NO125818B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av 1113,17a-hydroksy-steroider tilhørende, pregnanrekken.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av 11B,17°<-hydroksysteroider tilhørende pregnanrekken ved hydroksylering av steroider tilhørende pregnanrekken, som er usubstituerte i 11-stilling, ved hjelp av enzymer fra fungi tilhør-ende slekten Curvularia.

En fremgangsmåte av denne typen er kjent fra US patent nr. 2 658 023. I praksis synes den mest egnede fungus å være Curvularia lunata. Denne omdannelse er viktig f.eks. for fremstilling av hydrocortison (forbindelse F; 113,17aj21-trihydroksy-4-pregnen-3,20-dion) fra forbindelse S (17a,21-dihydroksy-4-pregnen-3,20-dion), skjønt omdannelsen kan anvendes generelt på 11-desoksysteroider.

Ved 113-hydrolysering ved hjelp av fungi fra slekten Curvularia såvel som med andre fungi (jfr. US patent nr. 2 658 023) dannes uønskede biprodukter. Således oppnåes, hvilket fremgår fra US patent nr. 2 783 255, hydroksylerte produkter i stillinger 7 og/ eller l^iot ved anvendelse av Curvularia-enzymer. Det er vanskelig å fjerne disse biprodukter fra sluttproduktet samtidig som dannelsen av disse biprodukter er forbundet med tap av dyre utgangsprodukter og en tilsvarende reduksjon i utbytte av det ønskede produkt.

Det har nå overraskende vist seg at utbyttet av 113,17a-dihydroksysteroider ved hydrolysering av steroider tilhørende pregnanrekken, som er usubstituerte i 11-stilling, ved hjelp av Curvularia-arter blir vesentlig høyere dersom utgangsmaterialet er et 17d-hydroksysteroid. 17ct-acyloksygruppen kan etter hydroksyleringen, om ønsket, hydrolyseres på i og for seg kjent måte.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt en fremgangsmåte til fremstilling av 113,17«-dihydroksysteroider til-hørende pregnanrekken ved hydroksylering av i 11-stilling usubstituerte steroider tilhørende pregnanrekken, ved hjelp av enzymer fra fungi tilhørende slekten Curvularia, kjennetegnet ved at 1701-acyloksy-steroider tilhørende pregnanrekken underkastes hydroksylering, hvoretter, om ønsket, 17a-acyloksygruppen hydrolyseres på i og for seg kjent måte.

Det er i US patent nr. 2 658 02 3 angitt at man ved omdann-elser med enzymer fra Curvularia-arter istedenfor steroider med en fri hydroksylgruppe også kan bruke estere av disse steroider som utgangsprodukter, men dette gjelder ikke 17a-estrene, fordi det i forbindelse med US patent nr. 2 658 023 er observert at hvis estrene benyttes, vil det av og til forekomme en betydelig reduksjon i utbyttet av hydroksy-lert produkt. Det er videre funnet at bruken av 17a-hydroksy-21-; acyloksy-forbindelser som utgangsprodukter ikke omfatter en reduksjon i utbytte, men bare en retardasjon av reaksjonen. Den mikrobiolog-iske/enzymatiske omdannelse av forbindelse S-21-acetat går langsommere for seg enn omdannelsen av forbindelse S, mens forbindelse F oppnåes fra denne med de samme lave utbytter på ca. k0 %, Ifølge foreliggende oppfinnelse er det imidlertid oppnådd en slående forbedring i utbytte, 17c*-acetatet av forbindelse S omdannes således hurtig til et utbytte på ca. 96 % av det teoretiske, til forbindelse F eller en blanding av forbindelse F og 17ot-acetatet av forbindelse F.

Hvis 17a-estere benyttes som utgangsmaterialer i foreliggende omdannelse, oppnåes først en 17a-acyloksy-113-hydroksy-forbindelse, som deretter omdannes fullstendig eller delvis under inkuba-sjonen til et ll<g>,17a-dihydroksysteroid. Fra de ikke-forsåpede 17a-estrene kan de frie alkoholene oppnåes med høyt utbytte ved hjelp av kjemiske metoder, f.eks. ved omsetning med natriummetanolat.

