DE1300560B - Verfahren zur Spaltung von racemischen Steroiden - Google Patents

Description

Pie vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Spaltung racemischer Steroide.

In der deutschen Patentschrift 1030 828 wird ein Verfahren zur fermentativen Trennung von dl-17a-Oestradiol durch Streptomyces albus zu d-Oestron und l-17a-Oestradiol beschrieben. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß dl-17/S-Oestradiole und deren Derivate (wie nachstehend definiert) fermentativ mit guten Ausbeuten in d-Oestron und 1-Oestradiol getrennt werden können. In der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck »natürliche Konfiguration«, daß das Molekül die gleiche absolute Konfiguration wie die analogen, in der Natur vorkommenden Steroide hat und einen Strahl polarisierten Lichts in der gleichen Richtung dreht wie die natürlich vorkommenden Steroide, bestimmt nach herkömmlichen Untersuchungsverfahren.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist nun dadurch gekennzeichnet, daß man nach an sich bekannten Methoden ein racemisches Gemisch eines 3,17//-Dihydroxy-13/? - niedrig - alkyl - gona -1,3,5(10) - triens, seiner 17-niedrig-Acylate bzw. von deren 3-Äthern der allgemeinen Formel

R²O

worin R¹ einen niederen Alkylrest, R² Wasserstoff, einen niederen Alkylrest, einen Aryl-, niederen Alkenyl-, niederen Alkinyl- oder Cycloalkylrest, R³ Wasserstoff oder einen niederen Acylrest bedeutet, mit einer Kultur eines Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium bebrütet, die Gärungsprodukte abtrennt, sodann gegebenenfalls das erhaltene d -17 - Keto -13/9 - niedrig - alkyl - gona -1,3, 5(10)-trien-3-ol in 3-Stellung veräthert, den erhaltenen d-17-Keto-13jS-niedrig-alkyl-gona-l,3,5(10)-trien-3-ol-3-äther der Birch-Reduktion unterwirft, das Produkt der Birch-Reduktion durch Hydrolyse der Äthergruppe und Umlagerung in das entsprechende d -17 - Hydroxy -13ß - niedrig - alkyl - gon - 4 -en -3 - on überführt, welches, sofern gewünscht, zu dem entsprechenden d-17-Keto-13^-niedrig-alkyl-gon-4-en-3-on oxydiert wird.

Die Ausgangsstoffe des erfindungsgemäßen Verfahrens haben die allgemeine Formel (I) und werden erfindungsgemäß in die entsprechenden Verbindungen der allgemeinen Formel (II) umgewandelt

R²O

mikrobiologische_;
Oxydation

R²O

in welchen R¹ einen niederen Alkylrest, R² Wasserstoff, einen niederen Alkylrest, eine*n Aryl-, niederen Alkenyl-, niederen Alkinyl- oder Cycloalkylrest, R³ Wasserstoff oder einen niederen Acylrest bedeutet. Die vorgenannten, niederen Acylreste schließen die Acylreste von niedermolekularen Monocarbonsäuren,

welche weniger als 10 Kohlenstoffatome haben, ein; sie können gerade, verzweigt oder cyclisch sein.

Als Ausgangsverbindungen für das erfindungsgemäße Verfahren dienen vorzugsweise die entsprechenden 17ß-Hydroxyverbindungen. Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) werden nach dem Verfahren hergestellt, das in den bekanntgemachten Unterlagen der belgischen Patente 608 370 und 608 369 beschrieben ist. Zum Beispiel kann 13//-Äthyl-17/J-hydroxy-3-methoxygona-l,3,5(10)-trien durch Reduktion in Gegenwart eines Alkalimetalls in flüssigem Ammoniak aus dem entsprechenden Gona-l,3,5(10),8-tetraen hergestellt werden. Für ihre Herstellung wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung Schutz nicht begehrt.

Das Produkt (II) hat d-Konfiguration, also die gleiche Konfiguration, wie sie bei den natürlich auftretenden Steroiden gefunden wird. Unter einem racemischen Steroid ist nicht allein ein Gemisch gleicher Mengen von Enantiomeren zu verstehen, so daß das Gemisch keine optischen Drehungseigenschaften hat, sondern ebenso solche Gemische, welche einen Überschuß des einen oder anderen der Enantiomeren enthalten.

Geeignete Spezies der Corynebacteriumgattung sind C. simplex (Arthrobacter simplex ATCC 6946), C. hoagii und C. equi.

