DE1618582C3 - Verfahren zur Herstellung von 17-Ketosteroiden der Androstanreihe aus den entsprechenden Steroiden mit einer Seitenkette in 17-Stellung durch mikrobiologischen' Abbau - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von 17-Ketosteroiden der Androstanreihe aus den entsprechenden Steroiden mit einer Seitenkette in 17-Stellung durch mikrobiologischen' AbbauInfo
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Description
Zur Herstellung von Steroidhormonen werden natürlich vorkommende Steroide als Ausgangsmaterial
verwendet. Es fehlte jedoch an einem Verfahren, Steroide, die in 17-Stellung eine aliphatische Seitenkette
mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen enthalten, in einfacher Weise in 17-Ketosteroide umzuwandeln,
die als Ausgangsverbindungen für die Herstellung von anderen Steroiden mit androgener, östrogener, anabolischer
und konzeptionsverhindernder Wirkung dienen können.
Es war bekannt, daß Mikroorganismen der Gattung Mycobacterium in der Lage sind, Steroide mit einer
aliphatischen Seitenkette mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in 17-Stellung, wie Cholesterin, vollständig
abzubauen; vgl. Zentralblatt Bakteriologie II Abt. 37 (1913) S. 595.
Im Jahre 1942 widmete Tak dem gleichen Phänomen eine Forschungsarbeit, in deren Verlauf er ein Bacterium
isolierte, das er Mycobacterium cholesterolicum jiannte; vgl. Ant. van Leeuwenhoek, Bd. 8 (1942)
S. 32. Danach erschien eine Reihe von anderen Veröffentlichungen über die Einwirkung von Mikroorganismen
der Gattungen Proactinomyces, Azotobacter, Flavobacterium, Aerobacter, Pseudomonas, Nocardia
und Streptomyces auf Cholesterin.
Bei diesen Verfahren wird Cholesterin vollständig zu Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht
abgebaut und es fallen keine nennenswerten Mengen von Verbindungen mit unversehrtem Steroidgerüst an.
Bisweilen wurden 4-ChoIesten und 7-Dehydrocholesterin
in geringen Mengen gefunden. T.ak fand bei seinen Untersuchungen geringe Mengen von 4-Cholesten-3,6-dion.
Beim Abbau von Cholesterin mit einer Nocardia Art in Gegenwart von 8-Hydroxychinolin gelang es, 3-Keto-bisnor-4-cholensäure,
3-Ketonbisnor- 1,4-choI-adiensäure sowie geringe Mengen von 1,4-Androstadien-3,I7-dion
und 4-Androsten-3,17-dion nachzuweisen; vgl. Biochemical Journal Bd. 90(1964), S. 23 P.
Die Einwirkung von Mikroorganismen der Gattungen Nocardia und Mycobacterium auf 1,3,5(10)-Cholestatrien
bringt keinen Abbau; vgl. Abstracts of Papers of the 150th Meeting of the American Chemical
Society (1965), 13 Q. Andererseits wurden 19-Hydroxy-4-cholesten-3-on
und 6,19-Oxido-4-cholesten-3-on durch diese Mikroorganismen leicht in Östron bzw.
6,19-Oxido-4-androsten-3,17-dion umgewandelt.
Die Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, daß man die Seitenkette in 17-Stellung von Steroiden unter Ausbildung einer I7-Ketogruppe und Erhaltung des Steroidgerüstes mit Mikroorganismen der Gattung Mycobacterium abbauen kann, wenn man
Die Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, daß man die Seitenkette in 17-Stellung von Steroiden unter Ausbildung einer I7-Ketogruppe und Erhaltung des Steroidgerüstes mit Mikroorganismen der Gattung Mycobacterium abbauen kann, wenn man
ίο als Ausgangssteroide 3«,5u-Cyclosteroide der Androstanreihe
verwendet.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von 17-Ketosteroiden der Androstanreihe
aus den entsprechenden Steroiden mit einer aliphatischen
Seitenkette mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in 17-Stellung durch mikrobiologischen Abbau,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Ausgangssteroide 3ct,5a-Cyclosteroide der Androstanreihe
mit einem gesättigten oder ungesättigten aliphatischen
ao Rest mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Stellung
verwendet und in üblichen Nährböden unter üblichen Bedingungen der Einwirkung von Bakterien
der Gattung Mycobacterium unterwirft.