De eneste krav som må tilfredsstilles av det steroid som benyttes som utgangsprodukt, er at det i 17a-stilling må finnes en hydroksylgruppe hvis hydrogenatom er erstattet av en acylgruppe og steroidet må inneholde to hydrogenatomer i 11-stilling. Utgangssteroidene er hentet fra pregnanrekken. De kan være substituerte på vanlig måte og kan også inneholde dobbeltbindinger. Det kan således i 17-stillingen, foruten den forestrede eller foretrede hydroksylgruppe, være en alkyl-, alkenyl- eller alkynylgruppe, eller en 1-hydroksyetyl-, 1,2-dihydroksyetyl-, acetyl- eller hydroksyacetyl-gruppe. Tilstedeværelsen av hydroksylgrupper som enten kan eller ikke kan forestres eller foretres eller av oksogrupper i andre stillinger i molekylet, slik som 3- eller l6-stillingen, forstyrrer ikke den foreliggende omdannelse. Alkylgrupper kan også være tilsteds, f. eks. i 2-, 4-, 6-, og/eller 16-stillingene, eller halogenatomer, f. eks. i 4-, 6-, 7-, 9-, 12- eller 21-stillingene. Videre kan dobbeltbindinger være tilstede forutsatt at karbonatom 11 er forbundet med to hydrogenatomer. Utgangsproduktene kan også inneholde en konden-sert heterocyklisk ring, f.eks. ved karbonatomer 2 og 3. Endelig skal det nevnes at utgangsproduktene også kan være 18- og/eller 19-nor-forbindelser.

17a-hydroksygruppen i utgangssteroidene er fortrinnsvis forestret fordi estergruppene lettest kan fjernes igjen, men forbindelser med en foretret 17a-hydroksylgruppe er også egnet. Eksempler på etere er 17a-acetater, propionater, capronater, benzoater, cyklo-heksankarboksylsyreestere og lignende, mens etrene kan være alkyl, trityl og tetrahydropyranyl-etere.

Hvis utgangssteroidet inneholder andre hydroksylgrupper foruten den i stilling 17a, kan disse også forestres eller foretres og utbyttet av 113-hydroksyleringsproduktet berøres ikke av dette.

På den annen side kan hydroksyleringshastigheten avhenge av de til-stedeværende substituenter. Således er 113-hydroksyleringen av 17a, 21-diacyloksysteroider langsommere enn den til de tilsvarende 17a- acyloksy-21-hydroksysteroider, skjønt med diacyloksyforbindelsene oppnåes det samme høye utbytte.

Utgangsproduktene kan tilveiebringes ved hjelp av konvensjonelle metoder, slik som acylering av de tilsvarende 17a-hydroksy-steroider i nærvær av syrekatalysatorer, slik som paratoluensulfon-syre eller perklorsyre. 17a,21-diacetatet av forbindelse S kan så-ledes oppnåes ifølge R.B. Turner (J.Am. Chem. Soc. 75 (1953) 3^89) ved omsetning med eddiksyreanhydrid i eddiksyre i nærvær av para-toluensulf onsyre som katalysator. Hvis det benyttes steroider med en dihydroksyacetonsyrekjede, slik som forbindelse S, kan 17a-mono-estere også fremstilles med fordel via orto-estrene, som beskrevet av R. Gardi et al. (Gazzetta) chimica italiana 93 (1963) 431-450).

Curvularia-arter som kan benyttes er artene Curvularia falcata, C.brachyspora, C.lunata, og C. pallescens nevnt i US patent nr. 2 658 023j eller også andre Curvularia-arter, slik som Curvularia geniculata Tracy et Earle (Boedijn).

Ved anvendelse av mikrobiologisk omdannelse må Curvularia fungus styrkes i et egnet kulturmedium, som inneholder spesielt kar-bohydrater, salter og organisk eller uorganisk nitrogen. Andre stof-fer er vekstaktivatorer, slik som B-kompleksvitaminer. Glukose eller saccarose kan med fordel brukes som karbonkilde. Videre kan mais-støpevæske og/eller soyabønnemel anvendes som nitrogenkilder, idet maisstøpevæske foretrekkes på grunn av de vekstaktivatorer som finnes i denne.

