DE1618582A1 - Verfahren zur Herstellung von in 17-Stellung keinen kohlenstoffhaltigen Substituenten aufweisenden Steroiden - Google Patents

Description

8 MÖNCHEN 2

AMAUENSTRASSEIS· Telephon 224541

1618502

v - SN SPIRITFSI¹ABBIIk N

P e. 1 f t» .-.■_■ -

Verfahren zur Herstelluing von in 17-Stellang keinen kohlenstoffhaltigen Subs-feittienten aufweisenden Steroiden..

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur· Se^steilung Von in 17-Stellung keinen kohlenstoffhaltigen Substituenten aufweisenden Steroiden* ^J ' ^.

Nach der Erfindung geschieht die Herstellung d^rch mikrobiologische trör,vandlung unter Verwendung von Ster.olden als Äusgangsmaterial, die in 17-Stellung einen gesattigten oder ungesättigteft aliphatischen liest mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen besitzen» . .■;■"■■■■- _; ~ , ■

l?ür die Herstellung von Steroid-Hormonen wurden seit ■ langem natürlich vorkommenden Steroid-Verbindungen als Ausgangsmateriäl verwendet,"ws fehlte jedoch an einem Verfahren, durch das Steroide,die in 17-Steilung einen aliphatischen liest mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen enthalten, in einfacher V/eise in Steroide mit einem geringeren Molekulargewicht umgewandelt werden können, zum Beispiel eine Verbindung mit einem AndroBtan-Skelet,die als Ausgangsmaterialien tür-die"Herstellung von anderen Verbindungen

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mit androgenerjestrogenerjanabolischer und antikonzeptioneller Wirksamkeit dienen können·

Es war bekannt»dass bestimmte Mikroorganismen in"der Lage sind,Steroide,die in 17-Steilung eine aliphatisch^ Seitenkette mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen aufweisen,wie zum Beispiel Gholesterin,vollständig zu zerstören.So fandjra Jahre 1913 Söhngen,dass Bakterien von der Gattung Mycobacterium dazu in einem Medium,das als einzige Kohlenstoff quelle Cholesterin enthält, in der Lage sind (Zentralblatt Bakteriologie II Abt. 32 (1913) 595).

Im Jahre 1942 widmete Tak dem gleichen Phänomen eine Forschungsarbeit,in deren Verlauf er ein Bakter isolierte, das er Mycobacterium cholesterolioum (Ant.van Leeuwenhoek 8 (1942) 32) nannte. Danach erschienen eine Reihe von anderen Publikationen Über die Zerstörung von Cholesterin, bei denen Mikroorganismen der Gattungen Proactinomycee« Azotobacter, Plavobaoterium,.Aerobacter,Paeudomonag,Nocardia und iütreptomyces ervfähnt

Bei diesen Umwandlungsverfahren wird Cholesterin vollständig zu Verbindungen mit einem niedrigen Molekulargewicht abgebaut ftnd es fallen keine merkbaren Mengen von Produkten mit Steroid-Charakter an.Einigemale wurden 4-Cholesten und

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7-Dehydrochölesterin in kleinen Mengen entdeckt.Dak erwähnt eine kleine Menge von4-GholeBten~3»6*-diQn.

Whitmarsh versuchte den Afetau von Cholesterin (mit einer Sooardia ArtJ durchZugeben eines örganiöch|ü Inhibitors zu verlangsamen_fin der Hoffnung,auf diese Weise Zwischenprodukte isolieren zu können* die einen Anhaltspunkt für die ArtjWie dieser Abbau vor sich geht, geben könnten.Der verwendete Inhibitor war 8-Hydroxychinolinf es glückteί ihm,die 3-Keto-bisnor-4-chOlensäure in sauren Extrakten des Kulturmediums zu entdecken und Überdies eine sehr kleine Menge von 3-KetoiAisnor-l,4-choladiensaure_#In der neutralen Fraktion wurden kleine Mengen von l,4-Androstadien-3»lT-dion und 4-Androsten-3»17-dion (Biochemical Journal jW (1964) 23P) festgestellt« " '" - , -

