DE1213402B

DE1213402B - Verfahren zur Herstellung von 16-Chlor-methylen- bzw. -Fluormethylen-steroiden

Info

Publication number: DE1213402B
Application number: DEM49747A
Authority: DE
Inventors: Dipl-Chem Dr Karl-Heinz Bork; Dipl-Chem Dr Klaus Brueckner; Dr Harald Metz; Dipl-Chem Dr Fritz Von Werder
Original assignee: E Merck AG
Current assignee: Merck KGaA
Priority date: 1961-07-20
Filing date: 1961-07-20
Publication date: 1966-03-31

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. CL:

C07c

Deutsche Kl.: 12 ο-25/06

Nummer: 1 213 402

Aktenzeichen: M 49747 IV b/12 ο

Anmeldetag: 20. Juli 1961

Auslegetag: 31. März 1966

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 16-Chlormethylen- bzw. -Fluormethylensteroiden der allgemeinen Formel I

CH₂R

R = OH oder eine O-Acylgruppe; R2 = H, a- oder /J-OH oder =0; X = Cl oder F;
Y = H oder CH₃.

Es wurde gefunden, daß man diese Substanzen herstellen kann, indem man nach an sich bekannten Methoden ein 16-Chlormethylen- oder 16-Fluormethylen-zl⁴-3-keto-steroid der allgemeinen Formel

CH₂Ri

CHX

Ri = H, OH oder eine O-Acylgruppe; X und Y haben die angegebene Bedeutung;

CH₂Ri

Verfahren zur Herstellung von 16-Chlormethylen- bzw. -Fluormethylen-steroiden

Anmelder:

E. Merck Aktiengesellschaft,

Darmstadt, Frankfurter Str. 250

Als Erfinder benannt:

Dipl.-Chem. Dr. Karl-Heinz Bork,

Griesheim bei Darmstadt;

Dipl.-Chem. Dr. Klaus Brückner,

Dr. Harald Metz,

Dipl.-Chem. Dr. Fritz von Werder, Darmstadt

in lla- oder 11/S-Stellung fermentativ hydroxyliert, das erhaltene 1 l-Hydroxy-steroid gegebenenfalls mit einem milden Oxydationsmittel zu dem entsprechenden ll-Keto-steroid oxydiert und daß man auf einer beliebigen Verfahrensstufe ein für Ri stehendes Wasserstoffatom nach an sich bekannten chemischen Methoden in eine O-Acyl- bzw. OH-Gruppe überführt, gegebenenfalls nach an sich bekannten chemischen oder mikrobiologischen Methoden in 1(2)-Stellung eine Doppelbindung einführt und gegebenenfalls nach an sich bekannten Methoden eine in der erhaltenen Verbindung vorhandene 21-O-Acylgruppe alkalisch verseift bzw. einen etwa erhaltenen 21-Alkohol verestert oder in ein Estersalz überführt.

Die Grundstufen des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich durch folgendes Reaktionsschema charakterisieren:

CH₂Ri

CHX

CH₂R

CHX

609 540/430

R, Ri, X und Y haben die angegebene Bedeutung. Die punktierte Linie in 1(2)-Stellung soll zum Ausdruck bringen, daß dieselbe Reaktion auch mit den 1-Dehydroderivaten erfolgen kann.

Zur Einführung einer Ha- oder llß-ständigen Hydroxylgruppe in das als Ausgangsmaterial verwendete 11-Desoxy-steroid sind z. B. folgende Mikroorganismen geeignet:

11/S-Hydroxylierung

Arten aus folgenden Gattungen: Absidia, Acrothecium, Botrytis, Cephalothecium, Chaetomella, Colletotrichum, Coniothyrium, Corticium, Cunninghamella, Curvularia, Dothichiza, Epicoccum, Mucor, Pycnosporium, Rhodoseptoria, Spondylocladium, Stachylidium, Streptomyces, Thamnidium, Trichothecium.

1 la-Hydroxylierung

Arten aus folgenden Gattungen: Absidia, Aspergillus, Cephalothecium, Cercospora, Coryneum, Cunninghamella, Dactylium, Delacroixia, Eurotium, Fusarium, Gloeosporium, Glomerella, Helicostylum, Metarrhizium, Mucor (und andere Gattungen der Ordnung Mucorales), Neurospora, Penicillium, Pestalotia, Rhizopus, Sporotrichium, Trichoderma, Trichothecium, Bacillus.

Die Fermentation wird nach den üblichen Methoden durchgeführt und benötigt je nachdem, welches Ausgangsmaterial benutzt wurde und welcher Mikroorganismus zur Anwendung kommt, etwa 10 bis 48 Stunden. Das anfallende H-Hydroxy-steroid wird aus dem Reaktionsgemisch durch Extraktion mit einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise mit Chloroform oder Methylenchlorid, extrahiert.

Zur Oxydation des erhaltenen 11-Hydroxy-steroids in das entsprechende 11-Keto-steroid werden milde Oxydationsmittel benutzt. Beispielsweise kann man dafür Chromsäureanhydrid in Eisessig oder ein Gemisch aus Chromsäureanhydrid und Pyridin oder Chromschwefelsäure in Aceton oder unterchloride bzw. unterbromige Säure verwenden. Die so hergestellten 11-Keto-steroide können in üblicher Weise aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden, beispielsweise durch Extraktion oder durch Ausfällung mit Wasser.

Nach dem Verfahren der Erfindung wird, falls Ri im Ausgangssteroid ein Wasserstoffatom bedeutet, auf einer beliebigen Verfahrensstufe dieses für Ri stehende Wasserstoffatom durch an sich bekannte chemische Methoden in eine O-Acyl- bzw. OH-Gruppe umgewandelt. Zu diesem Zweck wird das betreffende Steroid, das in 21-Stellung keine Sauerstoffunktion enthält, mit einer alkalischen Jodlösung, vorzugsweise mit einem Gemisch aus Jod und Calciumoxyd, behandelt und danach das dabei erhaltene 21-Jodsteroid durch Umsetzung mit einem Alkaliacylat, vorzugsweise Kaliumacetat, in das entsprechende 21-O-Acyl-steroid übergeführt. Durch übliche alkalische Verseifung der erhaltenen 21-O-Acylverbindung, beispielsweise mit Natriumhydrogencarbonat, erhält man die freien 21-AlkohoTe.

Eine Eventualstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Einführung einer l(2)-ständigen Doppelbindung auf einer beliebigen Verfahrensstufe. Diese Dehydrierung kann nach an sich bekannten chemischen oder mikrobiologischen Methoden durchgeführt werden. Als chemisches Dehydrierungsmittel kann man z. B. Selendioxyd verwenden. Dabei arbeitet man z. B. in tert.-butanolischer Lösung und setzt geringe Mengen Essigsäure zu. Die Umsetzung führt man zweckmäßigerweise durch Kochen des. Reaktionsgemisches unter Rückfluß durch. Das ausgefallene Selen wird abgetrennt. Im Filtrat ist das gebildete 1(2)-Dehydrierungsprodukt enthalten.

Für die chemische 1(2)-Dehydrierung ist ferner 2,3-Dichlor-5,6-dicyan-p-benzochinon geeignet. Dabei arbeitet man vorteilhaft in Benzol- oder Dioxanlösung. ι.

