DE1618599A1

DE1618599A1 - Verfahren zur Herstellung von 11-ss-Hydroxysteroiden

Info

Publication number: DE1618599A1
Application number: DE19671618599
Authority: DE
Inventors: Auf Nichtnennung Antrag
Original assignee: Koninklijke Nederlandsche Gist en Spiritusfabriek BV
Current assignee: DSM Delft BV
Priority date: 1966-04-25
Filing date: 1967-04-24
Publication date: 1972-04-27
Also published as: IT1062300B; US3530038A; DE1618599B2; NL6605514A; BE697450A; DK125086B; AT281311B; SE335727B; ES339689A1; DE1618599C3; GB1150955A; NO125818B; IL27858A; CH493500A

Description

AWfAlIfE NSffiASSEti

(JISf- SS SFIBIOItJSi¹IEEIM Beiffi

Verfahren zur Herstellung von li-fi-

Die Erfindung bezieht sieh auf ein Verfahren zur Herstellung von Ilß,17y6^droxysteroiden durch Oxydieren von Steroiden mit zwei Wasserstoff atomen in ll-Stelluttg mit Hilfe von Enzymen von Pilzen der Gattung Gurvularia»

Ein Verfahren dieser irt ist bekannt aus der US-Patentschrift 2 658 023· Als praktisch sehr geeignet hat sieh Curvularia lunata erwiesen* Biese Umwandlung ist zum Beispiel von Wichtigkeit für die Herstellung von Hydrocortison (Verbindung Ff llß_f17öd_t21-iribydroxy-4-pregnen-*3>20-dion} aus der Verbindung S (17₀t_#21-Dihydroxy-4-pregnen-3 j2O-dionJj die Umwandlung kann jedoch auch allgemein auf 11-Desoxysteroide angewendet werden.

Bei der llß-Hydroxylierung mit Hilfe von Fungi der Gattung öurvularia und auch mit anderen Fungi (zum Vergleich US-Patentschrift 2 658 023} werden unerwünschte Nebenprodukte gebildet· So werden - wie aus der US-Patentschrift 2 783 255 hervorgeht - bei Anwendung von Curvularia-Enzymen auch in 7- und/oder !^-Stellung hydroxylierte Produkte erhalten· Diese Hebenprodukte- von dem gewünschten Endprodukt abzutrennen

20981071047

1618533

ist schwierig} die Bildung dieser Nebenprodukte führt zu Verlusten an kostbarem Ausgangsmaterial and zu einer entsprechen ■ den Verminderung der Ausbeute an dem gewünschten Produkt*

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass bei der Oxydierung von Steroiden mit zwei Wasserstoffatomen in !!-Stellung mit Hilfe von Curvularia-Arten die Ausbeute an llßflTöc^Bihydroxysteroiden sehr viel höher ist ,wenn als Ausgangsprodukt nicht 17ofc"Hydroxysteroid, sondern ein UoHiydroxysteroid» in dem das Wasser stoff atom der I7o6-Hydroxyl-G-ruppe durch einen organischen Rest ersetzt ist,der gewünschtenfalls nach der Einführung der llß-Hydroxyl-G-ruppe wieder entfernt werden kann, angewendet wird*

Die vorliegende Erfindung bezieht sich also auf ein Verfahren zur Herstellung von llß,17olrDihydr oxy steroiden durch Oxydierung von Steroiden mit zwei Wasserstoffatomen in 11-Stellung, mit Hilfe von Enzymen von Fungi der Gattung Curvularia, wobei ein ITöfc-Hydroxysteroid, in dem das Wasserstoffatom der lTck-Hydroxy-Gruppe durch einen organischen Rest ersetzt ist, der Öxydierung unterworfen wird und - wenn nötig die ΓΜ-Hydroxyl-G-ruppe in dem erhaltenen llß-Hydroxysteroid regeneriert wird*

Zwar stellt die US-Patentschrift 2 658 023 fest,dass bei der Umwandlung mit Enzymen von Curvularia-Arten anstelle

2 09818/1047

von Steroiden mit einer freien Hydroxy1-Gruppe auch Ester von solchen Steroiden als Au.sgangsprodu.kte verwendet werden können, jedoch kann sich dieser Hinweis nicht auf die 17o^-Ester beziehen, da in dieser Beziehung die US-Patentschrift 2 658 023L die Beobachtung mitteilt, dass - wenn die Ester verwendet werden - mitunter eine beträchtliche Verminderung der Ausbeute an hydroxyliertem Produkt eintritt. Die Erfinder haben festgestellt, dass bei Verwendung von 1706-Hydroxy-"21-acyloxy-Verbindungen als Ausgangsprodukte keine Verminderung der Ausbeute eintritt, sondern lediglich eine Verzögerung der Reaktion«, Die mikrobiologische/encymatische Umwandlung der Verbindung S-21-Acetat verläuft langsamer als die Umwandlung der Verbindung S, während die Verbindung F mit den gleichen niedrigen Ausbeuten von etwa 40 % erhalten wird. Gemäss der vorliegenden Erfindung hingegen wird eine besonders merkbare Verbesserung der Ausbeute erreicht· Das 17ö6-Acetat der Verbindung S wird rasch zu der Verbindung F oder einem Gemisch der Verbindung F und dem 17o£-Acetat der Verbindung F umgewandelt mit einer Ausbeute von etwa 96 ?6 der ,Theorie ₉