Det aktuelle steroid tilsettes til kulturen i form av en krystallsuspensjon eller oppløst i et egnet oppløsningsmiddel, slik som aceton, propylenglykol eller dimetylformamid, hvoretter kulturen gjennomluftes for å fremme veksten av mikro-organismen og oksygener-ing av steroidet. I noen tilfeller er det fordelaktig å tilsette steroidet etter at mikroorganismen allerede har vokst under aerobe betingelser. Det er også mulig å isolere mikro-organismen fra kulturmediet etter dyrking og suspendere den igjen i destillert vann eller en fysiologisk saltoppløsning, hvori steroidet som skal oksygeneres er tilstede eller til hvilken det tilsettes. Istedenfor myceliet er'det også mulig å anvende sporer av mikro-organismen eller et enzym-preparat av organismen (jfr. cf. Zuidweg et al. (Biochim.Biophys. Acta 58 (1962) 131)). Det kan anvendes omdannelsestider på fra 10 - 90 timer avhengig av beskaffenheten og konsentrasjonen av det benytt ede steroid eller de benyttede Curvularia-arter, mens fermenterings-temperaturen kan variere fra 20° til 37°C. Som regel anvendes steroidet i en konsentrasjon ,på ikke mer enn 10 gram per liter, avhengig av omdannelseshastigheten.for steroidet under de gitte forhold.

Etter fullendelse av oksygeneringen kan reaksjonsproduktet oppnåes fra den filtrerte eller sentrifugerte kulturvæske og om nød-vendig fra myceliet ved ekstraksjon med et egnet oppløsningsmiddel som ikke er helt blandbart med vann. Dette oppløsningsmiddel kan være metylenklorid, etylenklorid, eller metylisobutylketon. Ekstraktet kan inndampes til et lite volum eller inndampes fullstendig til tørr-het .

Den krystallinske eller ikke-krystallinske rest omdannes deretter, om nødvendig, ved hjelp av kjemiske metoder til det ønskede 17a-hydroksysteroid. 17ct-estrene av 113-hydroksysteroidene kan således omdannes til 113,17a-dihydroksyforbindelsene ved fjerning av acylgruppen ved hjelp av et natriumalkoholat i en alkanol, slik som metanol eller etanol. Andre tilsvarende derivater kan omdannes ved hjelp av konvensjonelle metoder til de ønskede forbindelser. Ved hjelp av-enkel krystallisering kan sluttproduktene isoleres i ren tilstand.

I de følgende eksempler er foreliggende oppfinnelse ytterligere illustrert.

Eksempel I

Når det gjelder fremstilling av podningsmaterialet, blir' innholdet i to Erlenmeyer-kolber med en kapasitet på 2000 cm?, idet hver kolbe inneholder 500 cm^ kulturmedium, inokulert med en kultur av Curvularia lunata dyrkes på havremelagar. Mediet består av en opp-løsning av 20 g maisstøpevæske (beregnet som tørrstoff) og 20 g glukose per liter vann som, etter at pH-verdien er stilt til 6.5 med 2 N natriumhydroksydoppløsning, er sterilisert i 20 minutter ved 120°C. Plaskene rystes deretter i 48 timer ved 26°C i en roterende rystemaskin (250 omdr./min.).

Innholdet i en podningsbeholder med en netto kapasitet på 80 liter podes med 1000 ml av den tilveiebragte podningskultur. Denne podningsbeholder er forsynt med en gjennomluftningsanordning og inneholder et kulturmedium bestående av en oppløsning av 5 g maisstøpe-væske (beregnet som tørrstoff) og 5 g glukose per liter vann, som, etter at pH-verdien er stilt til 6.5 med natriumhydroksyd, har blitt sterilisert i 30 minutter ved 120°C. Den således tilveiebragte kultur gjennomluftes i 30 timer ved 26°C med en lufthastighet nær blåseren på 0.5 m/min.jog deretter podes'innholdet i en hovedfermenterings-beholder med dette.