Zur Einführung einer l(2)-ständigen Doppelbindung auf mikrobiologischem Wege können z. B. Arten folgender Gattungen verwendet werden: Alternaria, Didymella, Calonectria, Colletotrichum, Cylindrocarpon, Fusarium, Ophiobolus, Septomyxa, Vermicularia; Acetobacter, Aerobacter, Alcaligenes, Bacillus (besonders Bacillus sphaericus), Corynebacterium (besonders Corynebacterium simplex), Erysipelothrix, Listeria, Micromonospora, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Pseudomonas, Streptomyces.

Die Fermentation benötigt etwa 4 bis 14 Stunden, je nachdem, welcher Mikroorganismus verwendet wird. Besonders geeignet sind Kulturen von Bacillus sphaericus var. fusiformis und Corynebacterium simplex.

In die geschilderten mikrobiologischen Prozesse können die in Frage stehenden Steroide auch in Form ihrer 21-O-Acylverbindungen eingesetzt werden. Dabei ist es möglich, daß der Mikroorganismus gleichzeitig die 21-O-Acylgruppe in eine 21-OH-Gruppe umwandelt.
Falls erwünscht, kann anschließend die 21-OH-Gruppe nach an sich bekannten und üblichen Methoden wieder verestert werden. Als Veresterungsmittel sind alle diejenigen Säuren bzw. deren zur Veresterung geeigneten Derivate verwendbar, die physiologisch verträgliche Ester, ergeben. Zum Beispiel können die folgenden Säuren oder deren zur Veresterung geeignete Derivate verwendet werden: Carbonsäuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Trimethylessigsäure, tertButylessigsäure, Cyclopentylpropionsäure, Phenylpropionsäure, Phenylessigsäure, Capronsäure, Caprylsäure, Palmitinsäure, Undecylensäure, aber auch Benzoesäure oder Hexahydrobenzoesäure, sowie Halogencarbonsäuren, wie Chloressigsäure. Gegebenenfalls kann man auch zwecks Herstellung wasserlöslicher Derivate die 21-Hydroxylgruppe mit Dicarbonsäuren, Amino- oder Alkylaminocarbonsäuren oder mit Phosphor- oder Schwefelsäure verestern. Auf diese Art lassen sich z.B. herstellen: Succinate, Oxalate oder die Säureadditionssalze von Aminocarbonsäureestern, z. B.

von Asparaginsäure- oder Diäthylaminoessigsäureestern.

Nach dem Verfahren der Erfindung werden beispielsweise die folgenden Verbindungen erhalten: . Die 16-Chlormethylen- und 16-Fluormethylenderivate des Hydrocortisons, Cortisons, Prednisolone und Prednisons sowie deren 21-O-Acylverbindungen und die 6a-Methylderivate aller dieser Verbindungen. Als bevorzugte 21-O-Acylverbindungen, die nach dem Verfahren der Erfindung als Endprodukte erhalten werden, seien beispielsweise die' folgenden genannt: lo-Chlormethylen-prednisolon^l-acetat, 16 - Chlormethylen - prednison -21 - acetat, 16 -Fluormethylen-prednisolon-21-acetat, 16-Fluormethylen-

prednison - 21 - acetat, 16- Fluormethylen - 6α - methyl prednisolon-21 -acetat, 16-Fluormethylen-prednisolon-21 -diäthylaminoacetathydrochlorid.

Die als Ausgangsmaterial benötigten 11-Desoxysteroide können erhalten werden durch Behandlung der zugrunde liegenden loc^na-Oxido-loß-chlormethyl- bzw. -16^-fluormethyI-steroide mit Bromwasserstoffsäure in ätherischer Lösung. Für die Herstellung der verfahrensgemäß eingesetzten Ausgangssteroide wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung Schutz nicht begehrt.

Die neuen, verfahrensgemäß erhaltenen Verbindungen besitzen eine gegenüber den in 16-Stellung nicht substituierten Derivaten erhöhte corticoide Wirkung. Sie lassen sich zu allen für pharmazeutische Zwecke geeigneten Zubereitungsformen, wie beispielsweise Pillen, Tabletten, Dragees, Suspensionen, Lösungen, Injektionslösungen, Sprays, Salben, Gelees usw., verarbeiten. ·

Zum Nachweis der Überlegenheit der Verfahrensprodukte wurde die antiphlogistische Wirkung von 16-Fluormethylen-prednisolon und 16-Fluormethylen-6a-methyl-prednisolon im Vergleich zu Prednisolon und 16-Methylen-prednisolon im Granulombeuteltest an Ratten nach der in Archives Internationales de Pharmacodynamie et de Therapie, Bd. Ill, S. 420 bis 436 (1957), beschriebenen Methode bestimmt. Dabei ergaben sich die folgenden Wirkungsrelationen:

Präparat	Antiphlogistische Wirkungsrelation
Prednisolon 16-Methylen-prednisolon 16-Fluormethylen-prednisolon 1 o-Fluormethylen-oa-methyl- prednisolon	1 4,5 10 25

Wie aus der Tabelle ersichtlich, sind die verfahrensgemäß hergestellten Verbindungen 10- bzw. 25mal wirksamer als Prednisolon und etwa 2,2- bzw. 5,5mal so wirksam wie 16-Methylen-prednisolon.

Im Vergleich zu dem bekannten, an sich stärker antiphlogistisch wirksamen Dexamethason zeichnen sich die Verfahrensprodukte dadurch aus, daß sie die bekannten Nebenwirkungen dieser Verbindung (z. B^ verstärkte metabolische Einwirkungen, erhöhte Natriumretention) nicht oder nur in untergeordnetem Maße aufweisen.

Beispiel 1
a) 21-Acetoxylierung

Eine Suspension von 6,5 g 16-Chlormethylen-4-pregnen-17a-ol-3,20-dion in 98 ecm Tetrahydrofuran und 59 ecm Methanol wird innerhalb 3 Stunden portionsweise mit 9,8 g Jod und 9,8 g Calciumoxyd versetzt. Danach wird das Reaktionsgemisch in 2 1 Eiswasser, das 32 ecm Eisessig enthält, eingegossen, der Niederschlag abgesaugt und getrocknet.

Die so erhaltenen 11g rohes 21-Jodid werden in 550 ecm Aceton gelöst und zusammen mit 33 g Kaliumacetat 20 Stunden unter Rückfluß gekocht. Danach wird das Aceton zurh Teil unter vermindertem Druck abgezogen, das Gemisch mit Wasser verdünnt, der Niederschlag abgesaugt. Er wird noch feucht in einem Gemisch aus 130 ecm Methanol, 3,25 g Natriumpyrosulfit und 48,5 ecm Wasser 2 Stunden unter Rückfluß gekocht. Nach Abkühlen wird das Reaktionsgemisch mit Wasser verdünnt, der entstandene Niederschlag abgesaugt und getrocknet. Durch Umkristallisation aus Methanol erhält man daslo-Chlor-methylen-'i-pregnen-lTa^l-diol-S^O-dion-21-acetat. Schmp. 156 bis 157⁰C; X_ma,x 240ηΐμ; E₁ ¹* 434 (Äthanol); £ = 18 900; [a}%⁴ = +10,5° (Chloroform). '

b) Verseifung

12 g 16-Chlormethylen-4-pregnen-17a,21 -diol-3,20-dion-21-acetat werden in 960 ecm Methanol gelöst und mit 480 ecm 5%iger Kaliumhydrogencarbonatlösung versetzt. Das Ganze wird 3 Stunden am Rückfluß gekocht und kühl aufbewahrt. Es scheiden sich Kristalle von 16-Chlormethylen-Reichsteins-Substanz-S aus, die durch Umkristallisieren aus Aceton gereinigt werden. Schmp. 205 bis 207⁰C; Xmax 239 bis 240 πΐμ; EJ*_m 463 (Äthanol); e = 18 200; [a\l⁴ = +5° (Chloroform).

