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Verfahren zur Herstellung von neuen 16-Methylensteroiden
Es wurde gefunden, dass eine Reihe von 16-Methylen-steroiden eine sehr gute entzündungshemmende Wirkung besitzt, die z. B. die Wirkung des Hydrocortisons weit übertrifft. Diese Verbindungen besitzen die allgemeine Formel A :
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worin R- < x-H, ss-OH oder = 0, X = H oder F bedeutet und die in l, 2-Stellung eine weitere Doppel- bindung enthalten können.
Es wurde gefunden, dass man diese Steroide aus 16-Methylen-17ct-hydroxy-progesteron herstellen kann.
Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung von 16-Methylen- - steroide, welches darin besteht, dass man 16-Methylen-17cc-hydroxy-progesteron (I) oder dessen 1-De- hydro-derivat (II) mit 11-hydroxylierenden Mikroorganismen behandelt, wobei sich 16-Methylen-ll, 17a. - - dihydroxy-progesteron (III) bzw. dessen 1-Dehydro-derivat (IV) bildet. Sofern man von Verbindung I ausgeht, kann vor oder nach dieser Hydroxylierung durch Einwirkung von in 1, 2-Stellung dehydrierend wirkenden Mitteln das entsprechende 1-Dehydro-derivat (II oder IV) erhalten werden.
Zur Herstellung der entsprechenden 9a-Fluorverbindungen behandelt man das 16-Methylen-ll, 17Ct' : -dihydroxy-progeste- ron (III) oder dessen 1-Dehydroderivat (IV) mit einem üblichen Dehydratisierungsmittel und anschliessend, gegebenenfalls nach Veresterung der 17a-Hydroxylgruppe, nacheinander mit unterbromiger oder unter- chloriger Säure, einem halogenwasserstoffabspaltenden Mittel und Fluorwasserstoff. Die 17-Acyloxy- gruppe kann auf einer beliebigen Reaktionsstufe wieder verseift werden.
Ferner kann auf einer beliebigen Reaktionsstufe mit einem üblichen, in 1,2-Stellung dehydrierend wirkenden Mittel eine l, 2-Doppelbindung eingeführt werden. In den entsprechenden Zwischen- oder
Endprodukten kann die 11-Hydroxylgruppe nach an sich bekannten Oxydationsverfahren in eine 11-Keto- gruppe umgewandelt werden (Verbindungen XIX, XX bzw. XVII, XVIII). Auf die angegebene Weise ent- stehen die Verbindungen der allgemeinen Formel A.
In dem in den Zeichnungen angegebenen Reaktionsschema ist eine bevorzugte Ausführungsform des
Verfahrens nach der Erfindung dargestellt.
Die mikrobiologische Hydroxylierung der Verbindungen I bzw. II zu den 11-Hydroxy-steroiden III bzw. IV kann mit den für diese Umsetzung gebräuchlichen Mikroorganismen durchgeführt werden, z. B.
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mit Mikroorganismen der Gattungen Curvularia, Mucor, Streptomyces, Aspergillus, Fusarium, pencillium, Rhizopus und Bacillus sowie mit andern Gattungen der Ordnung Mucorales.
In die in l, 2-Stellung gesättigten Verbindungen kann auf einer beliebigen Reaktionsstufe durch Behandlung mit dehydrierend wirkenden Mitteln eine l, 2-Doppelbindung eingeführt werden. Die Dehydrierung kann auf chemischem oder mikrobiologischem Wege erfolgen. Als chemisches Dehydrierungsmittel ist z. B. 2, 3-Dichlor-5, 6-dicyan-p-benzochinon geeignet. Die Dehydrierung wird vorteilhaft in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels, wie z. B. Dioxan, Benzol, Essigester, t-Butanol usw., durchgeführt. Die Reaktionszeiten bei dieser Umsetzung liegen zwischen 4 und 20 h, wobei das Reaktionsgemisch unter Rückfluss erhitzt wird.