Wenn 17c6-Ester als Jtusgangsmaterialien für das Verfahren der vorliegenden Verbindung verwendet werden, so wird

zunächst eine ^ou-Aeyloxy-llß-hydroxy-Verbindung erhalten, die nachfolgend vollständig oder zu einem Teil während der Inkubation zu llß,17C>WDitiydroxy-steroid umgewandelt wird;

209818/104

1618593

Aus den nichtverseiften 17«^-Estern können die freien Alkohole in hohen Ausbeuten auf chemischem Wege, zum Beispiel durch Umsetzen mit Natriummethalonat, erhalten werden.

Das einzige Erfordernis, das an das als Ausgangsmaterial verwendete Steroid zu stellen ist, ist,dass in 17<xL-S te llung eine Hydroxyl-G-ruppe vorliegt, deren Wasserstoff durch einen organischen Best ersetzt ist, und dass der Ausgangsstoff zwei Was s er st off atome in H-S teilung enthält«, Die Ausgangs-Steroide können Pregnan-Stoffe, Androstan-Stoffe oder Oestran-Stoffe sein₀ Sie können in üblicher Weise substituiert sein oder Doppelbindungen enthalten« So kann in 17-Stellung ausser der veresterten oder verätherten Hydroxyl-G-ruppe eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkylyl-Gruppe zugegen sein, oder eine 1-Hydroxyäthyl-, 1,2-Dihydroxyäthyl-, Acetyl- oder Hydroxyacetyl-G-ruppe vorliegen. Das Zugegensein von Hydroxyl-Gruppen, die verestert oder veräthert sein können, oder Oxo-G-ruppen in anderen Stellungen im Molekül, zum Beispiel in 3- oder 16-Stellung, tangiert die Umwandlung gemäss der Erfindung nicht* Es können auch Alky!-»Gruppen zugegen sein, zum Beispiel in 2-, 4-, 6- und/oder 16-Stellung, oder Halogenatome, z„B. in 4-, 6-, 7-, 9-, 12- oder 21-Stellung. Es können auch Doppelbindungen zugegen sein, vorausgesetzt, dass das Kohlenstoffatom 11 zwei Wasserstoffatome trägt. Die Ausgangsmaterialien können auch einen kondensierten heterocyclischen Ring aufweisen, z.B. an den Kohlenstoffatomen 2 und 3· Endlich sei bemerkt, dass die Ausgangsprodukte auch 18- und/oder 19-nor-Verbindungen sein können^

209818/1047

Die I7ot-Hydroxy-Gruppe der Ausgangs-Steroide wird vorzugsweise verestert, da Ester-Gruppen später sehr leicht entfernt werden können; Verbindungen mit einer verätherten I7o&»-Hydroxyl-Gruppe sind auch brauchbar. Beispiele für die Ester sind Hb(^-Acetäte, Propionate, Capronate, Benzoate, Cyclohexan-carbonsäureester und dergl^,während als Äther erwähiat werden können Alkyl-, Trityl- und Teiferahydropyranyl-Ä'ther^

Wenn die Ausgangs-Steroide ausser in 17ä^Stellung weitere Hydroxyl-Gruppen enthalten, so können diese anderen Hydroxyl-Gruppen ebenfalls verestert oder veräthert sein_P Die Ausbeute an llß-Hydroxylierungsprodukt wird dadurch nicht gestört« Andererseits kann die Geschwindigkeit der Hydroxylierung abhängen von dem Zugegensein eines Substituenteno So geht die llß-Hydroxylierung von 17^21-Diacyloxysteroiden langsamer vor sich als die der entsprechenden 17-Acyloxy-21-HydroxysteroideX; die Diacyloxy-Verbindungen führen im übrigen zu gleich hohen Ausbeuten«

Die Ausgangsprodukte können durch übliche Methoden erhalten werden,wie zum Beispiel durch Acylierung der entsprechenden 17ut^-Hydroxysteroide in Gegenwart von sauren Katalysatoren, wie zum Beispiel para-Toluolsulfonsäure oder Perchlorsäure, So kann das 17oC»21-Diacetat der Verbindung S

209818/1047

gemäss den Vorschriften von Turner (JeAm,Chem_oSoc_e _7Jj (1953) 3489) erhalten werden durch Umsetzen mit Essigsäureanhydrid in Essigsäure in Gegenwart von para-Toluolsulfonsäure als Katalysator erhalten werden. Bei Verwendung von Steroiden mit einer Dihydroxyaceton-Seitenkette, wie zum Beispiel der Verbindung S, können die 17 -mono-Ester auch vorteilhaft über die ortho-Ester hergestellt werden, wie das von R₀ Gardi u_oa„ (Gazzetta chimica italiana 93. (1963) 431-450} beschrieben ist*