c) Mikrobiologische lla-Hydroxylierung

In einem Kleinfermenter werden 15 1 einer geeigneten Nährlösung (z. B. 5% Glukose, 0,1% Hefeextrakt, 0,05% Sojamehl, 0,3% NaNO₃, 0,05% MgSO₄ ■ 7 H₂O, 0,1% KH₂PO₄, 0,05% KCl, 0,001% FeSO₄ ■ 7 H2O) mit 750 ml einer gut gewachsenen Schüttelkultur von F.usarium sp. (Sammlung E. Merck Nr. 2083) beimpft. Die Kultur wächst unter starkem Belüften und Rühren bei 28⁰C und erhält nach 24 Stunden einen Zusatz von 5 g 16-Chlormethylen-Reichsteins-Substanz-S in 40 ml Dimethylformamid.

Die Umsetzung wird papierchromatographisch verfolgt. Wenn im Chromatogramm keine Ausgangssubstanz mehr nachweisbar ist, wird der Ansatz abgebrochen und die Kulturlösung 3mal mit 101 Chloroform extrahiert. Der vereinigte Chloroformextrakt wird eingedampft, der Rückstand mit Petroläther digeriert und aus Aceton umkristallisiert. Man erhält reines 16-Chlormethylen-ll-epi-hydrocortison.

Imax 241 Ιϋμ.

d) 21-Acetylierung

2 g lö-Chlormethylen-ll-epi-hydrocortison werden in 10 ml Pyridin gelöst und 0,36 g Essigsäureanhydrid zugegeben. Nach 15stündigem Stehen bei Zimmertemperatur wird das Gemisch in Wasser eingegossen, mit Chloroform 3mal extrahiert, die Chloroformlösung durch Schütteln mit Natriumhydrogencarbonatlösung neutralisiert, getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der amorphe Rückstand von 16-Chlormethylen-ll-epi-hydrocortison-21-acetat wird direkt in die nachfolgende Oxydation eingesetzt.

ei) Oxydation

Der im Beispiel 1, d) erhaltene Rückstand von 16 - Chlormethylen -11 - epi - hydrocortison - 21 - acetat wird in 20 ml Pyridin gelöst und zu einer Mischung aus 2 g Chromsäureanhydrid und 20 ml Pyridin gegeben. Das alsbald tief dunkelbraungefärbte Gemisch wird nach 8stündigem Stehen bei Zimmertemperatur in 150 ml warmen Essigester eingegossen, 5 Minuten am Rückfluß gekocht und abgenutscht. Nach gutem Auswaschen des voluminösen Rückstandes mit warmem Essigester werden die vereinigten

Filtrate mit verdünnter Schwefelsäure neutral gewaschen, getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand von rohem 16-Chlormethylen-cortison-21-acetat wird durch Umkristallisieren aus Methanol rein erhalten. X_ma,x 238 πΐμ, Eil 372; F. 164 bis 165°C; [a]_D = +133° (Dioxan).

es) Oxydation

2,7 g 16 - Chlormethylen -11 - epi - hydrocortison-21-acetat werden in 100 ml Aceton gelöst und auf eine Temperatur zwischen 0 und 10⁰C abgekühlt. Unter Rühren und Kühlen werden 1,92 ml einer Lösung von wäßriger Chromschwefelsäure (1 ml = 0,25 g C1O3) zugetropft (Temperatur maximal 10° C). Nach beendeter Zugabe wird das Gemisch noch 30 Minuten gerührt, dann in Wasser eingegossen und mit Chloroform ausgeschüttelt. Die Chloroformlösung wird neutral gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der rohe Rückstand von lo-Chlormethylen-cortison^l-acetat wird durch Umkristallisieren aus Äther—Aceton rein erhalten. l_max 238 m^ E}*_m 372; F. 164 bis 165°C; [a]„ = +133° (Dioxan).

h) Verseifung

f) Verseifung

25

1 g lo-Chlormethylen-cortison^l-acetat wird in 25 ml Methanol zum Sieden erhitzt, sodann zu der siedenden Lösung eine heiße Lösung von 0,23 g Natriumhydrogencarbonat in 5 ml Wasser zugegeben und das Gemisch 7 Minuten zum Sieden erhitzt. Es wird in etwa 300 ml Wasser eingegossen und das ausgefallene rohe Verseifungsprodukt abgesaugt. Nach Umkristallisieren aus Aceton wird reines 16-Chlormethylen-cortison erhalten. l_max 238 πΐμ, Eil 460; F. 215 bis 216°C; [a]„ = +107° (Dioxan).

gi) 1-Dehydrierung (mikrobiologisch)

In einem Kleinfermenter von 20 1 Inhalt werden 15 1 einer Nährlösung aus 0,1% Hefeextrakt, pH 6,8, mit 1,51 Schüttelkultur von Corynebacterium simplex (Sammlung E. Merck Nr. 1002) beimpft. Die Kultur wächst unter ständigem Rühren und starker Belüftung bei 28° C und erhält nach etwa 4 bis 8 Stunden einen Zusatz von 7,5 g 16-Chlormethylen-cortison, gelöst · in 300 ml Methanol. Die Dehydrierung wird papierchromatographisch verfolgt und ist im allgemeinen nach 10 bis 14 Stunden beendet. Die Kulturlösung wird 3mal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert, die vereinigten Chloroformlösungen werden eingedampft.- Der Rückstand wird aus Aceton umkristallisiert. Das so erhaltene 16-Chlormethylen-prednison ist frei von Nebenprodukten. l_max 239 πΐμ, E\f_a 400; F. 216 bis 218°C; [a]_D = +57,8° (Dioxan).

g2) 1-Dehydrierung (chemisch)

3,5 g 16-Chlormethylen-cortison-21-acetat werden in 70 ml Dioxan gelöst und mit 3,5 g 2,3-Dichlor-5,6-dicyan-p-benzochinon versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 6 Stunden unter Rückfluß gekocht, dann mit Chloroform verdünnt und nacheinander mit 30 ml 1 n-Natriumhydroxydlösung und mehrfach mit Wasser gewaschen. Die Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der aus 16-Chlormethylen-prednisonacetat bestehende Rückstand wird aus Aceton—Äther umkristallisiert. λτηαχ 239 Πΐμ.

1,5 g lo-Chlormethylen-prednison^l-acetat werden analog Beispiel 1, f) verseift unter Bildung von 16-Chlormethylen-prednison. X_ma,x 239 πΐμ, EJ*_m 400; F. 216 bis 218°C; [a]„ = +57,8° (Dioxan).