Der gewünschte Wuchs der ausgewählten Mikro-Organismen der Corynebacteriumgattung, wie er bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, wird durchgeführt durch ein geeignetes Nährmedium, welches Kohlehydrate, organischen Stickstoff und anorganische Salze, nach der dem Fachmann bekannten Art, enthält. Das racemische Steroidausgangsmaterial wird dann gelöst oder suspendiert in einem Lösungsmittel, wie Äthanol, Aceton oder in irgendeinem anderen wassermischbaren Lösungsmittel, welches nicht toxisch gegenüber den Organismen ist, und der Mikroorganismenkultur in einem Nährboden-(Fleischbrühe-)Medium unter sterilen Bedingungen zugegeben. Diese Kultur wird dann geschüttelt, belüftet oder gleichzeitig belüftet und gerührt, um das Wachstum der Mikroorganismen und die biochemische Umwandlung des Steroidsubstrats zu vergrößern. Das Steroid kann dem Kulturmedium nachfolgend durch Einimpfen mit dem Bacterium zugegeben werden. In bestimmten Fällen, abhängig

von den Bedingungen des Reaktionsmediums, kann es wünschenswerter sein, das optimale Wachstum der Mikroorganismen vor der Zugabe des Steroids zu erhalten.

Zur Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann man die Kultivierung ausgewählter Mikroorganismen in einem geeigneten Nährmedium unter aeroben Bedingungen durchführen. Ein geeignetes Volumen der Zellsuspension wird dann in das Nährmedium der gleichen oder veränderten Zubereitung für die Unterstützung des Wachstums der Mikroorganismen eingeimpft. Das verwendete Nährmedium kann ein Hefeextraktdextrosemedium, Caseinhydrolysat, Maisquellwasser, Wasserextrakt von Sojabohnenmehl oder Lactalbuminhydrolysat, zusammen mit einer geeigneten Kohlenstoffquelle, sein.

Die Zugabe anorganischer Salze kann wünschenswert sein, um eine pH-Höhe im Reaktionsmedium von zwischen 6,8 und 7,2 zu halten. Wenn die Verwendung anorganischer Salze zum Puffern des Reaktionsgemisches ausgelassen wird, kann ein pH-Anstieg von einem Anfangswert von 6,8 auf etwa 7,7 bis 8 festgestellt werden. Die optimale Temperatur für das Wachstum der ausgewählten Mikroorganismen ist 28⁰C, jedoch kann die Temperatur zwischen 25 und 37 ⁰C und sogar zwischen 20 und 40⁰C wechseln, ohne eine nachteilige Wirkung auf die Mikroorganismen auszuüben, sofern die höhere Temperatur nicht über längere Zeitdauer beibehalten wird. Die Reaktionszeit kann von 3 Stunden bis 120 Stunden wechseln und wird von dem zu behandelnden Steroid abhängig sein. Irgendein wassermischbares (gegenüber den Organismen) nicht toxisches Lösungsmittel kann verwendet werden, um das Steroid zu lösen oder zu suspendieren. Bevorzugte Lösungsmittel sind Äthanol und Aceton, wobei jedes derselben in Mengen verwendet werden kann, daß die Endkonzentration dieser Lösungsmittel im Reaktionsgemisch nicht höher als etwa 7% ist und auch ebenso die Menge von nur Spuren betragen kann; infolge der Verdampfung kann die Endkonzentration des organischen Lösungsmittels im wesentlichen 0 sein.

Die Aufbereitung des gewünschten Produkts wird durchgeführt durch Extraktion mit einem geeigneten, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel und nachfolgendem Filtrieren, Adsorption oder anderen vom Fachmann herkömmlich verwendeten Verfahren der Steroidaufbereitung, einschließlich Chromatographie, fraktionelles Kristallisieren, Aufteilung im Gegenstrom u. ä. Wird die Extraktion zur Aufbereitung des Steroidprodukts verwendet, können chlorierte niedere Kohlenwasserstoffe, Ketone oder Alkohole verwendet werden. Eingeschlossen in diese Lösungsmittel können sein Chloroform, Methylenchlorid, Trichloräthan, Äthylendichlorid, Butanol, Diäthylketon, Methylisobutylketon u.a. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird die der Aufbereitung des gewünschten Steroids folgende Umwandlung durch das Extraktionsverfahren vorgezogen.