Als Curvularia-Arten können die in der US-Patentschrift 2 658 023 erwähnten Curvularia falcata,C„brachyspora, Colunata und Copallescens verwendet werden und auch andere Curvularia-Arten, wie zum Beispiel Curvularia geniculata Tracy und Earle (Boedijn)£

Für die mikrobiologische Umwandlung muss der Curvularia-PiIz in einem geeigneten Kulturmedium zum Wachstum gebracht werden, das insbesondere Kohlehydrate, Salze und organischen oder anorganischen Stickstoff enthält« Andere nützliche Substanzen sind Wachstumsanreger, wie zum Beispiel Vitamine der B-Serieβ Glukose oder Saccharose kann vorzugsweise als Kohlenstoffquelle verwendet werden« Weiter kann Maismaischellüssigkeit oder Sojabohnengries als Stickstoffquelle verwendet werden, wobei Maismaische-fflüssigkeit bevorzugt ist infolge der in ihr vorhandenen Wachstumsanreger bzw» -beförderer

209818/1047

-T-

Das verwendete Steroid wird in Form einer kristallinen Suspension oder gelöst in einem geeigneten Lösungsmittel wie Aceton, Propylenglykol oder Dimethylformamid zu der Kultur zugegeben, wonach die Belüftung der Kultur fortgesetzt wird, um das Wachstum der Mikroorganismen und die Oxydierung des Steroids herbeizuführen bzw«, zu befördern₀ In manchen Fällen ist es vorteilhaft, das Steroid zuzufügen,nachdem die Mikroä Organismen unter aeroben Bedingungen bereits gewachsen sind« Auch ist es möglich, die Mikroorganismen aus dem Kulturmedium nach der Kultivierung zu isolieren und sie in destilliertem Wasser oder einer physiologischen Kochsalzlösung wieder zu suspendieren, in der das zu oxydierende Steroid zugegen ist oder dem es zugesetzt werden kann. Anstelle des Mycels kann man auch die Sporen der Mikroorganismen oder ein Enzympräparat der Organismen verwenden (zum Vergleich Zuidweg u.acCBiochim.Biophys.Acta 58 (1962)131))« Abhängig von der Natur und der Konzentration des Steroids oder der verwendeten Curvularia-Art können die Umwandlungszeiten von 10 bis 90 Stunden betragen, wobei die Fermentationstemperatur zwischen 20° und 37⁰C variieren kann« In der Regel wird das Steroid in einer Konzentration von nicht mehr als 10 g pro Liter verwendet, je nach der Umwandlungsgeschwindigkeit des Steroids unter den gegebenen Bedingungen.

Nach Vollendung der Oxydierung kann das Reaktionsprodukt aus der gefilterten oder zentrifugierten Kulturflüssigkeit und - wenn notwendig - aus dem Mycel durch Extraktion mit einem geeigneten Lösungsmittel, das nicht

209818/1047

vollständig mit Wasser mischbar ist, gewonnen werden, Methylenchlorid, Äthylenchlorid oder Metb.ylisobu.ty!keton sind bevorzugte Lösungsmittel. Der Extrakt kann auf ein kleines Volumen eingedampft oder vollständig bis zur Trockne verdampft werdem>

Der kristalline oder nichtkristalline Rückstand wird dann - wenn nötig - durch chemische Mittel in das gewünschte 17ot,-Hydroxysteroid umgewandelt. Die 17Ok-Ester der llß-Hydroxysteroide können in llß-17ot-Dihydroxy-Verbindungen umgewandelt werden durch Entfernen der Acylgruppe mit Hilfe eines Natriumalkoholats in einem Alkanol,wie zum Beispiel Methanol oder Äthanolo Andere entsprechende Derivate können durch übliche Methoden in die gewünschten Endprodukte umgewandelt werden* Durch einfache Kristallisation kann das Endprodukt schliesslich in reinem Zustand isoliert werden.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung: BEISPIEL I

Zur Herstellung von Inokulationsmaterial werden die Inhalte von zwei Erlenmeyer-Kolben mit einem Fassungsvermögen von 2000 cm⁵, von denen jeder 500 cm* Kulturmedium enthält, mit einer Kultur von Curvularia lunata inokuliert, die auf Hafermehl»Agar gezüchtet wurden. Das Medium besteht aus einer Lösung von 20 g Maismaische-FlüssigkeitCberechnet auf Trockensubstanz) und 20 g Glukose pro Liter Wasser, das nach

209818/104?