Beispiel 2
a) Mikrobiologische 1 !^-Hydroxylierung

In einem Kleinfermenter werden 15 1 einer Nährlösung aus 5% Malzextrakt, 1% Saccharose, 0,2% Natriumnitrat, 0,1% Dikaliumphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,05% Kaliumchlorid und 0,005% Eisen(II)-sulfat (pH eingestellt auf 7,0) mit 800 ml einer Schüttelkultur von Curvularia lunata (Wakker) Boadijn beimpft und unter Rühren und starker Belüftung bei 28⁰C bebrütet. Nach 24stündigem Wachstum werden 5 g 16-Chlormethylen-Reichsteins-Substanz-S [hergestellt nach Beispiel 1, b)], gelöst in 40 ml Dimethylformamid, zugesetzt. Die Umsetzung wird papierchromatographisch verfolgt. Wenn im Papierchromatogramm kein Ausgangsmaterial mehr nachweisbar ist, wird die Kulturlösung 3mal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformlösungen werden eingedampft und der Rückstand zur Entfernung der Begleitprodukte an Kieselgel chromatographiert. Das mit Chloroform—Essigester (1 : 3) erhaltene Eluat enthält das gewünschte 16-Chlormethylen-hydrocortison, das daraus in üblicher Weise gewonnen wird. Schmp. 228°C; l_max 241 bis 242 πΐμ; Ε}* 432 (Äthanol); ε = 17 660; \α\²έ = +40° (Dioxan).

b) Acetylierung

5 g 16-Chlormethylen-hydrocortison werden mit 30 ml Pyridin und 30 ml Essigsäureanhydrid 1 Stunde auf dem Dampfbad erwärmt. Das Gemisch wird in Wasser eingegossen und das ausgefallene 16-Chlormethylen-hydrocortison-21-acetat abgesaugt. Die Reinigung erfolgt durch Umkristallisieren aus Aceton. Imax 241 mm E}*_m 392; F. 228 bis 23O⁰C; [a], = +42° (Dioxan).

ei) 1-Dehydrierung (mikrobiologisch)

In einem Kleinfermenter werden 15 1 einer Nährlösung aus 1% Hefeextrakt, pH 6,8, mit 0,5 1 Schüttelkultur von Bacillus sphaericus (Sammlung E. Merck Nr. 1001) beimpft. Die Kultur wächst unter ständigem Rühren und starker Belüftung bei 28⁰C und erhält nach etwa 10 Stunden einen Zusatz von 7,5 g 16-Chlormethylen-hydrocortison, gelöst in 300 ml Methanol. Die Dehydrierung wird papierchromatographisch verfolgt und ist nach 28 bis 36 Stunden vollständig. Die Aufarbeitung erfolgt nach der im Beispiel 1, gi) angegebenen Methode. Das rohe 16-Chlormethylen-prednisolon wird durch Umkristallisieren aus Aceton rein erhalten. Schmp. 223 bis 224°C; l_max 241 bis 242πΐμ; EJi 411 (Äthanol); ε = 16 720; [α]ί⁴ = -34° (Dioxan).

ca) Chemische 1-Dehydrierung

Analog Beispiel 1, &) werden 3 g 16-Chlormethylenhydrocortison-21-acetat dehydriert. Nach dem Umkristallisieren aus Aceton—Äther erhält man reines lo-Chlormethylen-prednisolon^l-acetat. l_max 242 πΐμ, Eil 358; F. 230 bis 231°C; [a]_D = -31° (Dioxan),

d) Verseifung

Die Verseifung des 16-Chlormethylen-prednisolon-21-acetats zu 16-Chlormethylen-prednisolon erfolgt nach der gleichen Methode, wie im Beispiel 1, f) angegeben. E}· 411; F. 223 bis 224°C; [o]_o = -34° (Dioxan).

B ei sp i e1 3
Oxydation

2,4 g lo-Chlormethylen-prednisolon^l-acetat (hergestellt nach Beispiel 2) werden in 24 ml Pyridin gelöst und zu einer zuvor bereiteten Mischung von 2,4 g Chromsäureanhydrid und 24 ml Pyridin gegeben. Die Mischung wird über Nacht stehengelassen und anschließend, wie im Beispiel 1, ei) beschrieben, aufgearbeitet. Es werden 1,6 g 16-Chlormethylen-prednison-21-acetat erhalten, identisch mit dem nach Beispie¹ 1, ga) erhaltenen Produkt.

Die Oxydation kann außerdem mit guten Ausbeuten nach der im Beispiel 1, e₂) beschriebenen Verfahrensweise durchgeführt werden.

Beispiel 4
a j !-Dehydrierung

²5

7,5 g 16-Chlormethylen-Reichsteins-Substanz-S [hergestellt nach Beispiel 1, b)] werden in 15 1 einer Kulturlösung von Bacillus sphaericus, wie im Beispiel 2, ei) beschrieben, dehydriert. Nach üblicher Aufarbeitung wird durch Umkristallisieren aus Aceton reine l-Dehydro-16-chlormethylen-Reichsteins-Substanz-S erhalten. X_max 240 ΐημ.

b) Mikrobiologische lla-Hydroxylierung

In einem Kleinfermenter werden 15 1 einer Nährlösung aus 5% Glukose, 0,2% Hefeextrakt, 0,3% Natriumnitrat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,001% Eisen(II)-sulfat und ¹Z₃O Mol Phosphatpuffer nach Sörensen (pH 5,6) mit 800 ml Schüttelkultur von Penicillium sp. (Sammlung E. Merck Nr. 2168) beimpft. Die Kultur wächst unter Rühren und starker Belüftung und erhält nach 24 Stunden einen Zusatz von 5 g l-Dehydro-16-chlormethylen-Reichsteins-Substanz-S, gelöst in 40 ml Dimethylformamid. Die Hydroxylierung wird papierchromatographosch verfolgt. Nach Beendigung der Umsetzung wird aufgearbeitet entsprechend der Beschreibung im Beispiel 1, gi). Durch Umkristallisieren aus Aceton wird reines 16-Chlormethylen-ll-epi-prednisolon erhalten. Xmax 241 Πΐμ.

Hefeextrakt, 0,2% NaNO₃, 0,1% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,01% FeSO₄ · 7 H₂O, pH eingestellt auf 6,8, mit 750 ml Schüttelkultur von Penicillium sp. (Sammlung E. Merck Nr. 2168) beimpft und unter starkem Rühren und Belüften bei 28⁰C bebrütet. Nach etwa 30stündigem Wachstum werden 5 g lo-Chlormethylen-na-hydroxy-progesteron, gelöst in 300 ml Methanol, zugesetzt. Die Umsetzung wird papierchromatographisch verfolgt und ist nach etwa 15 Stunden beendet. Die Kulturlösung wird 3mal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert, die vereinigten Extrakte werden im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit Petroläther digeriert. Das ungelöste 16-Chlormethylen-4-pregnen-lla,17a-diol-3,20-dion wird isoliert und aus Essigester umkristallisiert. X_max 240 πΐμ.

b) Oxydation

2,3 g lo-Chlormethylen^-pregnen-llajna-diol-3,20-dion werden in 23 ml absolutem Pyridin gelöst und bei O⁰C mit einem Gemisch aus 2,3 g Chromsäureanhydrid und 23 ml Pyridin versetzt. Nach 12 Stunden wird das Reaktionsgemisch in 250 ml Essigester eingegossen, der ,Niederschlag abgesaugt und mit Essigester gut gewaschen. Die vereinigten Essigesterlösungen werden eingeengt, wobei das 16-Chlormethylen-4-pregnen-17a-ol-3,11,20-trion auskristallisiert. Imax 238 ΐημ.

ei) Mikrobiologische 1(2)-Dehydrierung

In einem Fermenter werden 15 1 Nährlösung aus 1% Hefeextrakt (pH 6,8) mit 0,51 Schüttelkultur von Bacillus sphaericus (Sammlung E. Merck Nr. 1001) beimpft. Die Kultur erhält unter ständigem Rühren und Belüften bei 28⁰C nach etwa 11 Stunden einen Zusatz von 7,5 g lo-Chlormethylen^-pregnen-17a-ol-3,ll,20-trion, die in 250 ml Methanol gelöst sind. Nach etwa 33 Stunden ist die Dehydrierung, die papierchromatographisch verfolgt wird, beendet. Die Fermentationsbrühe wird mit Chloroform ausgeschüttelt, die vereinigten Extrakte werden eingedampft, wobei das lo-Chlormethylen-l^-pregnadien-17a-ol-3,ll,20-trion auskristallisiert. Xmax 239 ηΐμ.