Spezielle Beispiele für die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren Ausgangssteroide sind i-Cholesterin,
i-Sitosterin und i-Stigmasterin. Auch ist es möglich, Derivate dieser Verbindungen zu verwenden,
wie sie durch Veresterung, Veretherung oder Oxydation der Hydroxylgruppe in 6-Stellung erhalten
werden; auch kann diese Hydroxylgruppe eliminiert sein und/oder können andere Modifizierungen vorgenommen
sein, vorausgesetzt daß die Steroide die 3,5-Cyclostruktur besitzen und die Seitenkette in 17-Stellung
enthalten.
Die 3,5-Cyclosteroide, wie i-Cholesterin, können auf
einfache Weise aus den entsprechenden normalen Steroiden nach der Methode von E. M. Kosower
und S. Winstein, J. Am. Chem. Soc. Bd. 78 (1956), S. 4347, hergestellt werden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise Mycobacterium phlei und Mycobacterium butyricum
verwendet.
Das Verfahren der Erfindung wird vorzugsweise folgendermaßen ausgeführt:
Der Mikroorganismus wird in einem Nährmedium gezüchtet, das anorganische oder organische Stickstoffquellen
enthält, wie Aminosäuren, Ammoniumsalze, Alkalinitrate oder Erdalkalinitrate. Peptone,
Maisquellwasser, Hefeextrakte, Baumwollsaatmehl, Soyabohnenmehl oder lösliche Rückstände der Alkoholherstellung
können ebenso mit Vorteil verwendet werden. Die Nährmedien brauchen keine assimilierbare
Kohlenstoffquelle, wie Zucker, Stärke oder mehrwertige Alkohole zu enthalten, deren Anwesenheit im
übrigen keine nachteilige Wirkung auf den Verlauf des Verfahrens ausübt.
Ein für das Verfahren der Erfindung geeignetes Nährmedium enthält vorzugsweise außerdem die üblichen
Mengen von Salzen, wie Phosphate, Sulfate,
Alkalichloride und Erdalkalichloride. Die erforderlichen
Spurenelemente sind in hinreichenden Mengen dann vorhanden, wenn Leitungswasser verwendet
wird.
Wenn als natürliche Stickstoffquelle ein komplizier-
tes Gemisch wie Maisqellwasser verwendet wird, so kann der Zusatz von Mineralsalzen meist unterbleiben.
Die Nährmedien werden in üblicher Weise sterilisiert
und auf einen pH-Wert von 4,0 bis 8,5 eingestellt. Ein
pH-Wert von etwa 7 ist in den meisten Fällen bevorzugt.
Wenn die Bakterien unter konstanter Belüftung in dem Nährmedium sich hinreichend vermehrt haben,
kann das 3(x,5«-Cyclosteroid, z. B. i-Cholesterin oder
i-/}-Sitosterin, zugegeben werden, entweder gelöst in
einem geeigneten Lösungsmittel, wie N,N-Dimethylformamid, oder in Form einer feinen wäßrigen Suspension.
Das 3a,5«-Cyclosteroid wird 0 bis 72 h nach der
Beimpfung zugegeben; auch bei späterer Zugabe werden
recht gute Resultate erreicht. Die Zugabe des Steroids wird vorzugsweise 24 bis 48 h nach der Beimpfung
des Nährmediums vorgenommen, wenn die Mikroorganismen sich hinreichend vermehrt haben.
Eine sehr frühe Zugabe, zum Beispiel unmittelbar nach der Beimpfung, ist ebenfalls möglich und ergibt gute
Resultate.
Die Umwandlung des Steroids findet im allgemeinen bei konstanter Belüftung bei Temperaturen von 20 bis ao
45 C statt; das Verfahren verläuft jedoch auch bei höheren oder niedrigeren Temperaturen. Die Umwandlung
läßt man vorzugsweise bei einer Temperatur vor sich gehen, die die Optimaltemperatur für den betreffenden
Mikroorganismus ist. Diese Temperatur liegt im allgemeinen zwischen 25 und 35 C. Es ist nicht
notwendig, daß Wachstum und Umwandlung bei der gleichen Temperatur vor sich gehen. So kann z. B. der
Mikroorganismus zuerst während 24 h bei 26°C gezüchtet werden, und nach Zugabe des Steroids wird
die Temperatur erhöht.