Einstellung des pH-Wertes mit 2 η Natriumhydroxy-Lösung auf 6,5 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert war. Die Kolben werden anschliessend während 48 Stunden bei 26⁰C auf einer rotierenden Schüttelmaschine (250 Umdrehungen pro Minute) geschüttelt^

Der Inhalt eines Inokulierungsgefässes mit einer Nettokapazität von 80 Litern wird mit 1000 ml der erhaltenen Inokulierungskultur inokuliert. Dieses Inokulierungsgefäss ist ausgestattet mit einer Belüftungseinrichtung und enthält ein Kulturmedium, bestehend aus einer Lösung von 5 g Maismaische-Flüssigkeit (berechnet auf Trockensubstanz) und 5 g G-lukose pro Liter Wasser, die nach Einstellen des pH-Wertes mit Natriumhydroxyd auf 6,5 während 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert war. Die so erhaltene Kultur wird während 30 Stunden bei 26°C belüftet mit.einer Luftgeschwindigkeit in der Nähe des Gebläses von 0,5 m/Min.»; es wird dann der Inhalt des Hauptfermentierungsgefässes damit inokuliert«,

Die Hauptfermentation wird durchgeführt in einem Fermentationstank mit einer i^ettokapazität von 800 LiternoDas Kulturmedium für die Hauptfermentation besteht aus einer Lösung von 40 g Maismaische-Flüssigkeit(berechnet auf Trockensubstanz) und 8 g G-lukose pro Liter Wasser,die nach Bringen des pH-Wertes mit Natriumhydroxyd auf 6,5 für 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert

09813/1047

1618539

Die Hauptkultur wird mit einer Luftgeschwindigkeit in der Nahe des Gebläses von 0,5 m/Min_o belüftet und mit einen Standard-Rushton-Turbinen-Rührmechanismus mit einer Geschwindigkeit von 250 cm/sec₀ bei einer Temperatur von 26°G gerührt „Der Inokulierungsprozentsatz beträgt 10 ?£« 10 Standen nach der Inokulierung werden 400 g von S-17-Acetat in Form einer feinen Suspension in Wasser zugegebene Gemäss dem Papisr-Chromatographie-Test ist 12 Stunden nach dem Zugeben des Steroids alles Ausgangsmaterial umgewandelt in ein Gemisch von praktisch ausschliesslich Hydrocortison und Hydrocortison-

Nach Abfiltrieren des Mycels wird es sorgfältig mit ^Methylisobutylketon gewaschen. Die Waschflüssigkeiten werden zusammen mit frischem Lösungsmittel zum Extrahieren des KuI-turfiltrats dreimal nacheinander folgend mit 0,2 VoI·$ Lösungsmittel verwendet. Die kombinierten Extrakte werden unter vermindertem Druck auf 600 ml konzentriert„Nach dem Trocknen wiegt das erhaltene kristallisierte Produkt 276 g und besteht aus Hydrocortison und Hydrocortison-17o^-Acetat mit einer geringen Menge von Verunreinigungen^

Die Mutterlauge wird mit Methylisobutylketon auf 3600 ml verdünnt, kalt mit 360 ml Natriumhydroxyd und anschliessend mit Wasser bis zur neutralen Reaktion gewaschen« Danach wird die organische Schicht unter vermindertem Druck zur Trockne gebracht ₉

20981871047

1618593

Der Rückstand wird in 1200 ml Methanol aufgenommene Die so isolierte Ölschicht wird zweimal mit der Hälfte ihres Volumens Methanol extrahiert. Zu den kombinierten methanolischen Lösungen* werden weitere 9600 ml Methanol zugegeben,wonach die 276 g Kristalle von Hydrocörtison und Hydrocortison-lig-Acetat in der Lösung gelöst werden. Nach Sättigung mit Stiekstoff werden bei Raumtemperatur 220 cm einer stickstoffgesättigten 1 η Natriummethylatlösung in Methanol zugegeben· lach einstündigem Rühren unter Stickstoff wird die Lösung mit Essigsäure neutralisiert; nach dem Lösen des kristallisierten Hydrocortisons durch Erwärmen wird 40 g Aktivkohle zugegebene Nach dem Filtrieren wird das Filtrat auf 1100 ml konzentriert. Nach 12 Stunden bei 3°C wird das Hydrocörtison abfiltriert, mit Methanol und Wasser gewaschen und während 16 Stunden bei 8O⁰C unter Durchleiten von Luft getrocknete Das erhaltene Produkt besteht aus 275$4 g Hydrocörtison (Schmelzpunkt 216-219⁰Cf Γ OCJj₃ = +151° (c = 1 in Dioxan)f E^_m bei 242 im in Methanol = 443)9

Aus der Mutterlauge können weitere 55 _s 2 g Hydrocörtison durch Kristallisieren isoliert werden, so dass die 6-esamtausbeute auf 88,6 $ steigt.

Das rohe Kristallisat kann zur Herstellung von reinem Hydrocortison-17t?t-acetat verwendet werden. Zu diesem Zweck werden 200 g der rohen Kristalle in 100 ml Methanol unter

209818/1047

Erhitzen gelöst, wonach die Lösung mit 8,6 cm Essigsäure angesäuert und mit 20 Aktivkohle entfärbt wird. Dem Mltrat wird 680 ml Wasser zugegeben, wonach die Lösung gekühlt wird_o Das kristallisierte Produkt wird abfiltriert, mit 60 % Methanol gewaschen und getrocknet. Nachfolgend wird das Produkt wiederum aus 60 $igem Methanol kristallisiert und dann aus 200 ml Methylisobutylketon. Auf diese Weise konnten 64,1 g reines Hydrocortison-lTtt-acetat mit einem Schmelzpunkt von 232-234°C erhalten werden*
Γ Oc]₁₁ = +52° (c = 1 in Dioxan); E^_m bei 241,5 Wl in