Hovedfermenteringen utføres i en fermenteringsbeholder med en netto kapasitet på 800 liter. Kulturmediet for hovedfermenteringen består av en oppløsning av 40 g maisstøpevæske (beregnet som tørrstoff) og 8 g glukose per liter vann, som, etter at pH-verdien er stilt til 6.5 med natriumhydroksyd, er sterilisert i 30 minutter ved 120°C.

Hovedkulturen gjennomluftes med en lufthastighet nær blåseren på 0.5 m/min. og omrøres med en standard Rushton turbin-røremekanisme med en hastighet på 250 cm/sek. ved en temperatur på 26°C. Podningsprosenten er 10 %. 10 timer etter podning tilsettes 400 g av forbindelse S-17-acetat i form av en fin suspensjon i vann. Ifølge en papirkromatografisk undersøkelse finner man at alt utgangsmateriale, 12 timer etter tilsetningen av steroidet, er omdannet til en blanding av praktisk talt utelukkende hydrpcortison og hydrocortison 17a-acetat.

Etter at myceliet er filtrert fra, vaskes det grundig med metylisobutylketon. Vaskevæsken anvendes, sammen med friskt oppløs-ningsmiddel, til å ekstrahere kulturfiltratet tre ganger etter hver-andre med 0.2 volumdeler oppløsningsmiddel. De kombinerte ekstrakter konsentreres under forminsket trykk til 600 ml. Etter tørking veier det krystalliserte produkt 276 g og består av hydrocortison og hydrocortison 17a-acetat med en liten mengde urenheter.

Moderluten fortynnes med metylisobutylketon til 3600 ml, vaskes i kald tilstand med 360 ml natriumhydroksyd og vaskes deretter med vann inntil reaksjonen er nøytral. Etter dette inndampes det organiske laget til tørrhet under forminsket trykk.

Resten opptaes i 1200 ml metanol. Det oljelaget som således skiller seg ut isoleres og ekstraheres to ganger med halvparten av volumet med metanol. Til de kombinerte metanoliske oppløsninger tilsettes ytterligere 96OO ml metanol, hvoretter krystallene av hydrocortison og hydrocortison 17a-acetat med en vekt på 276 g oppløses i oppløsningen. Etter metning med nitrogen ved romtemperatur tilsettes 220 m^ av en nitrogenmettet 1 N-oppløsning av natriummetylat i metanol. Etter 1 times omrøring under nitrogen nøytraliseres oppløsningen med eddiksyre og etter oppløsning av det krystalliserte hydrocortison ved oppvarming, tilsettes 40 g aktivt karbon. Etter filtrering konsentreres filtratet til 1100 ml. Etter 12 timer ved 3°C filtreres hydrocortisonet fra, vaskes med metanol og vann og tørkes i 16 timer ved 80°C mens luft gjennomføres. Det tilveiebragte produkt består av 275.4 g hydrocortison (smeltepunkt 216° - 219°C, [a]D = +151° (c = 1

i dioksan); E^<m>ved 242 my i metanol = 443).

Fra modervæsken kan ytterligere 55.2 g hydrocortison isoleres ved krystallisering, og følgelig økes utbytte til 88.6 %.

Det.urene krystallisatet kan benyttes for fremstilling av rent hydrocortison 17a-acetat. For dette formål oppløses 200 g av de urene krystallene i 100 ml metanol under oppvarming, hvoretter opp-løsningen surgjøres med 8.6 cm^ eddiksyre og avfarges med 20 g aktivt karbon. Til filtratet tilsettes 680 ml vann hvoretter oppløsningen avkjøles. Det krystalliserte produkt filtreres av, vaskes med 60 % metanol og tørkes. Deretter krystalliseres produktet på nytt fra 60 % metanol og deretter fra 200 ml metylisobutylketon. På denne måten oppnåes 64.1 g rent hydrocortison 17a-acetat med et smeltepunkt på 232° - 234°C; [a]D= +52° (c = 1 i dioksan); E<**>mved 241.5 my i metanol = 4l4.