C₂) Chemische 1-Dehydrierung

11g 16 - Chlormethylen -A- pregnen - 17a - öl 3,11,20-trion werden in 660 ml tert.Butanol mit 7,2 g Selendioxyd und 5,5 ml Eisessig 48 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das ausgefallene Selen wird abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Das anfallende lo-Chlormethylen-l^-pregnadien-na-ol^ll^O-trion wird zur Reinigungüber Kieselgel filtriert. Xmax 239 πΐμ.

c) 21-Acetylierung

Analog Beispiel 1, d) wird aus 16-Chlormethylen-11-epi-prednisolon _rdas 16-Chlormethylen-ll-epiprednisoIon-21-acetat erhalten. X_max 241 πΐμ.

d) Oxydation

Analog Beispiel 1, C₂) wird aus 16-Chlormethylen ll-epi-prednisolon-21-acetat das 16-Chlormethylen prednison-21-acetat hergestellt. X_max 239 ώμ.

Beispiel 5
a) Mikrobiologische lla-Hydroxylierung

, In einem Kleinfermenter werden 15 1 einer Nährlösung aus 3% Saccharose, 1% Malzextrakt, 0,1%

d) 21-Acetoxylierung

/nalog Beispiel 1, a) kann aus 16-Chlormethylen-4-pregnen-17a-ol-3,11,20-trion das 16-Chlormethylencortison-21-acetat hergestellt werden. Xmax 238 ηαμ, E}*_m 372; F. 164 bis 165⁰C; [a]_D = +133° (Dioxan).

-60 Beispiel6

a) Mikrobiologische 11 ^-Hydroxylierung

In einem Kleinfermenter werden 15 1 einer Nährlösung aus 3% Saccharose, 1% Malzextrakt, 0,1% Hefeextrakt, 0,2% NaNO₃, 0,1% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ -.7 H₂O, 0,01% FeSO₄-7 H₂O, pH eingestellt auf 6,8, mit 750 ml einer Submerskultur von Curvularia· lunata (Wakker) Boadijn beimpft und

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I 213

unter starkem Rühren und Belüften bei 28 ⁰C bebrütet. Nach etwa 18stündigem Wachstum werden 5 g lo-Chlormethylen-na-hydroxy-progesteron, gelöst in 300 ml Methanol, zugesetzt. Die Umsetzung wird papierchromatographisch verfolgt; nach etwa 24 Stunden ist kein Ausgangsmaterial mehr nachzuweisen. Die Kulturlösung wird 3mal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand, das 16-Chlormethylen-4-pregnen-Ilftl7a-diol-3,20-dion, nach Digerieren mit Petroläther aus Essigester umkristallisiert, λτηαχ 241 Πΐμ.

b) Mikrobiologische 1(2)-Dehydrierung

In einem Fermenter, werden 15 I einer Nährlösung aus 1% Hefeextrakt (pH 6,8) mit 0,51 Schüttel- ■ kultur von Bacillus sphaericus (Sammlung E. Merck Nr. 1001) beimpft. Die Kultur erhält unter ständigem Rühren und Belüften bei 28 ⁰C nach etwa 9 Stunden einen Zusatz von 8,0 g lo-Chlormethylen^-pregnenll/S,17a-diol-3,20-dion, die in 230 ml Methanol gelöst sind. Nach etwa 25 bis 30 Stunden ist die Dehydrierung, die papierchromatographisch verfolgt wird, beendet. Die Fermentationsbrühe wird 3mal mit Chloroform ausgeschüttelt, die vereinigten Extrakte werden eingedampft, wobei das 16-Chlormethylen-l,4-pregnadien-ll/?,17a-diol-3,20-dion auskristallisiert, λτηαχ 242 Πΐμ.

c) Oxydation

Analog Beispiel 5, b) kann aus 16-Chlormethylenl,4-pregnadien-ll/S,17a-diol-3,20-dion das 16-Chlormethylen-l,4-pregnadien-17a-ol-3,ll,20-trion hergestellt werden, λτηαχ 239 πΐμ.

d) 21-Acetoxylierung

Analog Beispiel 1, a) kann aus 16-Chlormethylenl,4-pregnadien-17a-ol-3,ll,20-trion das 16-Chlormethylen - prednison - 21 - acetat erhalten werden. λτηαχ 239 Πΐμ.

e) Analog Beispiel 1, a) kann aus dem nach Stufe 6 a) erhaltenen 16-Chlormethylen-4-pregnen-11β,17α- <ίΐο1-3,20-αϊοη das 16-Chlormethylen-hydrocortison-21-acetat hergestellt werden. X_max 241 πΐμ, Ei* 392; F. 228 bis 230°C; [a]_D = +42° (Dioxan).

Beispiel 7

a) 21-Acetoxylierung

Analog Beispiel 1, a) wird aus 16-Fluormethylen-4-pregnen-17a-ol-3,20-dion das 16-Fluormethylen-4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion-21-acetat gewonnen. ^₀* 24Om₁*, EJi 428; F. 200bis202⁰C; [a]_D =+68° (Chloroform).

' b) Verseifung

12 g 16 - Fluormethylen - 4 - pregnen - 17a,21 - diol-3,20-dion-21-acetat werden in 960 ecm Methanol gelöst und mit 480 ecm 5%iger Kaliumhydrogencarbonatlösung versetzt. Das Ganze wird 3 Stunden am Rückfluß gekocht und kühl aufbewahrt. Es scheiden sich Kristalle von *. 5-Fluormethylen-Reichsteins-Substanz-S aus, die durch Umkristallisieren aus Aceton gereinigt werden, λτηαχ 240 πΐμ; F. 217 bis 218°C; [a]_D = +52° (Chloroform).

c) Mikrobiologische lla-Hydroxylierung
In einem Kleinfermenter werden 151 einer geeigneten Nährlösung (ζ. Β. 5% Glukose, 0;l% Hefeextrakt, O,O5<Vo Sojamehl, 0,3% NaNO₃, 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,1% KH₂PO₄, 0,05% KCl, 0,001% FeSO₄ · 7 H₂O) mit 750 ml einer gut gewachsenen Schüttelkultur von Fusarium sp. (Sammlung E. Merck Nr. 2083) beimpft. Die Kultur wächst unter, starkem Belüften und Rühren bei 28⁰C und erhält nach