SIH und andere prüften die Wirkung von Mikroorganismen auf Cholesterin-Derivate.Sie verwendeten Mikroorganismen der Gattungen Kocardia und Mycobaoterium«dle sie auf 1,3»5(10)— Gholestatrien einwirken ,Ii es seh, das jedoch im G-egensatz* zu' Cholesterin,das durch diese Mikroorganismen leicht vollständig abgebaut wurde,überhaupt nicht angegriffen Wurde (Abstracts of Papers· of the 150-th. Meeting of. the Ameriean Chemical Society (-1965) 13Q) ·; Andererseits warden 19-Hydroxy-4-cholesten-3-on und 6,19-Oxido-4-^c)iole.sten-'5-on durch, diese Organismen leicht in Astron bzw, 6,T9-Oxido-4-androsten-3,17-dion

BAD ORiairsW, V 2 0 9 8 2 2/0 92W

Offenbar kann man nicht voraus s agen, we lc he 'ChilesterinDerivate durch bestimmte Organismen derart, abgebaut werden f können,dass der Abbau der Seitenkette in 17-Stellung vor ! sich geht»daB Steroid-RingSyStem.jedoch erhalten bleibte

Es wurde nun gefunden,dass in 17-Stellung keinen kohlenstoffhaltigen Substituenten aufweisende Steroide durch ■ " mikrobiologische Umwandlung von Steroiden hergestellt werden' können,die in 17-Stellung einen gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Rest mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen aufweisen,wenn als Ausgangsmaterialien.3,5-Gyclosteroide, die in 17-Stellung einen gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Rest mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen aufweisen, und als Mikroorganismen solche verwendet werden,die die 17-S;treitenkette und das Ringsystem entsprechender normaler Steroide abbauen*

) ■..·■ ■-. ^; ■ - ■ - ' . ; ' "^; Ausgangsprpdukte sind also ^»S-Cyclosteroide mit einer

Seitenkette in 17-Stellung mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen« Haupts&chliches Beispiel- sind i-Cholesterin, i-Sitosterin undi-StigmasterineAuch ist es möglich,Derivate dieser Stoffe " zu verwenden,wie sie -durch. Veresterung.,Veretherung" oder- ■ Oxydation der 6-Hydroxyl-&ruppe erhalten werden;auch kann dieö-Hydroxyl-Crruppe eliminiert sein und/oder können andere Modifizierungen.vorgenommen sein,vorausgesetzt dass die Sterqide _tdie. 5,5-Cyclostruktur besitzen und die erwähnte

- -4. r 4.₊ . -,^ O4. -.-. ^u n₊ BAD ORIGINAL seitenkette in 17-Stellung enthaltene --

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Alkoh.öl© lapw*. gattoltgaidf^m ^aweseafesit im ke-iae naehteiligi WiÄuag auf d&a/Vorlauf dts

Bin für das "Verfahren der Erfindung geeignetes Medium ." enthält vorzugsweise ausserdem die übliche Menge von Salzen, .· *- wie !Phosphate, Sulfate ,Alkalichloride und Erdalkaliehloride. Die erforderlichen Spurenelemente sind in hinreichenden Mengen dann vorhanden,wenn Leitungswasser verwendet wird.

Wenn als natürliche Stickstoffquelle ein kompliziertes Gemisch wie Maismaische verwendet wird,so kann der Zusatz von Mineralsalzen meist unterbleiben.

Medien werden auf die Übliche Weise sterilisiert und deren pH-Wert wird eingestellt auf 4|0 bis 8»5.Ein pH-Wert von etwa 7 ist in den meisten Fällen der beatgeeignete·

Wenn unter konstanter Belüftung die Zellen in de» Medium hinreichend gewachsen sind,kann das Steroid,z.B. .!-Cholesterin oder i-ß-Sitosterin zugegeben werden,entweder gelöst in einem geeigneten !lösungsmittel,wie zum Beispiel H,N-Dimethy!formamid, oder in l'orm einer feinen wässrigen Suspension.

