j e etwa 50 ccm eines Kulturbodens von der Zusammensetzung des Nährbodens
Nr. 7, jedoch von einem pH von 7,5, wurden 30 Minuten bei 120° sterilisiert. Jedes
der Medien wurde dann mit etwa 5 ccm eines vegetativen Wachstums der Kultur Wojnowicia
graminis beimpft. Die beimpften Kolben wurden dann auf einer rotierenden Schüttelmaschine
bei einer Geschwindigkeit von 220 Umdr./Min. bei einer Temperatur von 27 bis 28°
etwa 96 Stunden in Bewegung gehalten. Dann wurde zu jedem der die Nährmedien enthaltenden
Kolben eine sterile Lösung von 10 mg 4-Pregnen-3, 20-dion in 2, 5 ccm Propylenglykol
zugesetzt und die Bewegung der Kolben noch 48 Stunden fortgesetzt. Dann wurde die
Brühe aus allen Kolben zusammengegossen und mit Äthylacetat extrahiert. Der Extraktrückstand
wurde zwischen Petroläther und 70°/jgem wäßrigem Äthanol verteilt. Die wäßrigeÄthanolfraktion
wurde mit Petroläther gewaschen, im Vakuum konzentriert und mit Chloroform extrahiert.
Der Extraktrückstand wurde in Benzol gelöst und in einer mit Kieselsäuregel (»Silicagela)
gefüllten Kolonne chromatographiert. Die Kolonne wurde mit Benzol (Fraktionen 1
bis 5), 5°/oigem Äthylacetat in Benzol (Fraktionen 6 bis 10), 25°/oigem Äthylacetat
in Benzol (Fraktionen 11 bis 16), Äthylacetat (Fraktionen 17 bis 23), 50°/oigem
Aceton in Benzol (Fraktionen 24 und 25) und schließlich mit Aceton eluiert. Papierchromatogramme
der eluierten Fraktionen in einem Ligroin-Propylenglykol-System zeigten, daß die
Fraktionen 17, 18 und 19 4-Pregnen-21-ol-3, 20-dion und einen stärker polaren Bestandteil
enthielten. Fraktion 17 wurde weiter durch Papierchromatographie gereinigt. Das
Material mit der richtigen Beweglichkeit wurde mittels Methanol eluiert. Der Rückstand
von dem Methanol wurde in Chloroform gelöst, mit Wasser angefeuchtet und zur Trockne
gedampft. Durch Umkristallisieren des Produktes aus Äthylacetat-Petroläther wurde
reines 4-Pregnen-21-ol-3, 20-dion mit einem Schmelzpunkt von 138 bis 141' erhalten,
welches mit einer authentischen Probe identisch war.