Wl

Methanol = 414ο

Elementaranalyse:Berechnet:C 68,29$, H 7,97 $

Gefunden: C 68,21$, H 7,89 %₀

Infrarotspefetrum:Banden bei 3620, 3508, 1735, 1714, 1669, 1620 und 1082 cm"¹,

MMR-Spektrum:Maxima bei 0,96; 1,47; 2,85; 3,28; 4,28; 4,50 und 5,74 ppm (im Vergleich zu Tetramethylsilan als Standard)*

Das 17tf, 21-Dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion-17-acetat-Ausgangsprodukt kann über den 17,21-ortho-Ester,wie von E. Gardi u.a. in Gazz.chim_eital_e 93. (1963) 431-450 beschrieben, hergestellt werden;

BEISPIEL II

In der in Beispiel I beschriebenen Weise wird eine Fermentationsbrühe hergestellt, deren Kulturmedium aus 7 g Maismaische-Flüssigkeit (auf Trockensubstanz berechnet), 7 g

209818/1047

1618533

Glukose und 3 g Soyabohnenmehl pro Liter Leitungswasser bestehto

Man lässt dann die Kultur 10 Stunden wachsen,wonach eine Suspension der Verbindung S-17<0jj21-Diacetat in Yifasser in einer Konzentration von 500 mg pro Liter zugegeben wird «,Nach 36 stündiger Inkubation bei 29⁰C hat sich das Substrat vollständig umgewandelt in praktisch ausschliesslich Hydrocortison und Hydroeortison-17oL.-acetat.Das Reaktionsprodukt wird in der gleichen Weise wie im Beispiel I beschrieben aufgearbeitet. Auf diese Weise wird in einer Ausbeute von 87>4 $ reines Hydrocortison erhalten*

BEISPIEL III

Das Inokulierungsmaterial von Curvularia lunata wird wie im Beispiel I beschrieben hergestellt. Es wird verwendet zur Erzeugung einer Hauptfermentationsbrühe (Inokulierungsprozentsatz 5 %) in 10 Erlenmeyer-Schüttelkolben mit einer Kapazität von 2000 cm , von denen jeder 500 cm des Kulturmediums enthält, das besteht aus einer Lösung von 5 g Maismaische-Flüssigkeit (berechnet auf Trockensubstanz) und 5 g G-lukose pro Liter Wasser, die nach Bringen des pH-Wertes auf 6,8 mittelst Natriumhydroxydlösung sterilisiert wurde,Die Kolben werden bei 26⁰C auf einer Rotationsschüttelmaschine (250 Umdrehungen pro Minute) geschüttelt«Nach einer Wachstumszeit von 18 Stunden werden 5 cm- einer Suspension von 250 mg der Verbindung S-1706-Propionat zu dem der Kolben

20 9 818/1047

zugegeben. Die Kulturen werden nachfolgend während 24 Stunden unter den obigen Bedingungen iftkmbi§£t» wobei der pH-V/ert bei etwa 6 gehalten wird. Aus den Papierchromatogrammen ergibt sich, dass das Substrat vollständig in die Verbindung F-17c£--Propionat und eine geringe ^menge der Verbindung umgewandelt worden ist. Die Kulturen werden ohne Filtrieren mit dem gleichen Volumen Methylisobuty!keton extrahiert.Der Extrakt wird unter vermindertem Druck auf etwa 1 Liter konzentriert und mit 100 cm 0,1 η NatEimnhydrοxydlösung und 3 x 100 cm destilliertem Wasser gewaschen. Der gewaschene Extrakt wird mit Aktivkohle behandelt und dann unter vermindertem Druck zur Trockne gebracht»

Wegen einer geringen ^enge unlöslichen Materials wird der Rückstand in 50 cnr Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wird Methanol zugegeben, bis das Volumen 250 cnr beträgt; die Losung wird mit Stickstoff gesättigt. Nachfolgend werden 25 cnr einer mit Stickstoff gesättigten 0,1 η Natriummethylat-Lösung in Methanol zugegeben*

Die Lösung wird 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und dann mit 5 em η Essigsäure neutralisiert* Das Papierchromatogramm zeigt, dass die Lösung die Verbindung J und eine geringe Menge von Verunreinigungen enthalte Die Lösung wird unter vermindertem Druck zu einem kristallinen

■7.