Die Umwandlung des 3ci,5a-Cyclosteroids nimmt
1 bis 7 Tage in Anspruch; im allgemeinen nimmt die Menge des Endproduktes nach drei Tagen nicht merklich
zu.
Wenn als Ausgangssteorid i-Cholesterin, i-/?-Sitosterin
oder i-Stigmasterin verwendet wird, entsteht als Hauptprodukt o-Hydroxy-ß.S-cycloandrostan- 17-on
zusammen mit geringen Mengen der entsprechenden 6-Ketoverbindung. Wenn an Stelle von i-Cholesterin
die Methoxy-Verbindung verwendet wird, so entsteht natürlich kein 6-Ketosteroid. In manchen Fällen wurden
geringe Mengen von noch nicht identifizierten Nebenprodukten bei der Dünnschicht-Chromatographie
der Extrakte der Kulturflüssigkeiten gefunden.
Die gebildeten Produkte können aus der Kulturflüssigkeit
gewonnen und nach üblichen Methoden weiter gereinigt werden. Nach Vollendung der Fermentierung
können sie aus der Kulturflüssigkeit mit einem organischen Lösungsmittel, wie Methylisobutylketon,
Äthylacetat, Methylenchlorid oder Chloroform extrahiert werden. Diese Extrakte werden zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wird aus einem geeigneten Lösungsmittel umkristallisiert oder wenn nötig z. B.
durch Chromatographie und nachfolgende Kristallisation in seine Komponenten getrennt.
Die Ausgangssteroid-Konzentration im erfindungsgemäßen Verfahren hängt von dem verwendeten
Mikroorganismus ab. Sie liegt im allgemeinen bei 0,5 bis 50 g/l, vorzugsweise 2 bis 3 g/l. Das Substrat wird
innerhalb von 48 h zu den gewünschten Produkten umgewandelt.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren Sct^a-Cyclo-n-ketosteroide sind wertvolle
Ausgangsmaterialien für die Herstellung von Steroidhormonen. So läßt sich das aus i-Cholesterin erhaltene
S.S-Cyclo-öß-hydroxyandrostan-lT-on in einfacher
Weise nach der Methode von A. F. Wagner und
E. S. Wallis, J. Am. Chem. Soc. Bd. 72 (1950), S.
1047, in 3/?-Hydroxy-5-androsten-17-on umwandeln, das seinerseits weiter in Steroidhormone der Androstan-
und Pregnanreihe umgewandelt werden kann. Auch ist es möglich, S^-Cyclo-o/J-hydroxyandrostan-17-on
durch Oxydation mit Bleitetraacetat nach K. Tababe et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) Bd. 10
(1962) S. 1126 in das 6ß- 19-Oxido-Derivat umzuwandeln,
das als Ausgangsmaterial für die Herstellung von 19-nor-Steroidhormonen oder mit einem aromatischen
Α-Ring dienen kann.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Eine Anzuchtkultur von Mycobycterium phlei, Stamm KNGSF 70 wird hergestellt durch Überimpfen
einer Kultur dieses Bakteriums auf Bouillon-Agar und Inkubieren während drei Tagen bei 301C in einem
Nährmedium, das aus einer Lösung von 10 g Hefeextrakt in 1 I Leitungswasser vom pH-Wert 6,8 bestellt,
das vorher während 30 min bei 110JC sterilisiert worden
ist. Das Nährmedium befindet sich in 500 ml-Flaschen, und jede Flasche enthält 100 ml Nährmedium.
Die Kultur wird 48 h bei 30"C auf einer Drehschüttelmaschine
mit einer Geschwindigkeit von 250 U/min und einem Hub von 2'/2 cm geschüttelt,
wonach die Bakterien sich hinreichend vermehrt haben.
Das Hauptfermentationsmedium wird durch Verdünnen von 5 g Maisquellwasser-Flüssigkeit (berechnet
als Trockensubstanz) mit Leitungswasser auf 1 1 und Einstellen der Flüssigkeit auf einen pH-Wert von
7,0 mit verdünnter Natronlauge hergestellt. Das Nährmedium wird zu jeweils 100 ml in 40 Flaschen während
30 min bei HO1C sterilisiert.