Zur Einführung der 1. 2-Doppelbindung auf mikrobiologischem Wege können alle hiefür gebräuchlichen Mikroorganismen verwendet werden. Besonders geeignet sind Bacillus sphaericus var. fusiformis und Corynebacterium simplex. Die Umsetzungen erfolgen je nach Mikroorganismus in etwa 4 - 24 h. Zweckmässigerweise arbeitet man bei Temperaturen von etwa 24 bis 400C. Die 1, 2-Dehydrierungsprodukte lassen sich aus dem Gärmedium durch Extraktion mit Chloroform gewinnen. Nach üblicher Aufarbeitung werden die Substanzen aus dem Chloroformextrakt in kristalliner Form isoliert.
Die 11-Hydroxy-steroide III bzw. IV können durch Behandlung mit einem dehydratisierend wirkenden Mittel in die entsprechenden, in 9, 11-Stellung ungesättigten Derivate V bzw. VI umgewandelt werden. Je nachdem, ob man von einem llct-oder llss-Hydroxy-steroid ausgeht, wendet man eine der üblichen cis- oder trans-Dehydratisierungsmethoden an. Bei der cis-Dehydratisierung kann z. B. die 11a-Hydroxylgruppe verestert und anschliessend thermisch oder durch basische Mittel die entsprechende Säure abgespalten werden. Geht man von einem 110-Hydroxy-steroid aus, so erfolgt bei Verwendung von Phosphoroxychlorid oder Thionylchlorid in Pyridin eine glatte trans-Dehydratisierung.
Zweckmässigerweise wird vor der Anlagerung von unterbromiger bzw. unterchloriger Säure an die 9, 11-Doppelbindung der so erhaltenen 16-Methylen-9, l1-dehydrosteroide (V bzw. VI) die 17-Hydroxylgruppe verestert. Dadurch lassen sich Nebenreaktionen, z. B. eine Anlagerung der unterhalogenigen Säure an die exocyclische 16-Methylengruppe, vermeiden. Die Acylierung erfolgt unter üblichen Bedingungen.
Vorzugsweise verwendet man als Acylierungsmittel niedere Alkancarbonsäuren bzw. ihre zur Veresterung geeigneten Derivate. Besonders gute Ausbeuten lassen sich bei Verwendung von Essigsäureanhydrid und Essigsäure in Gegenwart von geringen Mengen p-Toluolsulfonsäure erzielen. Das so erhaltene 16-Methy- len-17ot-acyloxy-9,. 1l-dehydro-progesteron (VII) bzw. dessen 1-Dehydroderivat (VIII) kann durch Behandlung mit unterchloriger oder unterbromiger Säure bzw. mit Mitteln, die unterbromige bzw. unterchlorige Säure liefern, wie z. B. N-Brom-acetamid, N-Brom-succinimid, N-Chlor-acetamid, N-Chlor- - succinimid, in das entsprechende 9a : -Biom- bZ'Vi. 9a-Chlor-1l8-hydroxy-steroid (IX bzw. X) überführt werden.
Zweckmässig setzt man bei dieser Reaktion eine geringe Menge einer starken Säure, vorzugsweise Perchlorsäure, zu. Wendet man einen Überschuss an unterhalogeniger Säure an, so können die primär gebildeten 9a-Halogen-llss-hydroxy-steroide in die entsprechenden 9a-Halogen-11-keto-verbin- dungen umgewandelt werden.
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bzw. XII) umgewandelt werden. Als alkalisches Mittel kann Alkaliacetat oder gegebenenfalls Pyridin verwendet werden.
Die Aufspaltung der 9ss, 11ss-Oxido-steroide XI bzw. XII zu den. 9tX-Fluor-118-hydroxy-steroiden XV bzw. XVI gelingt durch Behandlung mit Fluorwasserstoff, vorzugsweise bei tiefen Temperaturen sowie in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels, wie z. B. Tetrahydrofuran oder Chloroform oder einem andern chlorierten Kohlenwasserstoff.