Elementanalyse: Beregnet: C 68.29 %, H 7.97 %

Funnet: C 68.21 H 7.89 %.

Infrarødt spektrum: bånd ved 3620, 3508, 1735, 1714, 1669, 1620 og 1082 cm"<1>.

NMR spektrum: maksima ved O.96, 1.47, 2.85, 3.28, 4.28, 4.50, og 5.74 deler per million (med hensyn til tetrametylsilan som standard).

17a,21-dihydroksy-4-pregnen-3,20-dion 17-acetatet som ble benyttet som utgangsmateriale, kan fremstilles via 17,21-orto-esteren, som beskrevet av R. Gardi et al. i Gazz. chim.'ital. 93 (1963) 431-450).

Eksempel II

På samme måte som beskrevet i eksempel I prepareres et hoved-fermenteringsskum hvis kulturmedium består av 7 g maisstøpevæske (beregnet som tørrstoff), 7 g glukose og 3 g soyabønnemel per liter vann.

Kulturen gis anledning til å vokse i 10 timer hvoretter en suspensjon av forbindelse S-17a,21-diacetat i vann tilsettes til'en konsentrasjon på 500 mg per liter. Etter 36 timers . inkubasjon ve'd 29°C, er substratet fullstendig omdannet til praktisk talt utelukkende hydrocortison og hydrocortison 17a-acetat. Reaksjonsproduktet be-arbeides på samme måte som beskrevet i eksempel I. På denne måten oppnåes en hydrocortison i et utbytte på 87.4 %.

Eksempel III

Podningsmaterialet av Curvularia lunata prepareres som beskrevet i eksempel I. Det benyttes til fremstillingen av et hoved-fermenteringsskum (podningsprosent = 5) i 10 Erlenmeyer-kolber med en kapasitet på 2000 cm\ som hver inneholder 500 cm^ av et kulturmedium bestående av en oppløsning av 5 g maisstøpevæske (beregnet som tørr-stoff) og 5 g glukose per liter vann, som, etter at pH-verdien er stilt til 6.8 med natriumhydroksydoppløsning, har blitt sterilisert. Flaskene rystes ved 26°C i en roterende rystemaskin (250 omdr./min.). Etter 18 timers vekst, tilsettes 5 cm ■ x av en suspensjon av 250 mg av forbindelse S-17ot-propionat til hver av kolbene. Kulturene' inkuberes deretter i 24 timer under de ovenfor omtalte betingelser, idet pH-verdien opprettholdes ved ca. 6. Fra papirkromatogrammer viser det seg at substratet er fullstendig omdannet til forbindelse F-17 -pro-pionat og en liten mengde forbindelse F. Kulturene ekstraheres uten filtrering med et like stort volum metylisobutylketon. Ekstraktet konsentreres under forminsket trykk til ca. 1 liter og vaskes med

3 . 3

100 cm 0.1 N natriumhydroksydoppløsning og 3 x 100 cm destillert vann. Det vaskede ekstrakt behandles med aktivt karbon og inndampes deretter til tørrhet under forminsket trykk.

Med unntagelse av en liten mengde uoppløselig materiale, oppløses resten i 50 cm^ metanol. Metanol tilsettes til denne opp-løsning inntil volumet er 250 cm^ og oppløsningen mettes med nitrogen. Deretter tilsettes 25 cm^ av en 0.1 N oppløsning av natriummetylat

i metanol, som på forhånd er mettet med nitrogen.

Oppløsningen omrøres i 1 time ved romtemperatur under nitrogen og nøytraliseres deretter med 3 cm^ N eddiksyre. Fra papirkromatogrammer viser det seg at oppløsningen inneholder forbindelse F og en liten mengde urenheter. Oppløsningen inndampes under forminsket trykk til en krystallinsk rest. Denne rest krystalliseres fra 10 cm^ dikloretan. En mengde på 1.8 g krystallinsk produkt oppnåes, som ifølge papirkromatogrammer består av forbindelse F med en liten mengde polare urenheter. Dette produkt omkrystalliseres fra ca. 5 cm^ metanol og gir 1.57 g praktisk talt ren forbindelse F (70 % av det teoretiske utbytte). Det infrarøde spektrum av stoffet er identisk med

det til forbindelse F.