Jede dieser Flaschen hat ein Fassungsvermögen von 500 ml. Das Medium in diesen Flaschen wird dann mit
5 ml der vorstehenden Anzuchtkultur unter sterilen Bedingungen beimpft. Die Flaschen werden in der
gleichen Weise wie die Anzuchtkultur 24 h geschüttelt.
Dann werden 200 mg i-Cholesterin in jede der Flaschen
in Form einer wäßrigen Suspension gegeben, wonach die Kulturen wiederum geschüttelt werden.
Nach 4tägigem Schütteln haben sich im wesentlichen zwei neue Produkte gebildet, deren Menge nicht
weiter wächst. Der Inhalt der 40 Flaschen wird vereinigt und die Kulturflüssigkeit (4 1) zweimal mit 2 1
Methylisobutylketon extrahiert. Aus dem Dünnschichtchromatogramm
des Extraktes (Silicagel; Chloroform-Methylacetat [9:1]) ergibt sich, daß sich zwei
Verbindungen gebildet haben, die stärker polar sind als i-Cholesterin. Die am stärksten polare Verbindung
wird mit A bezeichnet und die andere mit B. Der Extrakt wird unter vermindertem Druck zur Trockne
eingedampft. Das verbleibende öl (6,9 g) wird in einer kleinen Menge Benzol gelöst; die Lösung wird auf
eine Aluminiumoxid-Chromatographiesäule (Länge 46 cm; Querschnitt 2,6 cm; 265 g Al2O3 der Aktivität
III) gegeben. Die Säule wird zunächst mit Benzol eluiert, wobei Fraktionen von 20 ml aufgefangen werden.
Die Fraktionen 9 bis einschließlich 30 enthalten i-Cholesterin. Nach der Fraktion 30 wird als Eluierungsmittel
Benzol-Aceton (10:1) verwendet. Die Fraktionen 38 bis einschließlich 42, die hauptsächlich die
Verbindung B enthalten, werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der
feste Rückstand wird aus Aceton-Heptan umkristalli-
siert. Ausbeute 1,2 g reine Verbindung B mit den folgenden physikalischen Konstanten:
Schmelzpunkt 180bis 183°C; [<z]ß 20+ 118 (c = 0,5;
Chloroform); IR (Chloroform) 1734 cm-1 (C = 0; Fünfring-Keton), 1681 cm-1 (C = 0; Sechsring-Keton,
konjugiert mit Cycolpropan-Ring).
C19H26O2; ber.:
gef.:
gef.:
79,68
79,61
79,61
9,15
9,17
9,17
Aus den physikalischen Konstanten und dem Infrarot-Absorptionsspektrum
ergibt sich, daß die Verbindung B das 3a,5a-Cycloandrostan-6,17-dion ist.
Die Fraktionen 44 bis einschließlich 52, die die Verbindung A enthalten, werden unter vermindertem
Druck zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wird aus Aceton-Heptan umkristallisiert. Ausbeute
2,1 g reines A mit den folgenden physikalischen Konstanten :
Schmelzpunkt 135 bis 138°C; [a]D 20 125" (c = 1,0;
96% Äthanol); IR (Chloroform) 3610 cm-1 (OH in der gleichen Stellung wie in i-Cholesterin), 1736 cm-1
(C = 0; Fünfring-Keton).
| ber.: | C | H | |
| 19"2βθ2; | gef.: | 79,12 | 9,79 |
| 79,08 | 9,77 | ||
Aus den physikalischen Konstanten und dem Infrarot-Absorptionsspektrum
ergibt sich, daß die VerChromatogramm ist ersichtlich, daß der Anteil an der entsprechenden 6-Oxo-Verbindung gering ist.
Die Kulturflüssigkeit (insgesamt 4 1) wird zweimal mit 2 I Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wird unter
vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wird in 500 ml Methylisobutylketon
gelöst, die Lösung zweimal mit 30 ml 0,2 η Natronlauge und dann dreimal mit 50 ml Wasser gewaschen.