Rückstand eingedampft. Dieser Rückstand wird aus 10 cm Dichloräthan kristallisiert. Erhalten werden 1,8 g kristallinen Produktes, das gemäss dem Papierchromatogramm aus der Verbindung

209818/10:47

1B18599

I¹ mit einem kleinen Menge polarer Verunreinigungen besteht· Dieses Produkt wird aus etwa 5 cm Methanol umkriställisiert und ergibt 1,57 g der praktisch reinen Verbindung I\ (70 $ der Theorie)«, Das Infrarotspektrum der Substanz ist identisch mit dem der Verbindung I^

Das als Ausgangsprodukt verwendete 17^-Propionat der Verbindung S kann nach der Methode vonGardi hergestellt werden«

Diese Substanz hat folgende Konstanten:

Schmelzpunkt:126 - 129⁰C; [*C] ^ = 40° (c = 1, Chloroform)ο AnalyseiBerechnet: C 71,61$, H 8,51$ G-efunden: C 71*63%, H 8,-

I,IUSpektrum: Banden bei 3500, 1732, 1713, 1655 und 1617 cm"¹. NeM_-Re Spektrum: Maxima bei

0,70; 1,20; 1,13 (Triplet); 2,30 (Quadruplet); 3,18 (Triplet) 4,25 (Doublet); 5,74 ppm^

BEISPIEL IV

Das Inokulierungsmaterial von Curvularia lunata wird wie im Beispiel I beschrieben,hergestellt; es wird für die Herstellung einer Hauptfermantationsbrühe in Schüttel-Erlenmeyer von

3 "5

500 cm , die 100 enr des wie im Beispiel III besehrieben zusammengesetzten Kulturmediums enthalten, angewendet« (Inokulierungsprozentsatz 5 $)«Nach dem Inokulieren der Kolben werden sie unter den im Beispiel I genannten Bedingungen schütteltoNach 18stündigem "Yachstum wird 1 cm einer Suspension

209818/1047

1618539

zu jedem der Schüttelkolben zugegeben, die 25 mg der Verbindung S-17ofcj21-DiP^ropionat in Wasser enthält. Der pH-Wert der Kulturen wird nun auf verschiedene Werte eingestellt und die Kulturen werden während weiterer 48 Stunden unter den obigen Bedingungen inkubiert*

Die Dauer der Umwandlung wird festgestellt durch Extrahieren einer Kultur mit Methylisobutylketon nach verschiedenen Behandlungszeiten und Bestimmung der Zusammensetzung der Extrakte durch Papierchromatographie und DünnschichtChromatographie, verbunden mit Verseifung (mit alkoholischer Alkalimetallhydroxyd-Lösung unter Stickstoff) des gebildeten Ester,, Bei pH-Werten 7,5 bis 8,5 ist das Substrat vollständig in 4-8 Stunden in die Verbindung P umgewandelt (über die Verbindung-S—17otr-propionat und die Verbindung-l-17oi-SPropionat) mit Spuren von polarem Material. Bei einem pH-Wert unterhalb 7,5 wird Verbindung !-17eC-Propionat gebildet}

Da₃ als Ausgangsmaterial verwendete 17oi,21-Dipropionat der Verbindung S kann durch Veresterung der 21-Hydroxyl-G-ruppe der Verbindung-S-17<t-Propionat mit Propionsäureanhydrid in Pyridin hergestellt werden»

Die Substanz hat folgende Konstanten:

Schmelzpunkt : 166-167⁰C; [οζ\ _d = 68° (c = 1, Chloroform). Analyse!Berechnet: C 70,71$, H 8,35% Gefunden: C 70,95$, H 8,28$

209818/1047

I.R.Spektrum:Banden bei 1738-1731, 1666, 1616 und 1165 cm"¹, No OH-Banden

NMR Spektrum: Maxima bei 0,78$ 1,20} etwa 1,18 (Triplet), 4,78 (Doublet), 5,75 ppm,

BEISPIEL V

Die Verbindung-S-17a(,-benzoat wird wie im Beispiel IV in Schüttelku.lturen von Curvularia lunate umgewandelt; die Umwandlung wird verfolgt wie das in Beispiel IV angegeben ist_o

Nach 48 Stunden war das Ausgangsprodukt bei einem pH-Wert oberhalb 7 noch nicht vollständig in ausschliesslich Verbindung I¹ und bei einem pH-Wert unterhalb 4,5 in Verbindung ]?-17ck-Benzoat umgewandelt;

Das als Ausgangsprodukt verwendete 17e£--Benzoat der Verbindung S kann nach G-ardi hergestellt werden«, Die Substanz hat die folgenden physikalischen Konstanten:

⁰ r *i

Schmelzpunkt: 177 - 178 Cf JjatJ ^ = 2 (c = 1 in Chloroform);

Analyse: Berechnet: C 74,64$, H 7,

Gefunden: C 74,40$, H 7₉69$o

I,RoSpektrum: Banden bei 3500, 1721, 1714, 1667, 1617, 1604, 1586, 1450, 1282 und 1090 cm"¹,

NMR Spektrum: Maxima bei. 0,81; 1₉2O| 3,2; 4,3 (Doublet), 5,7, und 7,58 ppm;

BEISPIEL VI

Das 17₉t-Phenylacetat der Verbindung S wird in der gleichen Weise wie in Beispiel IV in Schüttelkulturen von Curvularia geniculata umgewandelt,l wobei die Umwandlung

überwacht wird wie in Beispiel IY beschriebene In allen Fällen ist das Ausgangsprodukt noch nicht ganz vollständig in 48 Stunden umgewandelt, jedoch ist ausschliesslich Verbindung F entstanden,,

Da_s als Ausgangsmaterxal verwendete 17ot"Phenylacetat der Verbindung S kann nach G-ardi hergestellt werden« Die Substanz hat die folgenden physikalischen Konstanten: Schmelzpunkt:205-207 ₉ 5°C;[ol] = +49° (c = !,Chloroform) ₉ Analyse: Berechnet: C 75,00%, H 7,76% Gefunden: C 75,08%, H 7,73%.