Wie bereits erwähnt wurde, erzeugen die erhaltenen 17-Ketosteroide eine starke positive Drehung, und das macht diese Produkte in besonderer Weise für die Verwendung bei der Synthese und Wiedergewinnung aufbereiteter Steroide geeignet, welche biologische Wirksamkeit anerkannter und bekannter Brauchbarkeit haben. Gegebenenfalls können die Verbindungen, die in den Bereich der obigen Formel (II) fallen, worin R²O eine Äthergruppe ist (welche natürlich unter Birch-Reduktionsbedingungen stabil sein sollte), der Birch-Reduktion, z. B. mit einem Alkalimetall und flüssigem Ammoniak, unterworfen werden und dann, wenn gewünscht, der Hydrolyse der Äthergruppe bei gleichzeitiger Umlagerung der 5(10)-ständigen Doppelbindung zur Gewinnung von entsprechenden ,I⁴-3-Ketonen (III) unterworfen werden. Verbindungen der allgemeinen Formel (IV) können dann aus (III) durch Oxydation der 17-Hydroxylgruppe hergestellt werden. Beide Arten von Verbindungen sind wegen ihrer Steroidhormoneigenschaften brauchbar, z. B. als androgene

ι s Hormone.

OH

R¹

In den vorstehenden Formeln (III) und (IV) hat R¹ die bereits in den obigen Formeln (I) und (II) genannte Bedeutung.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.

Beispiel 1

1 ml einer 5-ml-Suspension von Zellen von Corynebacterium simplex (Arthrobacter simplex ATCC 6946), die durch Abwaschen des Oberflächen-Wachstums einer Agarschrägfläche erhalten wurden, wird in einen 250-ml-Kolben eingebracht, welcher 50 ml des nachfolgenden Mediums enthielt: Hefeextrakt 1%, Dextrose 1% und destilliertes Wasser 100 ml.

Der Kolben wurde mit einem hin- und herlaufenden Schüttler 24 Stunden bei 28⁰C bebrütet, wonach eine 10%ige übertragung in einen Kolben des gleichen Mediums vorgenommen wurde. Dieser Kolben wurde wie oben 22,5 Stunden geschüttelt und dann mit einer Lösung von dl-13/?-Äthyl-3-methoxygona-l,3,5(10)-trien-17£-ol (7,5mg in 0,5ml Äthanol) beschickt. Nach einer Inkubation von 45 Stunden wird eine Probe von 5 ml entnommen und mit 1 ml Methylisobutylketon ins Gleichgewicht gebracht. Der Extrakt wird auf Whatman-Papier Nr. 1 getupft und das Papierchromatogramm in dem Heptan-Formamid-Lösungsmittelsystem entwickelt.
Das getrocknete Papierchromatogramm wird mit einem Gemisch gleicher Teile von l°/o FeCk- und 1% K3[Fe(CN)6]-Lösungen besprüht. Ein gegenüber Turnbulls blau positives und gegenüber dem Substrat geringer polares Produkt erscheint. Diese Zone

hat die Beweglichkeit von dl-13|i-Äihyl-3-methoxygona-l,3,5(10)-trien-17-on. Eine Zunahme im Produkt wird nach 70stündiger Bebrütung beobachtet.

Beispiel 2

Man kann auch folgendermaßen arbeiten: Das Oberflächeßwachstum von Corynebacterium simplex ATCC 6946 auf sechs Agarschrägflächen wird mit 5 ml destilliertem Wasser pro Schrägfläche abgewaschen. Die Hälfte des Volumens von jeder Suspension wird zu jedem von zwölf Kolben Hefeextrakt-Dextrose-Medium von Beispiel 1 (200 ml je Kolben) zugegeben. Die Kolben werden auf einem hin- und herlaufenden Schüttler bei 28°C bebrütet. Nach 24stündigem Wachstum wurde eine lO°/oige Übertragung auf 1- und 2-I-Kolben, welche 200 bzw. 400 ml des obigen Mediums enthielten, vorgenommen. Die Kolben wurden wie oben 24 Stunden geschüttelt, bevor die Zugabe von 4,28 g dl-13|8-Äthyl-3-methoxygona-l,3,5(lG)«trien47/?-ol (40 mg/ml) in Äthanol, zur Gewinnung einer Konzentration von 0,2 g je Kolben, erfolgte. Die Kolbert wurden dann in einen Umlaufschüttler bei 26 und 28 ⁰C gebracht. Der Ablauf der Umwandlung zu dem oxydierten Produkt wurde täglich durch Papierchromatographie verfolgt. Nach 120 Stunden Kontaktzeit wurde die Nährlösung durch'Extraktion abgeerntet.