Der Extrakt wird nachfolgend mit 2 g Entfärbungs-
o kohle gerührt und filtriert. Das Filtrat wird unter
vermindertem Druck zu einer syrupösen Flüssigkeit eingedampft, die in 20 ml Heptan gelöst wird. Nach
Zugabe eines Impfkristalles kristallisiert 3a,5a-Cycloandrostan-6/?-ol-I7-on
aus. Ausbeute 2,4 g, F. 128 bis 136'C. Nach dem Umkristallisieren aus Aceton-Heptan
schmilzt die Verbindung bei 134 bis 138 C.
Beispiel 2 wird unter Verwendung von jeweils ίο 200 mg 6-Methoxy-i-cholesterin in jeder Flasche wiederholt.
Aus dem Chromatogramm ergibt sich, daß nur ein Produkt gebildet ist, nämlich 6-Methoxy-3a,5acycloandrostan-17-on.
Beispiel 2 wird unter Verwendung von Mycobacterium butyricum ATCC 11314 wiederholt. Jede Flasche
wird mit 200 mg i-Cholesterin versetzt. Nach 48 h ist ein Teil des Ausgangssteroids in 6-Hydroxy- und
bindung A das 3a,5a-CycIoandrostan-6/S-ol-17-on ist. 3° o-Keto-Sa^a-cycloandrostan-n-on umgewandelt.
Gemäß Beispiel 1 wird eine Anzuchtkultur von Mycobacterium phlei, Stamm KNGSF 70 hergestellt.
Diese Anzuchtkultur wird nun auf ein Nährmedium folgender Zusammensetzung überimpft:
Maisquellwasser (Trockensubstanz).. 5 g/l
Na2HPO4 · 2 H2O 1,25 g/l
Natriummonoglutaminat 2,5 g/l
Leitungswasser (pH 6,0)
Nach 24stündigem Schütteln bei 3O0C werden
200 mg i-Cholesterin in Form einer wäßrigen Suspension zu jeder der 100 ml-Portionen der gut entwickelten
Kultur zugegeben, wonach das Schütteln unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen fortgeführt wird.
Innerhalb 48 h ist das i-Cholesterin vollständig in ein Produkt umgewandelt, das häuptsächlich aus 6-Hydroxy-Sa^a-cycloandrostän-n-on
besteht. Ausdem
Flaschen werden gemäß Beispiel 2 mit einer Kultur von Mycobacterium phlei, Stamm KNGSF 70 versetzt.
Dann wird jede Flasche mit 200 mg i-ß-Sitosterin in Form einer wäßrigen Suspension versetzt. Die
Gesamtmenge an Steroid für alle 40 Flaschen beträgt 8 g. Die weitere Fermentation und die weitere Behandlung
wird gemäß Beispiel 2 durchgeführt. Ausbeute 2,15 g eines Produktes mit einem Schmelzpunkt von
126 bis 135° C. Nach zweimaligem Umkristallisieren aus Aceton-Heptan wird ein Produkt mit einem
Schmelzpunkt von 136 bis 138° C erhalten.
In jede der Flaschen werden 200 mg i-Stigmasterin
gegeben, während sonst wie in den Beispielen 2 und 5 gearbeitet wird. Es werden 1,85 g 6-Hydroxy-3a,5acycloandrostan-17-on
vom Schmelzpunkt 126 bis 135° C erhalten.
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von I7-Ketosteroiden
der Androstanreihe aus den entsprechenden Steroiden mit einer aliphatischen Seitenkette
mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in 17-Stellung durch mikrobiologischen Abbau, dadurch
gekennzeichnet, daß man als Ausgangssteroide 3a,5a-Cyclosteroide mit einem gesättigten
oder ungesättigten aliphatischen Rest mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Stellung verwendet
und in üblichen Nährböden unter üblichen Bedingungen der Einwirkung von Bakterien der
Gattung Mycobacterium unterwirft.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung mit Mycobacterium
phlei oder Mycobacterium butyricum durchführt.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL6605738A NL6605738A (de) | 1966-04-28 | 1966-04-28 | |
| NL6605738 | 1966-04-28 | ||
| DEK0061630 | 1967-03-07 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1618582A1 DE1618582A1 (de) | 1972-05-25 |
| DE1618582B2 DE1618582B2 (de) | 1976-01-15 |
| DE1618582C3 true DE1618582C3 (de) | 1976-08-26 |
Family
ID=
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