Das Steroid wird 0 bis 72 Stunden nach der Inooulierung . zugegeben% auch bei späterem Zugeben werden recht gute Resultate erreicht.Das Zugeben des Steroids wird vorzugsweise 24 bis 48 Stunden nach der Inoculierung der Kultur vorgenommen, wenn die Mikroorganismen sich hinreichend vermehrt habeiuEin sehr frühes Zugeben jedoch,zum Beispiel unmittelbar nach der InoGulierung der Kultur,ist möglich und ergibt gute Eesultate«

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Die Umwandlung des Steroids findet im allgemeinen bei konstanter Belüftung bei einer Temperatur,die zwischen 20 und 45⁰C variieren kann,statt{das Verfahren geht auch bei höheren oder niedrigeren Temperaturen vor sich.Die Umwandlung lässt man vorzugsweise bei einer Temperatur vor sich gehen,die die Optimaltemperatur für den betreffenden Mikroorganismus ist^Diese Temperatur liegt im allgemeinen zwischen 25 und 35 G»Bei Myeobakterium-Arten ist oft 30°C eine geeignete Temperatur.Es ist nicht notwendig,dass Wachstum und Umwandlung bei der gleichen Temperatur vor sich gehen.So kann zum Beispiel das Mikroorganisrn zuerst während 24 Stunden bei 26°C kultiviert werden,wonach nfeth Zugeben des Steroids die Temperatur erhöht wird«

Im allgemeinen werden die Bedingungen der Eermentierung den Erfordernissen des gewählten Microorganism angepasst, gemäss den üblicherweise in der Mikrobiologie verwendeten Methoden»

Die Umwandlung des zugefügten Steroids nimmt 1 bis 7 Tage in Anspruch? als Regel mag dienen,dass die Menge des gewünschten Endproduktes nicht merklich ansteigt nach drei Tagen*

Wenn als Substrat 1-Cholesterin, i-ß-Sitosterin oder !-Stigmasterin verwendet wird,entsteht als Hauptprodukt 6-Hydroxy«3,5-Cyeloandrostan-17--on zusammen mit geringen Mengen der entsprechenden 6-Keto-Verbindung.Wenn anstelle von

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i-Cholesterin die Methoxy-Verbindung verwendet wird,so entsteht natürlich kein 6-Keto-steroid.In manchen Fällen wurden geringe M_en.gen von bisher unidentifizierten ^ebenprodukten durch Dünnschicht—Chromatographie der Extrakte der Kulturflüssigkeiten gefunden.

Die gebildeten Produkte können aus der Kulturfliissigkeit gewonnen und nach üblichen Methoden weiter gereinigt werden_o Nach Vollendung der lermentierung können sie aus der Kulturflüssigkeit mittelst eines organischen Lösungsmittels wie zum Beispiel Methylisobutylketon,Äthylacetat,Methylenchlorid, Chloroform und dergleichen extrahiert xverden.Diese Extrakte werden zur Trockne abgedampft,worauf der verbleibende Peststoff aus einem geeigneten Lösungsmittel kristallisiert oder wenn nötig in seine Verbindungen,zum Beispiel durch Chromatographie und nachfolgende Kristallisation getrennt wird_o

Die Steroid-Konzentration bei dem Verfahren hangt von dem verv/endeten Mikroorganis;aab;als Regel mag dienen,daas sie zwischen 0,5 und 50 g/l liegen kann.Pur Arten der Mycobakterium-G-attung beträgt die Konzentration 2 bis 3 g/lj wobei das Substrat in 4-8 Stunden zu den gewünschten Produkten umgewandelt wird,»

Die durch mikrobiologische Umlandlun^ erhaltenen 3,5-Cyclosteroide -f;ind als Ausgangsmeteria lien für die Synthese von .Jtero-in-Hormonen von grosser ' *i.-:hti,"kf:it _O3o ist das -jus