Die Verseifung der 17a- Acyloxygruppe kann vor oder nach der Aufspaltung des 9ss llss-Epoxyds mit Fluorwasserstoff zu den Verbindungen XIII, XIV bzw. XV, XVI durchgeführt werden. Als Verseifungsmittel eignen sich die üblichen, für derartige Verseifungen verwendeten alkalischen Substanzen, wie z. B.
Natriumhydroxyd oder Natriumcarbonat.
Die nach der Erfindung erhaltenenll-Hydroxy-steroide können durch an sich übliche Behandlung mit einem milden Oxydationsmittel in die entsprechenden ll-Keto-steroide (XVII bzw. XVIII) umgewandelt werden. Als Oxydationsmittel sind z. B. ein Gemisch von Chromsäure anhydrid in Pyridin, Chromschwefelsäure in Aceton oder unterhalogenige Säure geeignet.
Sämtliche im Reaktionsschema aufgeführten Verbindungen sind bisher in der Literatur nicht beschrieben worden.
Das als Ausgangsmaterial benötigte 16-Methylen-17ct-hydroxy-progesteron (I) kann z. B. au !
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16-Methyl-pregnadienolon-acetat hergestellt werden. Diese Verbindung lässt sich durch Behandlung mit Wasserstoffperoxyd in alkalischem Medium und anschliessende Oxydation nach Oppenauer in 16α,17α- -Oxido-16ss-methyl-4-pregnen-3,20-dion umwandeln. Durch Aufspaltung des Epoxydringes mit einer starken Säure in einem inerten Lösungsmittel, z. B. mit p-Toluolsulfonsäure in Benzol, erhält man daraus 16-Methylen-17α-hydroxy-progesteron.
Die neuen Verbindungen nach der Erfindung können als Arzneimittel in der Humanmedizin verwendet werden. Sie eignen sich insbesondere zur lokalen äusseren Anwendung und können als Puder, Salben, Lösungen, Emulsionen oder Lotionen verarbeitet werden, wobei die üblichen Hilfsstoffe zugesetzt werden können.
Beispiel 1 : a) 11ss-Hydroxylierung von I
In einem Kleinfermenter werden 15 l einer Nährlösung aus 50/0 Malzextrakt, 1% Saccharose, 0, 2% Natriumnitrat, 0, 1% Dikaliumphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0, 05% Kaliumchlorid und 0, 005% Eisen (II)-sulfat (PH eingestellt auf 7, 0) mit 800 ml einer Schüttelkultur von Curvularia lunata (Wakker) Boadijn beimpft und unter starker Belüftung und Rührung bei 280C bebrütet. Nach 24stündigem Wachstum werden 5, 1 g 16-Methylen-4-pregnen-17α-ol-3,20-dion (I), in 40 ml Dimethylformamid zugesetzt.
Wenn die Umsetzung beendet ist, wird die Kultur mit Chloroform erschöpfend extrahiert. Die Extrakte werden eingeengt und über eine Säule aus aktiviertem Kieselgel gegeben. Aus den mittleren Chromatographiefraktionen wird das reine 16-Methylen-4-pregnen-llB, 17oc-diol-3, 20-dion (III, llss-OH) erhal-
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b) 1,2-Dehydrierung von m
In einem Kleinfermenter werden 15 l Nährlösung aus 10/0 Hefeextrakt (PH 6, 8) mit 0, 5 l Schüttelkultur von Bacillus sphaericus (Sammlung E. Merck Nr. 1001) beimpft.