24 Stunden einen Zusatz von 5 g 16-Fluormethylen-Reichsteins-Substanz-S in 40 ml Dimethylformamid. Die Umsetzung wird papierchromatographisch verfolgt. Wenn im Chromatogramm keine Ausgangssubstanz mehr nachweisbar ist, wird der Ansatz abgebrochen und die Kulturlösung 3mal mit 101 Chloroform extrahiert. Der vereinigte Chloroformextrakt wird eingedampft, der Rückstand mit Petroläther digeriert und aus Aceton umkristallisiert. Man erhält reines 16-Fluormethylen-ll-epi-hydrocortison. λτηαχ 241 Πΐμ.

d) 21-Acetylierung

2 g 16-Fluormethylen-ll-epi-hydrocortison werden in 10 ml Pyridin gelöst und 0,36 g Essigsäureanhydrid zugegeben. Nach 15stündigem Stehen bei Zimmertemperatur wird das Gemisch in Wasser eingegossen, .mit Chloroform 3mal extrahiert, die Chloroformlösung durch Schütteln mit Natriumhydrogencarbonatlösung neutralisiert, getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der amorphe Rückstand von 16-Fluormethylen-ll-epi-hydrocortison-21-acetat wird direkt in die nachfolgende Oxydation eingesetzt.

ei) Oxydation

Der im Beispiel 7, d) erhaltene Rückstand von 16 - Fluormethylen -11 - epi - hydrocortison - 21 - acetat. wird in 20 ml Pyridin gelöst und zu einer Mischungaus 2g Chromsäureanhydrid und 20ml Pyridin gegeben. Das alsbald tiefdunkelbraungefärbte Gemisch wird nach 8stündigem Stehen bei Zimmertemperatur in 150 ml warmen Essigester eingegossen, 5 Minuten am Rückfluß gekocht und abgenutscht. Nach gutem Auswaschen des voluminösen Rückstandes mit warmem Essigester werden die vereinigten Filtrate mit verdünnter Schwefelsäure neutral gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand von rohem lo-Fluormethylen-cortison-21-acetat wird durch Umkristallisieren aus Methanol rein erhalten. X_max 238 πΐμ.

eg) 2,7 g 16-Fluormethylen-ll-epi-hydrocortison-21-acetat werden in 100 ml Aceton gelöst und auf eine Temperatur zwischen 0 und 10° C abgekühlt. Unter Rühren und Kühlen werden 1,92 ml einer Lösung von wäßriger Chromschwefelsäure (1 ml = 0,25 g CrOe) zugetropft (Temperatur maximal 10⁰C). Nach beendeter Zugabe wird das Gemisch .noch 30 Minuten -^gerührt, .jdann in. Wasser eingegossen und mit Chloroform ausgeschüttelt. Die Chloroformlösung wird neutral gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der rohe Rückstand von 16-Fluormethylen-cortison-21-acetat wird durch Umkristallisieren aus Äther—Aceton rein erhalten. l_ma,x 238 πΐμ.

f) Verseifung

1 g lo-Fluormethylen-cortison^l-acetat ■ wird in

25 ml Methanol zum Sieden erhitzt, sodann zu der siedenden Lösung eine heiße Lösung von 0,23 g

Natriumhydrogencarbonat in 5 ml Wasser zugegeben und das Gemisch weitere 7 Minuten zum Sieden erhitzt. Es wird in etwa 300 ml Wasser eingegossen und das ausgefallene rohe Verseifungsprodukt abgesaugt. Nach Umkristallisieren aus Aceton wird reines 16-Fluormethylen-cortison erhalten. l_max 238 πΐμ.

gi) 1-Dehydrierung (mikrobiologisch)

In einem Kleinfermenter von 201 Inhalt werden 15 1 einer Nährlösung aus 0,1% Hefeextrakt, pH 6,8, mit 1,5 1 Schüttelkultur von Corynebacterium simplex (Sammlung E. Merck Nr. 1002) beimpft. Die Kultur wächst unter ständigem Rühren und starker Belüftung bei 28 ⁰C und erhält nach etwa 4 bis 8 Stunden einen Zusatz von 7,5 g 16-Fluormethylen-cortison, gelöst in 300 ml Methanol. Die Dehydrierung wird papierchromatographisch verfolgt und ist im allgemeinen nach 10 bis 14 Stunden beendet. Die Kulturlösung wird 3mal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert, die vereinigten Chloroformlösungen werden eingedampft. Der aus 16-Fluormethylenprednison bestehende Rückstand wird aus Aceton umkristallisiert. l_ma,x 239 πΐμ.

g2) 1-Dehydrierung (chemisch)

3,5 g lo-Fluormethylen-cQrtison^l-acetat werden in 70 ml Dioxan gelöst und mit 3,5 g 2,3-Dichlor-5,6-dicyan-p-benzochinon versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 6 Stunden unter Rückfluß gekocht, dann mit Chloroform verdünnt und nacheinander mit 30 ml 1 n-Natriumhydroxydlösung und mehrfach mit Wasser gewaschen. Die Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der aus 16-Fluormethylen-prednison-21 -acetat bestehende Rückstand wird aus Aceton—Äther umkristallisiert. X_max 239 Πΐμ, Ei*_m 386.

h) Verseifung

1,5 g 16-Fluormethylen-prednison-21-acetat werden analog Beispiel 1, f) verseift unter Bildung von 16-Fluormethylen-prednison. X_max 239 ΐημ.

Beispiel 8
a) Mikrobiologische HjS-Hydroxylierung

In einem Kleinfermenter werden 15 1 einer Nährlösung aus 5% Malzextrakt, 1% Saccharose, 0,2% Natriumnitrat, 0,1% Dikaliumphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,05% Kaliumchlorid und 0,005% Eisen(II)-sulfat (pH eingestellt auf 7,0) mit 800 ml einer Schüttelkultur von Curvularia lunata (Wakker) Boadijn beimpft und unter Rühren und starker Belüftung bei 28 ⁰C bebrütet. Nach 24stündigem Wachstum werden 5 g 16-Fluormethylen-Reichsteins-Substanz-S [hergestellt nach Beispiel 7, b)], gelöst in 40 ml Dimethylformamid, zugesetzt. Die Umsetzung wird papierchromatographisch verfolgt.Wenn im Papierchromatogramm kein Ausgangsmaterial mehr nachweisbar ist, wird die Kulturlösung 3mal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformlösungen werden eingedampft und der Rückstand zur Entfernung der Begleitprodukte an Kieselgel chromatographiert. Das mit Chloroform—Essigester (1 : 3) erhaltene Eluat enthält das gewünschte 16-Fluormethylen-hydrocortison, das daraus in üblicher Weise gewonnen wird. l_max 241 ΐημ, E}£ 447; F.239 bis 241°C; [a]₀ = +85,4° (Dioxan).

b) Acetylierung

5 g 16-Fluormethylen-hydrocortison werden mit 30 ml Pyridin und 30 ml Essigsäureanhydrid 1 Stunde auf dem Dampfbad erwärmt. Das Gemisch wird in Wasser eingegossen und das ausgefallene 16-Fluormethylen-hydrocortison-21-acetat abgesaugt. Die Reinigung erfolgt durch Umkristallisieren aus Aceton. λτηαχ 241 Πΐμ.

Ci) Mikrobiologische 1-Dehydrierung

Analog Beispiel 2, ei) werden 7,5 g 16-Fluormethylen-hydrocortison durch Einwirkung von Bacillus sphaericus zu 16-Fluormethylen-prednisolon dehydriert. l_max 242 πΐμ, E»*_m 404; F. 263 bis 264°C; [a]o = +25° (Dioxan).