IeH,Spektrum: Banden bei 3500, 1730, 1715, 1668, 1615, 1495 und 1453 cm""¹.

NMR Spektrum: Maxima bei 0,64; 1,17; 3,63; 4,15; 5,76 und 7,3 ppm}

BEISPIEL VII

Der 17ot-Cyclohexancarbonsäureester der Verbindung S wird in Schüttelkulturen von Curvularia lunata umgewandelt; der Verlauf der Umwandlung wird in der im Beispiel IV beschriebenen Weise verfolgt. In allen Fällen war das Substrat vollständig in 48 Stunden zu ^at-Cyclohexanonsäure-, ester des Hydrocortisons und eine Spur Hydroeortison umgewandelt^

Das Substrat kann in der von G-ardi a.a,0„beschriebenen Weise hergestellt werden. Im vorliegenden Fall wurde die

209818/1047

Substanz in amorpher Form erhalten» I_eR.Spektrum:Banden bei 3500, 1726, 1668 una 1617 cm » .

BEISPIEL VIII

Das Verfahren ist das im Beispiel IV beschriebene, jedoch wird als Au.sgangsprodu.kt das 17oi.-Capronat der Verbindung S verwendet,!

Nach 48 stündiger Inkubation ist das Substrat bei einem pH-Wert oberhalb 7 fast vollständig ausschliesslich in Hydrocortison umgewandelt und bei einem jjg-Wert unterhalb 6 in Hydrocortison-rZöC-capronato

Das Ausgangsprodukt kann hergestellt werden in der von G-ardi a.a.O_e beschriebenen Weise. Die Substanz hat die folgenden physikalischen Konstanten;

Schmelzpunkt: 100-105°C;[dC)-p = +39,6 (c = 1 in Chloroform)* I.R.Spektrum: Banden bei 3500, 1730, 1668 und 1615 cm"¹, NMR Spektrum: Maxima bei 0,70? 0,95; l|20; 2,30; 4,28 (Doublet) und 5,73 ppm»

BEISPIEL IX .

In der im Beispiel III beschriebenen Weise werden in Erlenmeyer-Kolben mit einer Kapazität von 2000 cm , von denen jeder 500 ml Kulturmedium enthält, 10 Schüttelkulturen von Curvularia lunata hergestellt. Nach 18 Stunden Schütteln bei 26⁰G werden zu jeder der Schüttelflaschen 5 cnr einer wässrigen

209818/104?

Suspension zugegeben, die 100 mg lT^Acetoxyprogesteron enthält. Die Kulturen werden dann während 48 Stunden unter den obigen Bedingungen inkubiert_o Die PapierChromatographie zeigt, dass das Substrat vollständig in hauptsächlich ein und dasselbe Produkt umgewandelt worden ist und in eine geringe Menge von Nebenprodukten, die nicht identifiziert wurden,,

Die Kulturen werden mit dem gleichen Volumen Methylisobutylketon extrahiert. Der Extrakt wird mit verdünnter Natriumhydroxyd-Lösung und Wasser gewaschen, dann mit Aktivkohle behandelt und nachfolgend unter vermindertem Druck zur Trockne gebracht«

Der Rückstand wird aus Äthylacetat kristallisierte Die Ausbeute ist 0,88 g_o Die Papierchromatographie zeigt, dass das Produkt llß-Hydroxy-17ot~acetoxyprogesteron ist, mit einer kleinen Menge polarer Verunreinigungen. Durch eine neuerliche Behandlung mit Aktivkohle und Umkristallisation aus Methanol werden 0,74 g reines llß-Hydroxy-17d^-acetoxyprogesteron erhalten, die die folgenden physikalischen Konstanten besitzen: Schmelzpunkt:257-259⁰C
Analyseberechnet: C 71,10%, H 8,30%

Gefunden: C 71»02%, H 8,16%.

I.R.Spektrum: Banden bei 3620, 1732, 1718, 1666, 1620 und 865 cm"¹.
NMR Spektrum: Maxima bei 0,92; 1,46; 2,03" 2,08 und 5,70 ppm.'

209818/1047

Zur Bestimmung der Struktur wurden 250 mg des Produktes durch Lösen in 25 enr Methanol und 25 cw? einer 4$igen Lösung von Kaliumhydroxyd in Methanol verseift;man liess die Lösung 15 Stunden bei Raumtemperatur stehen,, Die Lösung wird mit 1 cm Eisessig neutralisiert und unter vermindertem

3 Druck zur Trockne eingedampfte Der Rückstand wird aus 5 cm Methanol und 5 cm Wasser kristallisierte Ausbeute 203 Nach dem Umkristallisieren aus einer sehr geringen ^ Chloroform werden 185 mg reines llß,17ai.-Dihydroxyprogesteron mit einem Schmelzpunkt von 222-224⁰C erhaltene Das Infrarotspektrum dieses Produktes ist identisch mit dem von autentischem llß,17ot-Dihydroxyprogesteron_eDer Mischschmelzpunkt zeigt keine Erniedrigung_o

Das als Ausgangsprodukt benutzte 17e£^-Acetoxyprogesteron ist beschrieben in JeAm„Chem_eSoce 7_5_» 3489 (1953)?