Die aus der Fermentation von 4,18 g dl-13/S-Äthyl-3-methoxygona-1,3,5(10)-trien-17/J-ol erhaltene Emtenährlösung wird mehrmals mit Äthylacetat extrahiert, die Äthylacetatextrakte werden zusammengegeben und im Vakuum eingeengt. Das Konzentrat wird filtriert und das feste Produkt (1,20 g) zeigte, analysiert durch Dünnschichtchromatographie, daß es ein Gemisch des gewünschten 17-Ketons mit unverändertem Substrat war. Das Gemisch wird über 120 g Kieselerde-Gel chromatogjraphiert und mit Benzol eluiert, wodurch das gereinigte 17-Keton erhalten würde. Das mehrmalige Umkristallisieren des Produktes aus Aceton—Hexan ergabd-13/S-Äthyl-3-methoxygona-l,3,5(10)-trien-17-on; Schmelzpunkt 147bisl49°C;|>]₀ + 110,9°; Am«* 278 ηΐμ (2,100), 286 ΐημ (1,990).

Analyse fur

Berechnet..
gefunden ..

C 80,49, H 8,78;
C 80,68, H 8,67.

B ε i s ρ i e 1 3

Das Produkt von Beispiel 2, nämlich d-13/?-Äthyl-3-methoxygona-l,3,5(10)-trien-17-on, wird durch Reduktion mit Lithium und Ammoniak sowie nachfolgende Säurehydrolyse in d-lS/S-Äthyl-n^-hydroxygon-4-en-3-on übergeführt; Schmelzpunkt 156 bis 157°C; [a]_D + 52,4°.

Analyse für C19H28O2:

Berechnet..'. C 79,12, H 9,79;
gefunden ... C 78,82, H 9,61.

Beispiel4

Zwei Agarschrägen mit Oberflächenwachstum von Corynebacterium hoagii ATCC 7005 werden mit jeweils 5 ml destilliertem Wasser abgewaschen. Die erhaltenen Suspensionen werden dazu verwendet, um zwei ί-1-Kolben, welche O,l°/o Hefeextraktlösung enthalten, zu impfen. Die Bebrütung der Kolben wurde durch hin- und herlaufende Schüttler bei 28 ^T C durchgeführt. Nach 24stündigem Schütteln wurde eine 10%ige Übertragung auf fünf 2-1-Kolben und zwei 1-1-Kolben mit 400 bzw. 200 ml einer 0,l%igen Hefeextraktlösung vorgenommen. Die Bebrütung wurde wie oben 23 Stunden fortgesetzt, bevor die Zugabe von 475 mg dl-Oestradiol-methyl-äther als Lösung von 20 mg/ml Äthanol, zur Gewinnung einer Konzentration von 0,2 g/l, erfolgte. Die Kolben wurden 72 Stunden vor der Aberntung geschüttelt.

Die Nährlösung, in welcher 459 mg dl-OestradioI-methyl-äther fermentiert wurden, wird sechsmal mit 300 ml CHCl₃ extrahiert, und die CHCla-Extrakte werden zusammengegeben. Die organischen Extrakte werden mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet und verdampft. Der Rückstand (0,40 g) in Benzol—Hexan (1 : 4) (10 ml) wird über neutralem, desaktiviertem Aluminiumoxyd, bekannt unter dem Handelsnamen Woelm Aktivität III, (14 g) chromatographiert. Das Eluieren mit Benzol—Hexan (1:4) (220 ml) und Umkristallisieren des Produkts aus Methanol ergab d-Oestron-methyl-äther (0,14 g); Schmelzpunkt 158 bis 169'⁵C; [a]*f + 138,1° (1% in CHCl₃). Weiteres Eluieren mit Benzol—Hexan (3 : 7) (100 ml), Benzol—Hexan (1 : 1) (60 ml) und Benzol (100* ml) liefert dann 1 - Oestradiol - methyl - äther (0,145 g). Umkristallisieren aus Äther—Hexan ergibt 0,13 g; Schmelzpunkt 99 bis 107'"C; [α]«/ - 71,1 (1% in CHCl₃).