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i-Cholesterin gewonnene 3» 5—Cyclo-öß-hydroxy-androstan-lT-on In einfacher V/eise nach der Methode von A«]? »Wagner und E.S₀ Wallis,beschrieben in J.AnuGhenuSoc. 72, (1950) 1047» zu. 3ß-Hydroxy-5-androsten-17-on umwandelbar,das seinerseits weiter in Steroid-Hormone der Androstan- und Pregnan-Reihe umgewandelt werden Kann«Auch ist es möglich, 3»5—Cyclo—6ß-hydroxyandrostan-17-on durch O,_cy(j_ation mit Bleitetraacetat ,wie von K_eTanabe u_oa_o in Chem_ePharm_eBull.(Tokyo) 10 (1962)1126 beschrieben,in das 6ß—19-Oxido-Berivat umzuwandeln,das als Ausgangsprodukt für die '"erstellung von Steroid-Hormonen von 19-nor-Konfiguration oder mit einem aromatischen A-Ring dienen kann ₉

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, ohne sie zu beschränken*

Beispiel I

Eine Animpfkultür von Mycobacterium phlei,Strain KFG-SP 70 wird hergestellt durch Animpfen einer Kultur dieses Bakters auf Bouillon,Inkubieren während drei Tagen bei 30⁰C in einem Medium,das aus einer Lösung von 10 g Hefeextrakt (DIi¹CO) in 1 Liter Leitungswasser vom pH-Wert 6,8 besteht,das vorhergehend während 30 Minuten bei 110°C sterilisiert worden ist» Dog Medium lie/it in 500 ml-Plaschen vor „Jede der I'lürv-hon enthält 100 ml. Medium*

Die Kultur wird 48 Stunden bei 30⁰C auf einer Sehüttel-Apparatur vom Umlauf-Typ mit einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute und einem Schüttelweg von 2 1/2 cm geschüttelt,wonach die Bakterien sich hinreichend entwickelt haben,um als Impfung zu dienen.

Das Hauptfermantetionsmedium wird durch Verdünnen von 5 g " Maismaische-Flüssigkeit (berechnet als Trockenstoff) mit Leitungswasser auf 1 Liter und nachheriges Bringen der Flüssigkeit auf einen pH-Wert von 7,0 mit verdünnter Natriumhydroxyd-Lösung hergestellt»Das Medium wird in 4-0 Flaschen während 30 Minuten bei HO⁰C sterilisiert.

Jede dieser Flaschen enthält 100 ml Medium und hat eine Kapazität von 500 ml.Das Medium in diesen Flaschen wird dann engeimpft durch Zugeben von 5 ml der oben erwähnten Ank impfkultur in jeder der Flaschen unter sterilen Bedingungen. Die Flaschen werden in der gleichen Weise wie die Impfkultur während 24 Stunden geschüttelt.

Es werden dann 200 mg !--Cholesterin zu ^eder der Flaschen in Form einer Suspension in Y/asser -zugegeben,wonach die Kulturen wiederum geschüttelt werden»

Fach 4-^.tägigeai Schütteln,-findet- man,dass sich im wesentlichen zwei neue Produkte gebildet haben,deren ^l'^Lenye nicht weiter wächst.Die Inhalte der 40 Einsehen werden vereinigt

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und die Kulturflüssigkeit (4 Liter) wird zv/eimal mit zwei Litern Methylisobuty!keton extrahiert„Die Dünnschicht-Chromatographie des Extraktes (auf Silicagel in dem System Chloroform-Methylacetat (9:1))zeigt,dass sich zwei Substanzen gebildet haben,die polarer sind als das i-Cholesterin_eDie am meisten polare Substanz wird mit A bezeichnet und die andere mit B.Der Extrakt wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.Das verbleibende Öl (6,9 g) wird, in einer kleinen Menge Benzol gelöst;die Lösung wird in einer Aluminiumoxyd-Kolonne (Länge 46 cm; Querschnitt 2,6 cm; Adsorbierungsmittel 265 g AIpO, actelll) überführt.Die Kolonne wird zunächst mit Benzol eluiert,wobei Fraktionen von 20 ml gesammelt werden.Die Fraktionen 9 bis einschliesslich 30 enthalten i-Cholesterin«, Nach der Fraktion 30 wird als Eluierungsmittel Benzol—Aceton (10:1) verwendetoDie Fraktionen 38 bis einschliesslich^,die hauptsächlich den Stoff B enthaIten,werden vereinigt und unter vermindertem IiI¹UCk zur Trockne abgedampft,Der restliche feste ütoff wird aus Aceton-Heptan kristallisiertoDas erhaltene Produkt ist 1,.~ g reines B mit den folgenden physikalischen Konstanten: - '