BEISPIEL X

Das 17öL-Acetat von 6ot-Fluor-16 -methyl- 17oC-y21-dihydroxy-4-pregnen-3»20-dion wird in Schüttelkulturen von Curvularia lunata umgewandelt, wobei der Verlauf der Umwandlung wie in Beispiel IV beschrieben überwacht wird^

In allen Fällen wird ausschliesslich methyl-llß,17et'»21-trihydroxy-4-pregnen-3,20-dion und sein 17«i.-Acetat gebildet^

2 0 98 18/ 10A7

Das zugesetzte 17<?£-Acetat des

21-dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion hatte folgende Konstanten:

Schmelzpunkt: 188-190⁰C₀.
Analyse: Berechnet: C 68,55$, H 7,91$ Gefunden: C 68,41$, H 7,89$·

BEISPIEL XI

las 17dL,21-Diacetat von 6oL-Fluor-libL-methyl-17ud.f 21-dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion wird in Schüttelkulturen von Curvularia lunata umgewandelt, wobei der Verlauf der Umwandlung wie im Beispiel IV beschrieben überwacht wird» In allen Fällen wird ausschliesslieh 6öW?luor-16x.-methyl-llß,17ot, 21-trihydroxy-4-pregnen-3,20-dion und sein 17ot-Acetat gebildet^

Das zugesetzte 17öt»21-Diacetat von methyl-17o*",21-dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion kann nach der von RoB.Turner,JoAmeChem.Soco 7_5. (1953) 3489 beschriebenen Methode hergestellt werden; es hat folgende physikalische Konstanten:

Schmelzpunkt: 226,5-228,5°C;E^_m bei 236 mu in Methanol = 35O_e

Elementaranalyse: Berechnet: C 67,51$, H 7,62$

Gefunden: C 67,54$, H 7,53$. I.E.Spektrum;Banden bei 1735-1728, 1682, 1668, 1625 und '

879 cm""¹,

NMR Spektrum:Maxima bei 0,81; 0,98 (Doublet),1,20; 2,14;

2,17; 4,78 und 6,08 ppm„

209818/1047^

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur herstellung von Ilß₅17gc-Dihydroxysteröiden durch Oxydation von Steroiden mit zwei Wasserstoffatomen in 11-Stellung mit Hilfe von Enzymen von Curvularia-Fungi, dadurch gekennzeichnet, dass 17öL-Hydroxysteroide, in denen das Wasserstoffatom der 17<<j-Hydroxyl-Gruppe
durch einen organischen Rest ersetzt ist, der Oxydierung unterworfen werden, gegebenenfalls mit nachheriger Frei-Setzung der 17oL-Hydroxyl-Gruppe des erhaltenen
llß-Kydroxysteroids«

2«, Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,dass lTok-Acyloxysteroide als Ausgangsmaterial verwendet
werden«,

3β Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass 17ct-Acetoxysteroide als Ausgangsmaterialien
verwendet werden©

4« Verfahren gemäss Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet,
dass 17üL-Acetoxy-21-hydroxy-4-pregnen-3,20-dion als
Ausgangsmaterial verwendet wird«

5ο Verfahren gemäss Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass 17aCi21-Diacetoxy-4-pregnen-3,20-dion als Ausgangsmaterial verwendet v/irdi

BAD ORIGINAL

2 0 9818/1047

6$ Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das 17st-Propionat von 17^ 21-Dihydroxy-4-pregnen-3 j 20-dion als Ausgangsmaterial verwendet wird«,

7> Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das 17<£,21-Dipropionat von 17oL,21-Dihydroxy-4-pregnen-3j20-dion als Ausgangsmaterial verwendet wird φ

8_t Verfahren getiäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das 17cL-Benzoat von 17oC, 21-Dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion als Ausgangsmaterial verwendet wird«,

9« Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das 17ci.-Phenylacetat von I¹^U21-Dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion als Ausgangsmaterial verwendet wird»

ΙΟ,* Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das 17cL-Capronat von 1701»? 21-Dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion als Ausgangsmaterial verwendet wird«

11. Verfahren gemäss Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass das 17db\Acetoxyprogesteron als Ausgangsmaterial verwendet wird«·

20 98T87 10 4 7

12. Verfahren gemäss Anspruch 1-3» dadurch gekennzeichnet, ■ dass das 17>,-Acetat von öa^-Fluor-l^L-methyl-lToL, 21-dihydroxy-4-pregnen-3₉20-dion als Ausgangsmaterial verwendet wirde

13ο Yerfahren gemäss Anspruch 1-3> dadurch gekennzeichnet, dass das 17(sC»21-Diacetat von 6oL-Fluor-16ii-methyli7^»21-dihydroxy-4-pregnen-3»20-dion als Ausgängsmaterial verwendet wird»

20981871047