Beispiel5

Zwei Agarschrägflächen mit Oberflächenwachstum von Corynebacterium simplex ATCC 6946 wurden mit jeweils 5 ml destilliertem Wasser abgewaschen. Die Hälfte des Volumens jeder Suspension wird zu jedem von vier 500-ml-Erlenmeyer-Kolben zugegeben, welcher jeder 100 ml einer 0,l°/oigen Hefeextraktlösung enthielt. Die Kolben wurden in einem hin- und herlaufenden Schüttler bei 28 C bebrütet. Nach 24stündigem Wachstum wurden 10%ige Übertragungen zu jedem von sechs 2-1-Kolben mit jeweils 400 ml 0,l%iger Hefeextraktlösung vorgenommen. Die Kolben wurden 18,5 Stunden, wie oben, geschüttelt. Dann wurden zu jedem Kolben 80 mg dl-Oestradiolmethyl-äther [dl-3-Methoxyoestra-I,3,5(10)-trien-17/i-ol] in Äthanol (20 mg/ml) zur Gewinnung einer Konzentration von 0.2 g/1 zugegeben. Die Kolben wurden auf einem Umlaufschüttler bei 250 Umdrehungen pro Minute 54 Stunden bei 28 C bebrütet.

Die Aberntenährlösung, in welcher 468 mg dl-3-Methoxyoestra-l,3,5(10)-trien-17^-oi fermentiert worden waren, wird sechsmal mit je 300 ml CHCIi extrahiert. Die kombinierten Chloroformextrakte werden mit 250 ml destilliertem Wasser gewaschen.

wonach sie mit Salzlösung (250 ml) gewaschen, über Natriumsulfat' getrocknet und verdampft wurden. Der Rückstand (0.472 g) wird in Benzol (2 ml) gelöst, mit Hexan (2 ml) verdünnt und an neutralem desaktiviertem Aluminiumoxyd (Woelm, Aktivitat III) adsorbiert (17 g). Das Eluieren mit Benzol-Hexan (1 : 4) (125 ml) und Benzol—Hexan (3 : 7) (100 ml) ergibt einen Feststoff (0,147 g), der nach Umkristallisieren aus Methanol d-Oestron-methyläther (0,126 g) ergab; Schmelzpunkt 169 bis 170 C;

[«]& + 159,4 (I⁰O in CHCl₃).

Weiteres Eluieren mit Benzol—Hexan (1:1) (75 ml) und Benzol (50 ml) erbrachte rohen Oestradiol-methyl-äther (0.198 g). Eine Probe, umkristalli-

siert aus Äther—Hexan, hatte einen Schmelzpunkt von 135 bis 136°C; [α] V -8,3° (1% in CHCl₃).

B e i s ρ i e 1 6

Nach dem Verfahren von Beispiel 2 wird das racemische 13/3-Äthylgona-l,3,5(10)-trien-3,17/i-diol mit Corynebacterium simplex, zur Gewinnung von d-13/J-Äthyl-3-hydroxygona-l,3,5(10)-trien-17-on, be- ίο handelt; Schmelzpunkt 252 bis 253°C; [α], +108,5°.

Analyse für

Berechnet ..
gefunden ..

C 80,24, H 8,59;
C 79,95, H 8,33.

Claims (2)

Patentansprüche: 20

1. Verfahren zur Spaltung von racemischen Steroiden durch Bebrütung mit einer Kultur eines oxydierend wirkenden Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß man nach an sich bekannten Methoden ein racemisches Gemisch eines 3,17/3-Dihydroxy-l 3/3-niedrig-alkyl-gona-l ,3,5( 10)-triens, seiner 17-niedrig-Acylate bzw. von deren 3-Äthern der allgemeinen Formel

R²O

worin R¹ einen niederen Alkylrest, R² Wasserstoff, einen niederen Alkylrest, einen Aryl-, niederen Alkenyl-, niederen Alkinyl- oder Cycloalkylrest, R³ Wasserstoff oder einen niederen Acylrest bedeutet, mit einer Kultur eines Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium bebrütet, die Gärungsprodukte abtrennt, sodann gegebenenfalls das erhaltene d-17-Keto-13ß-niedrig-alkyl-gona-l,3,5(10)-trien-3-ol in 3-Stellung veräthert, den erhaltenen d-17-Keto-13/S-niedrigalkyl-gona-l,3,5(10)-trien-3-ol-3-äther der Birch-Reduktion unterwirft, das Produkt der Birch-Reduktion durch Hydrolyse der Äthergruppe und Umlagerung in das entsprechende d-17-Hydroxy-13/?-niedrig-alkyl-gon-4-en-3-on überführt, welches, sofern gewünscht, zu dem entsprechenden d-17-Keto-13ß-niedrig-alkyl-gon-4-en-3-on oxydiert wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das racemische Steroidausgangsmaterial in einem nicht toxischen Lösungsmittel gelöst oder suspendiert wird.

909 532/369