Die Kultur erhält unter ständigem
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7. 5und die vereinigten Extrakte werden eingedampft, wobei das 16-Methylen-1, 4-pregnadien-llss, 17a-diol- - 3, 20-dion (IV) auskristallisiert. Fp.. = 238-241 C. [α]D = -37,5 (Chloroform); #max = 243,5 m ;
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Beispiel 2 : a) Mikrobiologische 11α-Hydroxylierung von I
In einem Kleinfermenter werden 15 l einer Nährlösung aus 5% Glukose, 0, 1% Hefeextrakt, 0, 05% Sojamehl, 0,3% Natriumnitrat, 0,5% Magnesiumsulfat, 0,001% Eisen (II)-sulfat, 1/30 m Phosphatpuffer nach Sörensen (PH 5, 6) mit 800 ml Schüttelkultur von Fusarium sp. (Sammlung E. Merck Nr. 2083) beimpft und unter starker Belüftung und Rührung bei 28 C bebrütet. Nach 24stündigem Wachstum werden 5 g 16-Methylen-4-pregnen-17α-ol-3,20-dion (1) in 40 ml. Dimethylformamid zugesetzt. Nach 48 h weiterer Bebrütung unter den gleichen Bedingungen wird die Kultur dreimal mit Chloroform ausgeschüttelt. Die vereinigten Extrakte werden getrocknet und eingedampft.
Aus dem Rückstand kristallisiert das
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b) Dehydratisierung von III
9, 2 g 16-Methylen-4-pregnen-11α,17α-diol-3,20-dion (III, llfc-OH) werden in 40 ml Chloroform und 55 ml Pyridin gelöst und unter Eiskühlung und Schütteln mit 11, 2 g p-Toluolsulfonsäurechlorid versetzt. Das Reaktionsgemisch bleibt über Nacht stehen, wird dann in Wasser eingegossen, mit Chloroform
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Methanol umkristallisiert. Fp. c) Acetylierung von V
Zu der Lösung von 20 g 16-Methylen-4,9(11)-pregnadien-17α-ol-3,20-dion (V) in 200 ml Eisessig werden 40 ml Essigsäureanhydrid und 2 g p-Toluolsulfonsäure zugefügt. Das Gemisch bleibt 18 h bei Zimmertemperatur stehen und wird dann unter kräftigem Rühren langsam in Wasser eingegossen. Das rohe
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d) Anlagerung von unterbromiger Säure an VII 5 g 16-Methylen-17α-acetoxy-4,9(11)-pregnadien-3,20-dion (VII) werden in 155 ml Dioxan und
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e) Herstellung des 9. 11-Epoxyds XI
Das rohe 16-Methylen-9α-brom-4-pregnen-11ss, 17α-diol-3,20-dion-17-acetat (IX) wird in 250 ml Alkohol gelöst. Die Lösung wird mit 12 g trockenem Kaliumacetat versetzt und 2 h unter Rückfluss gekocht.
Unter Rühren giesst man die Mischung in Wasser ein und schüttelt die entstehende Emulsion mehr-
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nol gelöst. Durch Kochen unter gleichzeitigem Einleiten von Stickstoff wird die Lösung sauerstofffrei gemacht. Eine ebenfalls sauerstofffreie Lösung von 0, 101 g Natriumhydroxyd in 2, 4 ml Wasser wird zugesetzt und das Gemisch 5 min unter Rückfluss gekocht. Die Lösung wird in mit Schwefelsäure angesäuertes Wasser eingerührt und der ausgefallene Niederschlag abgesaugt.
Das rohe 16-Methylen-9ss, llss-oxido-
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g) Aufspaltung von XIII mit Fluorwasserstoff
6,8 g 16-Methylen-90, llss-oxido-4-pregnen-17cc-ol-3, 20-dion (XIII) werden in 68 ml absolutem Chloroform gelöst und auf -600C abgekühlt. Die Lösung wird mit 41, 4 ml einer Mischung aus 40 ml Tetrahydrofuran, 15 ml Chloroform und 36 g Fluorwasserstoff versetzt, 4 h bei -300C stehengelassen und dann in Natriumhydrogencarbonatlösung eingegossen. Das Gemisch wird mehrfach mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformextrakte werden getrocknet und eingedampft.