C2) Chemische 1-Dehydrierung

Analog Beispiel 2, C2) werden 3 g 16-Fluormethylen-hydrocortison-21-acetat dehydriert.' Nach dem Umkristallisieren aus Aceton—Äther erhält man reines lo-Fluormethylen-prednisolon^l-acetat. l_max 242 ΐημ, E}*_m 368; F. 224 bis 225°C; [a]_D = +38,6° (Dioxan).

d) Verseifung

Die Verseifung des 16-Fluormethylen-prednisolon-

21-acetats zu 16-Fluormethylen-prednisolon erfolgt nach der gleichen Methode wie im Beispiel 1, f) angegeben. E₁ ¹I 404; F. 263 bis 264°C; [a]₀ = +25° (Dioxan).

Beispiel 9
Oxydation

2,4 g 16-Fluormethylen-prednisolon-21-acetat (hergestellt ' nach Beispiel 8) werden in 24 ml Pyridin gelöst und zu einer zuvor bereiteten Mischung von 2,4 g Chromsäureanhydrid und 24 ml Pyridin gegeben. .Die Mischung wird über Nacht stehengelassen und anschließend, wie im Beispiel 7, ei) beschrieben, aufgearbeitet. Es werden 1,6 g 16-Fluormethylen-prednison-21-acetat erhalten, identisch mit dem nach Beispiel 7, g2) erhaltenen Produkt.

Die Oxydation kann außerdem mit guten Ausbeuten nach dem im Beispiel 7, e2) beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.

Beispiel 10
a) 1-Dehydrierung

7,5 g 16-Fluormethylen-Reichsteins-Substanz-S [hergestellt nach Beispiel 7, b)] werden in 15 1 einer Kulturlösung von Bacillus sphaericus, wie im Beispiel 8, ei) beschrieben, dehydriert. Nach Aufarbeitung gemäß Beispiel 7, gi) wird durch Umkristallisieren aus Aceton reine l-Dehydro-16-fluormethylen-Reichsteins-Substanz-S erhalten, 2_max 240 πΐμ.

b) Mikrobiologische lla-Hydroxylierung

In einem Kleinfermenter werden 15 1 einer Nährlösung aus 5% Glukose, 0,2% Hefeextrakt, 0,3% Natriumnitrat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,001% Eisen(II)-sulfat und V30 Mol Phosphatpuffer nach Sörensen (pH 5,6) mit 800ml Schüttelkultur von Penicillium sp. (Sammlung E. Merck Nr. 2168) beimpft. Die Kultur wächst unter Rühren und starker Belüftung und erhält nach 24 Stunden einen Zusatz von 5 g l-Dehydro-16-fluormethylen-Reich-

steins-Substanz-S, gelöst in 40 ml Dimethylformamid. Die Hydroxylierung wird papierchromatographisch verfolgt. Nach Beendigung der Umsetzung wird aufgearbeitet entsprechend der Beschreibung im Beispiel 7, gi). Durch. Umkristallisieren aus Aceton wird reines 16-Fluormethylen-ll-epi-prednisolon erhalten. Xmax 241 ταμ.

c) 21-Acetylierung

Analog Beispiel 1, d) wird aus 16-Fluormethylen-11-epi-prednisolon das 16-Fluormethylen-11-epiprednisolon-21-acetat erhalten. X_max 241 πΐμ.

d) Oxydation

Analog Beispiel 1, e₂) wird aus 16-Fluormethylenll-epi-prednisolon-21-acetat das 16-Fluormethylenprednison-21-acetat hergestellt. Xmax 239 ταμ.

B ei spiel 11
a) Mikrobiologische lla-Hydroxylierung

In einem Kleinfermenter werden 15 1 einer Nährlösung aus 3% Saccharose, 1% Malzextrakt, 0,1% Hefeextrakt, 0,2% NaNO₃, 0,1% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄-7 H₂O, 0,01% FeSO₄-7 H₂O, pH eingestellt auf 6,8, mit 750 ml Schüttelkultur von ,Penicillium sp. (Sammlung E. Merck Nr. 2168) beimpft und unter starkem Rühren und Belüften bei 28 ⁰C bebrütet. Nach etwa 30stündigem Wachstum werden 5 g lo-Fluormethylen-Ha-hydroxy-progesteron, gelöst in 300 ml Methanol, zugesetzt. Die Umsetzung wird papierchromatographisch verfolgt und ist nach etwa 15 Stunden beendet. Die Kulturlösung wird 3mal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert, die vereinigten Extrakte werden im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit Petroläther digeriert. Das ungelöste 16-Fluormethylen-4-pregnenlla,17a-diol-3,20-dion wird isoliert und aus Essigester umkristallisiert. X_max 240 ηΐμ; F. 258 bis 259°C; [_a]_D = +19° (Dioxan).

b) Oxydation

2,3 g 16-Fluormethylen-4-pregnen-lla,17a-diol-3,20-dion werden in 23 ml "absolutem Pyridin gelöst und bei 0⁰C mit einem Gemisch aus 2,3 g Chromsäureanhydrid und 23 ml Pyridin versetzt. Nach 12 Stunden wird das Reaktionsgemisch in 250 ml Essigester eingegossen, der Niederschlag abgesaugt und mit Essigester gut gewaschen. Die vereinigten Essigesterlösungen werden eingeengt, wobei das lo-Fluormethylen^-pregnen-na-ol^ll^O-trionauskristallisiert. X_max 238 χημ.

Chemische !^Dehydrierung

11 g 16 - Fluormethylen - 4 - pregnen - 17a - ol-3,11,20-trion werden in 660 ml tert.Butanol mit 7,2 g Selendioxyd und 5,5 ml Eisessig 48 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das ausgefallene Selen wird abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Das anfallende 16-Fluormethylen-l,4-pregnadien-17a-ol-3,ll,20-trion wird . zur Reinigung über Kieselgel filtriert.

Xmax 239 Πΐμ. - . . ·

d) 21-Acetoxylierung

Analog Beispiel 1, a) kann aus 16-Fluormethylen-

4-pregnen-17a-ol-3,ll,20-trion das 16-Fluormethylencortison-21-acetat hergestellt werden. X_max 238 πΐμ.

Bei sp ie I 12
a) Mikrobiologische llß-Hydroxylierung

In einem Kleinfermenter werden 151 einer Nährlösung aus 3% Saccharose, 1% Malzextrakt, 0,1% Hefeextrakt, 0,2% NaNO₃, 0,1% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄-7 H₂O, 0,01% FeSO₄-7 H₂O, pH. eingestellt auf 6,8, mit 750 ml einer Submerskultur von Curvularia lunata (Wakker) Boadijn beimpft und unter starkem Rühren und Belüften bei 28^? C bebrütet. Nach etwa 18stündigem Wachstum werden 5 g.,16-Fluormethylen-17a-hydroxy-progesteron, gelöst in 300 ml Methanol, zugesetzt. Die Umsetzung wird papierchromatographisch verfolgt; nach etwa 24 Stunden ist. kein Ausgangsmaterial mehr nachzuweisen. Die Kulturlösung wird 3mal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden unter vermindertem Druck eingedampft und der aus lo-Fluormethylen^-pregnenlljS,17a-diol-3,20-dion bestehende Rückstand nach Digerieren mit Petroläther aus Essigester umkristallisiert. Xmax 241 Πΐμ.

ei) Mikrobiologische 1 ^^Dehydrierung'