Schmelzpunkt ieO°-183°C; Jj⁵Ij ^⁰ + 118° (c=0,5iChloroform>; IR (Chloroform) 1734 cm"¹ (C=O,Fünfring-Keton),1681 cm"¹ (C=O;3echsrin -Keton,konjugiert mit" Cyclopropan-Ring)« ■

Elementaranalyse (berechnet auf·Cn„Hp^Op) _P C = 79,68^; H = 9,15 ⁰Zo₀

Gefunden: C = 79,61 ^; H = 9,17 ;J_O

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2 0 ü b ,: Z I 0 9 4 0"

Aus den physikalischen Konstanten und dem Infrarot-Spektrum geht hervor,dass B identisch ist mit 3^»5^-Cycloandrostan-6,17-dion₀

Die Fraktionen 44 bis einschliesslich 52» die den Stoff A enthalten,werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampftoDer zurückbleibende Feststoff wird aus Aceton-Heptan kristallisiertoDas erhaltene Produkt ist 2,1 g reines A mit den folgenden physikalischen Konstanten: Schmelzpunkt 135°-1-38^OC; [_°Q ζ° 125° (c=l,O; 9.6 7O Äthanol); IR (Chloroform) 3610 cm"¹ (OH in der gleichen Stellung wie in i-Cho.lesterin). 1736 cm" (C=O,Fünfring-Keton)* Elementaranaly s e (berechnet auf C-,qHpoOp): C = 79,12^₀; H = 9,79?^_e
Gefunden:C = 79,O8?a; H = 9,77^« ,

ψ Aus den physikalischen Konstanten und dem Infrarot-Spektrum geht hervor,dass A identisch ist mit 3cL,5a£rCycloandrostan-6ßol-17-οηί

Beispiel II

'In der gleichen vTeise wir in Beispiel I beschrieben v.drd eine Animpfkultur von Mycobacterium phlei,Strain E3JQ-SF 70 hergestelltoDiese Animpfkultur wird nun in ein Medium folgender Zusammensetzung inoculiert:

MD ORfQiNAL

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Maismaische-Flüssirrkeit (Trockensubstanz) ; 5 g/l

Na₂HPO₄ ο2aq - 1,25 g/l

Natriummonoglutaminat 2,5 g/l

Leitungswasser:pH 6,0

Nach 24-stündigem Schütteln "bei 50⁰C werden 200 mg i-Cholesterin in Form einer wässrigen Suspension zu jeder der 100 ml-Portionen der gut entwickelten Kultur zagegeben,wonsch das Schütteln unter den vorher erwähnten Bedingungen fortgeführt wird ο .

Innerhalb'48 Stunden nach Zugabe findet man,dsss das i-Cholesterin vollständig in ein Produkt umgewandelt ist,das hauptsächlich aus ö-Hydroxy-^^-^cycloandrostan-lT-on bestehto Au» clem Chromatogramm ist ersichtlich,dass die ^enge der entsprechenden 6-oxo-Verbindung gering ist«

Die Kulturflüssi-gkeit (insgesamt 4 Liter) wird zweimal mit zwei Litern Äthylacetat extrahiert„Der Extrakt wird unter vermindertem ,)ruck zur Trockne abgedampft .Der zurückbleibende Feststoff wird in 500 ml Methylisobutylketon gelöst,wonach die Lösung zweimal mit 30 ml 0,2 η ^atriumhydroxyd—Lösung und dann dreimal mit 50 ml Wasser gewaschen wird.Der Extrakt wird nachfolgend mit 2 g Entfärbungskohle gerührt und fil_ triert.Das liltrat wird unter vermindertem Druck zu einer

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syrupösen flüssigkeit eingedampft,die in 20 ml Heptan gelöst wird«Nach dem Inoculieren kristallisiert 3x,5<2-Cycloandrostan-6ß—ol-17-on auSoEs wird in einer Menge von 2,4 g ^mi"t einem Schmelzpunkt von 128-136°C erhalten<,Nach Umkristallisieren aus Aceton-iieptan erhält man ein Produkt mit einem Schmelzpunkt von 134-138⁰Co.