Der aus rohem 9a-Fluor-
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480. hl) Mikrobiologische Dehydrierung von XV
Analog Beispiel 1 b) werden 7, 8 g 9α-Fluor-16-methylen-4-pregnen-11ss, 17α-diol-3,20-dion (XV)
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4-pregnadien-llss, 17ct-diol-3. 20-dion2,3-Dichlor-5,6-dicyan-p-benzochinon in 50 ml Dioxan gelöst. Das Gemisch wird 8 h unter Rückfluss gekocht, dann mit Chloroform verdünnt und nacheinander mit Wasser, 22 ml ln-Natronlauge und wieder Wasser ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen und Eindampfen der Lösung wird das in Beispiel 2 hl) beschriebene 9α-Fluor-16-methylen-1, 4-Pregnadien-11ss-17α-diol-3,20-dion (XVI) erhalten.
Beispiel 3 : a) Mikrobiologische 1. 2-Dehydrierung von I
Analog Beispiel 2 h) oder 2 h) werden 8,0 g 16-Methylen-4-pregnen-17o !-ol-3, 20-dion (I) zu 16-Methylen-1,4-pregnadien-17α-ol-3,20-dion (II) dehydriert. b) Mikrobiologische llss-Hydroxylierung von II
Analog Beispiel 1 a) wird aus 16-Methylen-1, 4-pregnadien-17α-ol-3,20-dion (II) das 16-Methylen- -1,4-pregnadien-11ss, 17α-diol-3, 20-dion (IV, 11ss-OH) hergestellt, identisch mit dem nach l b) erhaltenen Produkt.
Beispiel 4 : a) Oxydation von III
2, 3 g 16-Methylen-4-pregnen-11α,17α-diol-3,20-dion (III, 11α-OH) werden in 23 ml absolutem Pyridin gelöst und bei 00 mit einem Gemisch aus 2, 3 g Chromsäureanhydrid und 23 ml Pyridin versetzt.
Nach 12 h wird das Reaktionsgemisch in 250 ml Essigester eingegossen, der Niederschlag abgesaugt und mit Essigester gut gewaschen. Die vereinigten Essigesterlösungen werden eingeengt, wobei das 16-Me- thylen-4-pregnen-17α-ol-3,11,20-trion (XIX) auskristallisiert. #max = 238 m .
Ebenso kann das 16-Methylen-4-pregnen-11ss,17α-diol-3,20-dion (III, 11ss-OH) zu 16-Methylen- -4-pregnen-17α-ol-3,11,20-trion (XIX) oxydiert werden.
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b) Oxydation von XV
4, 2 g 9a-Fluor-16-methylen-4-pregnen-11ss-17a-diol-3, 20-dion (XV) werden in 50 ml absolutem Pyridin gelöst und bei 00 mit einem Gemisch aus 4, 2 g Chromsäureanhydrid und 42 ml Pyridin versetzt.
Nach 12 h wird das Reaktionsgemisch in 500 ml Essigester eingegossen, der Niederschlag abgesaugt und mit Essigester gut gewaschen. Die vereinigten Essigesterlösungen werden eingeengt ; dabei kristallisiert das 9a-Fluor-16-methylen-4-pregnen-17 < x-ol-3, 11, 20-trion (XVII) aus.
c) Oxydation von XVI
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handen sein kann, dadurch gekennzeichnet, dass man 16-Methylen-17cx-hydroxyprogesteron (I) durch Behandlung mit einem 11-hydroxylierenden Mikroorganismus, wie einen Mikroorganismus der Gattungen Curvularia, Mucor, Streptomyces, Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Rhizopus, Bacillus und Mucorales, in 16-Methylen-ll, 17cx-dihydroxy-progesteron (III) umwandelt und dass man diese Verbindung (III) zur
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chinon oder Corynebacterium simplex oder Bacillus sphaericus, eine 1, 2-Doppelbindung einführt und/ oder eine 11-Hydroxylgruppe durch Behandlung mit einem milden Oxydationsmittel in eine 11-Ketogruppe umwandelt.