17a-propionatet av forbindelse S benyttet som utgangsprodukt, kan fremstilles ved hjelp av den metode som er beskrevet av Gardi et al., som tidligere nevnt.

Denne forbindelse har følgende konstanter:

Smeltepunkt 126° - 129°C, [<x]D = 40° (c = 1, kloroform).

Analyse: Beregnet: C 71.61 %, H 8.51 %

Funnet: C 71.63 %, H 8.44 %.

I.R. spektrum: bånd ved 3500, 1732, 1713, 1655 og 1617 cm"<1>.

N.M.R. spektrum: maksima ved 0.70, 1.20, 1.13 (triplet), 2.30 (fire-dobbelt), 3.18 (triplet), 4.25 (dublet), 5.74 deler per million.

Eksempel IV

Podningsmaterialet av Curvulari lunata prepareres som beskrevet i eksempel I, og brukes til fremstilling av et hovedfermen-teringsskum 1 Erlenmeyer-kolber på 500 cm , inneholdende 100 cm kulturmedium sammensatt som beskrevet i eksempel III (podningsprosent = 5). Etter podning rystes flaskene under de betingelser som er nevnt i eksempel III. Etter 18 timers vekst tilsettes 1 cm^ av en suspensjon inneholdende 25 mg av forbindelse S-17a,21-dipropionat i vann til hver av kolbene. pH-verdien til kulturene stilles nå til forskjellige verdier og deretter inkuberes kulturene i ytterligere 48 timer under de ovenfor angitte betingelser.

Omdannelsen kontrolleres ved å ekstrahere en kultur m ed metylisobutylketon etter forskjellige tider og bestemmer sammenset-ningen av ekstraktene ved hjelp av papirkroaratografi og tynnsjikts-kromatografi, kombinert med forsåpning (med alkoholisk alkalimetall-hydroksydoppløsning under nitrogen) av de tildannede estere, Ved pH 7.5 til 8.5 synes substratet å være fullstendig omdannet i løpet av 48 timer til forbindelse F (via forbindelse S-17a-propionat og forbindelse F-17a-propionat) med spor av polart materiale. Ved en pH-verdi lavere enn 7.5 dannes forbindelse F-17a-propionat.

17ct,21-dipropionat av forbindelse S som benyttes som utgangsprodukt, kan fremstilles ved forestring av 21-hydroksylgruppven i forbindelse S-17a-propionat med propionsyreanhydrid i pyridin.

Stoffet har følgende konstanter: smeltepunkt 166° - l67°C.

[a]D= 68° (c = 1, kloroform).

Analyse: Beregnet: C 70.71 %, H 8.35 %

Funnet: C 70.95 %, H 8.28 %.

I.R. spektrum: bånd ved 1738-1731, 1666, l6l6 og H65 cm<-1>.

Ingen OH-bånd.

NMR spektrum: maksima ved O.78, 1.20, ca. 1.18 (triplet), 4.78 (dublett), 5.75 deler per million.

Eksempel V

Forbindelse S-17a-benzoat omdannes på samme måte som i eksempel IV i rystede kulturer av Curvularia lunata, og omdannelsen kontrolleres også på samme måte som i eksempel IV.

Etter 48 timer er ikke utgangsmaterialet fullstendig omdannet, nemlig ved en pH over 7 til utelukkende forbindelse F og ved en pH under 4.5 til forbindelse F-17a-benzoat.

17a-benzoatet av forbindelse S som benyttes som utgangsprodukt, kan fremstilles ifølge Gardi et al., som angitt. Stoffet har følgende fysiske konstanter: smeltepunkt 177° - 178°C, tct]D = 2°

(c = 1 i kloroform).

Analyse: Beregnet: C 74.64 f», H 7.6l %

Funnet: C 74.40 %, H 7.69 %.

I.R. spektrum: bånd ved 3500, 1721, 1714, 1667, 1617, 1604, 1586,

1450, 1282 og 1090 cm"<1>.