55

In einem Fermenter werden 15 1 Nährlösung aus 1% Hefeextrakt (pH 6,8) mit 0,5 1 S.chüttelkultur von Bacillus sphaericus (Sammlung E. Merck Nr. 1001) beimpft. Die Kultur erhält unter ständigem Rühren und Belüften bei 28 ⁰C nach etwa .11 Stunden einen Zusatz von 7,5 g 16-Flu"ormethylen-4-pregnen-17a-olr3,ll,20-trion, die in 250 ml Methanol gelöst sind. Nach etwa 33 Stunden ist die Dehydrierung, die papierchromatographisch verfolgt wird, beendet. Die. Fermentationsbrühe wird mit Chloroform ausgeschüttelt, die vereinigten Extrakte werden einge-. , dampft, wobei das lo-Fluormethylen-l^-pregnadien-17q-ol-3,l.l,20-trion auskristallisiert. X_max 239 ΐημ.

b) Mikrobiologische 1(2)-Dehydrierung

in einem Fermenter werden 15 1 einer Nährlösung aus 1% Hefeextrakt (pH 6,8) mit 0,51 Schüttelkultur von Bacillus sphaericus (Sammlung E. Merck Nr. 1001) beimpft. Die Kultur erhält unter ständigem Rühren und Belüften bei 28° C nach etwa 9 Stunden einen Zusatz von 8,0 g 16-Fluormethylen-4-pregnen-Iij9,17a-diol-3,20-dion, die in 230 ml Methanol gelöst sind. Nach etwa 25 bis 30 Stunden ist die Dehydrierung, die papierchromatographisch verfolgt wird, beendet. Die Fermentationsbrühe wird 3mal mit Chloroform ausgeschüttelt, die vereinigten Extrakte werden eingedampft, wobei das 16-Fluormethylen-l,4-pregnadien-ll/3,17a-diol-3,20-dion auskristallisiert. Xmax 242 Πΐμ.

c) Oxydation

Analog Beispiel 11, b) kann aus 16-Fluormethylenl,4-pregnadien-ll|3,17a-diol-3,20-dion das 16-Fluormethylen-l,4-pregnadjen-17w-ol-3,ll,20-trion herge_r stellt werden. X_max 239 ηΐμ. -:. .

'■ d)'21-Äcetoxylierung

Analog Beispiel 1, a) kann aus-16-Fluormethylenl,4-pregnadien-17a-ol-3,ll,20-trion. das 16-Flüormethylen - prednison - 21 - acetat erhalten werden.

Xmax 239 Πΐμ. .

e) Analog Beispiel. 1, a)^ kann aus dem nach Stufe 12, a) erhaltenen 16-Fluormethylen-4-pregnen-

ll/U7a-diol-3,20-dion das 16-Fluormethylen-hydrocortison-21-acetat hergestellt werden. l_max 241 ηΐμ.

Beispiel 13
a) 21-Acetoxylierung

Analog Beispiel 1, a) erhält man aus 16-Fluormethylen-6a-methyl-4-pregnen-17a-ol-3,20-dion das 16-Fluormethylen-6a-methyl-4-pregnen-17«,21-diol-3,20-dion-21-acetat. F. 182 bis 183°C; [a]² _D° = +56,7° (in Dioxan); ?._nax 241 ηΐμ, Ε}* 400.

b) Verseifung

Analog Beispiel 1, b) erhält man aus 16-Fluormethylen-oa-methyl-i-pregnen-17a,21 -diol-3,20-dion-21-acetat das freie 16-Fluormethylen-6a-methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion.

c) Mikrobiologische 1 !^-Hydroxylierung

Analog Beispiel 2, a) erhält man aus dem rohen 16-FIuormethylen-6a-methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion das lo-Fluormethylen-öa-methyM-pregnenll/U7a,21-triol-3,20-dion. F. 243 bis 244°C; [a]l° = +54,0° (in Dioxan); X_max 242πΐμ, E}*_m 375.

d) Mikrobiologische 1-Dehydrierung

Analog Beispiel 1, gi) erhält man aus 16-Fluormethylen - 6a - methyl - 4 - pregnen - ίίβ,Πα,2ί - triol-3,20-dion das lo-Fluormethylen-oa-methyl-l^-pregnadien-ll/9,17a,21-triol-3,20-dion; F. 257 bis 258°C; [a]l° = +14,3° (in Dioxan); l_max 243 πΐμ, Ei* 395.

Beispiel 14

a) Eine Lösung von 7 g 16-Fluormethylenprednisolon [erhalten nach Beispiel 8, Ci)] in 500 ml absolutem Dioxan wird mit 2,6 ml trockenem Pyridin und 2,2 ml frisch destilliertem Chloracetylchlorid versetzt. Nach 16stündigem Stehen bei Raumtemperatur wird das Gemisch in 5 1 Wasser eingerührt, die Fällung abgesaugt, gut mit Wasser gewaschen, getrocknet und aus Chloroform umkristallisiert. Das erhaltene 16-Fluormethylen-prednisoIon-21-chloracetat schmilzt bei 211 bis 212°; \aYS = +38° (in Dioxan); X_max 243 ηΐμ, E}*_m 337.

b) Ein Gemisch von 3,9 g 16-Fluormethylenprednisolon, 3 g Diäthylaminoacetylchloridhydrochlorid, 10 ml Pyridin, 100 ml Aceton und 5 ml Wasser wird 1 Stunde gekocht, dann im Vakuum eingedampft und der Rückstand in Chloroform aufgenommen. Die Chloroformlösung wird mehrfach mit Wasser gewaschen, eingeengt, im Vakuum zur Trockne eingedampft und das erhaltene 16-FIuormethylen - prednisolon - 21 - diäthylaminoacetat aus Essigester umkristallisiert. F. 182 bis 184°C; [a]i° = +35° (in Dioxan). Das Hydrochlorid wird in üblicher Weise in Chloroform mit ätherischer Salzsäure erhalten; F. 255 bis 257°C.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von 16-Chlormethylen- bzw. -Fluormethylensteroiden der allgemeinen Formel I ·

CH₂R

CHX

R = OH oder eine O-Acylgruppe;
R₂ = H, α- oder /S-OH oder =O;
X = Cl oder F;
Y = H oder CH₃,

dadurch gekennzeichnet, daß man nach an sich bekannten Methoden ein 16-Chlormethylen- oder -Fluormethylen-i1⁴-3-keto-steroid der allgemeinen Formel

CH₂Ri

CHX

Ri = H, OH oder eine O-Acylgruppe;
X und Y haben die angegebene Bedeutung,

in Ha- oder Umstellung fermentativ hydroxyliert, das erhaltene 11-Hydroxy-steroid gegebenenfalls mit einem milden Oxydationsmittel zu dem entsprechenden 11-Keto-steroid oxydiert und daß man auf einer beliebigen Verfahrensstufe ein für Ri stehendes Wasserstoffatom nach an sich bekannten chemischen Methoden in eine O-Acyl- bzw. OH-Gruppe überführt, gegebenenfalls nach an sich bekannten chemischen oder mikrobiologischen Methoden in 1(2)-Stellung eine Doppelbindung einfuhrt und gegebenenfalls nach an sich bekannten Methoden eine in der erhaltenen Verbindung vorhandene 21-O-Acylgruppe alkalisch verseift bzw. einen etwa erhaltenen 21-Alkohol verestert oder in ein Estersalz überführt.