Beispiel III

Das gleiche Verfahr en ,.wie es in Beispiel II beschrieben ist,wird unter Zugeben von jeweils 200 mg 6-Meth.oxy-i-eholesterinjzu jeder Flasche- durchgeführt „Das Chromatogramm zeigt,dass nur ein Produkt gebildet ist, nämlich 6-Methoxy—3ot»5ot"Cycloandrostan-17-on^

Beispiel IV

Es wird so gearbeitet wie in Beispiel II angegeben., jedoch wird Mycοbacterium butyricum ATGC 11,314 verwendet_eZu jeder der Flaschen wird 200 mg !-Cholesterin zugegeben; nach. 48 Stunden ist eine teilweise Umwandlung zu 6-Hydroxy- und 6-Keto»-»3,5-cycloandrostan-17-on eingetreten»

Beispiel ν

Flaschen mit einer Kultur von Mycobacterium phlei,Strain KNG-SF 70 werden wie im Beispiel II angegeben bereitet „Bei diesem Beispiel werden 200 mg i-ß-Sitosterin in Form einer wässrigen Suspension zu jeder Flasche mit 100 ml Kultur zugegeben.Die G-esamtmenge an Steroid für alle 40 Flaschen betrug 8 g.Die weitere Fermentation und die weitere Behandlung sind die gleichen wie im Beispiel IIoErhalten wurden 2,15 g eines

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Produktes mit einem Schmelzpunkt von 126-135^OG_eKach.'zweimaligem Kristallisieren aus ÄGeton-Heptan wird ein Produkt mit einem Schmelzpunkt von 136-138⁰G erhalten«; _;

Beispiel VI ; :: ; '

In -5ede- der !Flaschen wurden: 200 mg i-Stigmasterin eingegeben jWährend sonst wie in d,en Beispielen Il und V^ gearbeitet wurde«Erhalten wurden 1,85 g β—Hydroxy-3s^54—cycloandrostan-17-on vom Schmelzpunkt 126^O-135°C_e

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Claims (2)

1. Patentansprüche

   1_# Verfahren ÄCti· herstellung yon keinen kohlenstoffhaitigen Sabßtitueiiten in 17*·Βΐβ11αη^ enthaltenden Steroiden durch mikrobiologische Umwandlung von Steroiden tnit einem gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Heet mit mindestens 8 Koblenatoffatomen in 17-S teilung, ei «durch gekennzeichnet, dHSB ale Ausgangemoteriallen 3*5-CyclO£3terolde tait einem gesättigten oder ungeoftttigten aliphatischen liest mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in 17-S-tellung 'verwendet werden und der Einwirkung von Mikroorganismen aUBgeoetst werden,die die 17-Peitenkette and das Ring-System entsprechender nortaaler steroide abbauten·
2. 2. Verfahren geraäee Anspruch 1 ,dadurch gekennzeichnet,dass ale AU£3£angsmaterialien i-Choleeterin, i-Sitoeterin oder 1*Stigmaaterin verwendet werden.

   3· Verfahren gemäse Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Hikroorganism eine Mycobacterium Art verwendet wird«

   4« Verfahren gemäse Anspruch l-3»deäurch gekennieichnet,döBS als Mikroornanism Mycobacter|^TB phlei« verwendet wird·

   5· Verfahren f.emäas Anspruch l-3>dadurch gekennBeichnet,<iBBB ml Eikroorgaiiism Mycohaoteria» butyric um verwendet vd

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