NMR spektrum: maksima ved 0.8l, 1.20, 3.2, 4.3 (dublett), 5.7, og

7.58 deler per million.

Eksempel VI

17°t-fenylacetatet av forbindelse S omdannes på samme måte som i eksempel IV i rystede kulturer av Curvularia geniculata, og omdannelsen kontrolleres, også som i eksempel IV. I alle tilfellene omdannes ikke utgangsmaterialet fullstendig i løpet av 48 timer, men utelukkende til forbindelse F.

17ot-fenylacetatet av forbindelse S, som anvendes som utgangsmateriale, kan fremstilles ifølge Gardi et al., som angitt. Stoffet har følgende fysiske konstanter: smeltepunkt 205° - 207.5°C, [a]D= +49° (c = 1, kloroform).

Analyse beregnet: C 75.00 %, H 7.76

funnet: C 75.08 % s H 7.73 %.

I.R. spektrum: bånd ved 3500, 1730, 1715, 1668, 1615*1495 og 1453 cm<-1>. NMR spektrum: maksima ved 0.64, 1.17, 3.63, 4.15, 5.76 og 7.3 deler per million.

Eksempel VII

17a-cykloheksankarboksylsyreesteren av forbindelse S om-

dannes til kulturer av Curvularia lunata og omdannelses forløpet kontrolleres på den måte som er beskrevet i eksempel IV. I alle tilfellene omdannes substratet fullstendig i løpet av 48 timer til Ifa-cykloheksansyreesteren av hydrocortison og spor av hydrocortison.

Substratet kan prepareres på den måten som er beskrevet

av Gardi et al., som nevnt. I foreliggende tilfelle ble stoffene oppnådd i en amorft tilstand.

I.R. spektrum: bånd ved 3500, 1726, 1668 og 1617 cm<-1>.

Eksempel VIII

Fremgangsmåten er den samme som beskrevet i eksempel IV, men det benyttede utgangsprodukt er 17a-kapronatet av forbindelse S.

Etter 48 timers inkubering, er substratet nesten fullstendig omdannet, nemlig ved en pH over 7 utelukkende til hydrocortison og ved en pH under 6 til hydrocortison 17<*-kapronat.

Utgangsproduktet kan fremstilles på den måte som er beskrevet av Gardi et al., som nevnt. Stoffet har følgende fysiske konstanter: Smeltepunkt 100° - 105°C, [tx]D= +39.6 (c = 1 i kloroform).

I.R. spektrum: bånd ved 3500, 1730, 1668 og 1615 cm"<1>.

NMR spektrum: maksima ved 0.70, 0.95, 1.20, 2.30, 4.28 (dublett) og 5.73 deler per million.

Eksempel IX

10 kulturer av Curvularia lunata fremstilles som beskrevet

i eksempel III, i Erlenmeyer-kolber med en kapasitet på 2000 cm^,

som hver inneholder 500 ml kulturmedium. Etter 18 timers rysting ved 26°C, tilsettes 5 cm^ av en vandig suspensjon inneholdende 100 mg 17a-acetoksyprogesteron til hver av de rystede kolber. Kulturene blir deretter inkubert i 48 timer under de ovenfor omtalte betingelser. Papirkromatografi viser at substratet er fullstendig omdannet til i alt vesentlig et produkt og en liten mengde biprodukter som ikke iden-tifiseres .

Kulturene ekstraheres med et like stort volum metylisobutylketon. Ekstraktet vaskes med fortynnet natriumhydroksydoppløs-ning og vann, behandles deretter med aktivt karbon og fordampes så

til tørrhet med forminsket trykk.

Resten krystalliseres fra etylacetat. Utbytte 0.88 g. Papirkromatogrammer viser at dette er llg-hydroksy-17cx-acetoksyprogesteron med en meget liten mengde polare urenheter. Ved fornyet be-handling med aktivt karbon og omkrystallisering fra metanol, oppnåes 0. 74 g ren ll3-hydroksy-17a-acetoksyprogesteron med følgende fysiske konstanter:

Smeltepunkt 257° - 259°C.

Analyse: Beregnet: C 71.10 5?, H 8.30 % s

Funnet: C 71.02 %, H 8.16 %. '

1. R. spektrum: bånd ved 3620, 1732, 1718, 1666, 1620 og 865 cm<-1>.

NMR spektrum: maksima ved 0.92, 1.46, 2.03, 2.08 og 5.70 deler per million.

For å fastslå strukturen forsåpes 250 g av produktet' ved oppløsning i 25 cm 3 metanol og 25 cnr 3 av en 4 % oppløsning av kalium-hydroksyd i metanol, idet oppløsningen får anledning til å stå i 15 timer ved romtemperatur. Oppløsningen nøytraliseres med 1 cm^ is-eddik og inndampes til tørrhet under forminsket trykk. Resten krystalliseres fra 5 cm^ metanol og 5 cm^ vann. Utbytte 203 mg. Etter omkrystallisering fra en meget liten mengde kloroform, oppnåes 185 mg ren 113,17ot-dihydroksyprogesteron med et smeltepunkt på 222° - 224°C. Det infrarøde spektrum av dette produkt er identisk med det til auten-tisk 113,17ot-dihydroksyprogesteron. Det blandede smeltepunkt viser ingen smeltepunktsnedsettelse.

17a-acetoksyprogesteron som anvendes som utgangsmateriale er beskrevet i J.Am.Chem.Soc. 75, 3489 (1953).

Eksempel X

17a-acetatet av 6a-fluor-l6a-metyl-17a,21-dihydroksy-4-pregnen-3,20-dion omdannes i rystede kulturer av Curvularia lunata,

og omdannelsesforløpet kontrolleres på den måten som er beskrevet i eksempel IV.

I alle tilfellene dannes utelukkende 6a-fluor-l6a-metyl-113,17a,21-trihydroksy-4-pregnen-3,20-dion og dets 17a-acetat.

Det tilsatte 17a-acetat av 6a-fluor-l6a-metyl-17a,21-di-hydroksy-4-pregnen-3,20-dion har følgende konstanter:

Smeltepunkt: 188° - 190°C.

Analyse: Beregnet: C 68.55 %, H 7.91 %

Funnet: C 68.41 %, H 7.89 %.

Eksempel XI

17a,21-diacetatet av 6a-fluor-l6a-metyl-17a,21-dihydroksy--4-pregnen-3,20-dion-forbindelsen omdannes i rystede kulturer av Curvularia lunata, og omdannelsesforløpet kontrolleres på den måten som er beskrevet i eksempel IV. I alle tilfeller dannes utelukkende 6a-

fluor-l6a-metyl-113,17a,21-dihydroksy-4-pregnen-3,20-dion og dens 17a-acetat.

Det tilsatte 17a,21-diacetat av 6a-fluor-l6a-metyl-17a,21-dihydroksy-4-pregnen-3i20-dion kan tilveiebringes ved hjelp av den metode som er beskrevet av R.B. Turner, J.Am.Chem.Soc. 75 (1953) 3489, og har følgende fysiske konstanter:

Smeltepunkt 226.5° - 228.5°C, E<1>^ ved 236 my i metanol = 350.

lem

Elementanalyse: Beregnet: C 67.51 %, H 7.62 %

Funnet: C 67.54 %, H 7.53 *.

I.R. spektrum: bånd ved 1735-1728, 1682, 1668, 1625 og 879 cm"<1>.

NMR spektrum: maksima ved 0.81, 0.98 (dublett), 1.20, 2.14, 2.17, 4.78, og 6.08 deler per million.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av llfj,17a-dihydroksysteroider tilhørende pregnanrekken ved hydroksylering av i 11-stilling usubstituerte steroider tilhørende pregnanrekken, ved hjelp av enzymer fra fungi tilhørende slekten Curvularia, karakterisert ved at 17ot-acyloksy-steroider tilhørende pregnanrekken underkastes hydroksylering, hvoretter, om ønsket, 17a-acyloksygruppen hydrolyseres på i og for seg kjent måte.