DE1222498B - Verfahren zur Herstellung von delta 4,6- bzw. delta 1,4,6-16-Halogenmethylen-3, 20-diketo-steroiden - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Int. CL:

C 07 c

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Deutsche Kl.: 12 ο - 25/06

Nummer: 1 222 498

Aktenzeichen: M 53674 IV b/12 ο

Anmeldetag: 24. Mi 1962

Auslegetag: 11. August 1966

Es wurde gefunden, daß in 4,6- bzw. 1,4,6-Stellung ungesättigte 16-Halogenmethylen-3,20-diketo-steroide der allgemeinen Formel I

CH₂R₃

CHR₄

(I)

worin Ri = H, CH₃ oder F, R₂ = = O oder H, OH (α oder ß), R₃ = freie oder veresterte OH-Gruppe und R4 = Cl oder F bedeutet, ausgezeichnete corticoide Eigenschaften besitzen.

Die Steroide der Formel I können nach der Erfindung aus verschiedenen Ausgangsverbindungen hergestellt werden.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von J⁴·⁶- bzw. J^-Mo-Halogenmethylen-3,20-diketo-steroiden der oben angegebenen Formel I, das darin besteht, daß man in an sich bekannter Weise

a) in ein 4-Dehydro-16-halogenmethylen-3,20-diketo-steroid der allgemeinen Formel II

CH₂R₃

CHR₄

(H)

worin R₁ bis R₄ die oben angegebene Bedeutung haben, durch Dehydrierung mit Chloranil eine 6(7)-ständige Doppelbindung oder

b) in ein J⁴-⁶-16-Halogenmethylen-3,20-diketo-steroid der allgemeinen Formel III Verfahren zur Herstellung von z(⁴·⁶- bzw. Δ ¹'⁴'⁶-16-Halogenmethylen-3,20-diketo-steroiden

Anmelder:

E. Merck Aktiengesellschaft,

Darmstadt, Frankfurter Str. 250

Als Erfinder benannt:
Dipl.-Chem. Dr. Fritz von Werder, Dipl.-Chem. Dr. Klaus Bruckner, Darmstadt; Dipl.-Chem. Dr. Karl-Heinz Bork, Griesheim; Dr. Harald Metz, Darmstadt

CH₂R₃

CHR₄

(III)

worin Ri, R₃ und R₄ die oben angegebene Bedeutung haben, auf fermentativem Wege eine 11α- bzw. 11/S-ständige Hydroxy gruppe oder

c) in ein zl⁴'⁶-16-Halogenmethylen-3,20-diketo-steroid der allgemeinen Formel IV

CHR₄

(IV)

worin Ri, R₂ und R₄ die oben angegebene Bedeutung haben, eine 21-ständige Acyloxygruppe einführt.

609 609/405

In den nach einer der Verfahrensweisen a) bis c) hergestellten Verbindungen wird gegebenenfalls nach an sich bekannten Methoden eine l(2)-ständige Doppelbindung eingeführt und/oder eine in 11-Stellung befindliche Hydroxygruppe zur Ketogruppe oxydiert und/oder eine in 21-Stellung vorhandene veresterte Hydroxygruppe zur freien Hydroxygruppe alkalisch verseift und/oder ein etwa erhaltener 21-Alkohol in einen entsprechenden Ester bzw. in ein Salz eines solchen übergeführt.

Die Ausgangsverbindungen der Formel II werden durch Behandlung mit Chloranil in die entsprechenden 6-Dehydroverbindungen umgewandelt. Man führt die Reaktion zweckmäßig in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels, z. B. in tert.-Amylalkohol, tert.-Butanol, Dioxan, Essigester, Methyläthylketon, Eisessig, n-Butylacetat oder n-Amylacetat, und vorzugsweise bei Siedetemperatur des verwendeten Lösungsmittels durch. Die erhaltenen 6-Dehydrosteroide werden nach Beendigung der Reaktion aus dem Gemisch vorteilhaft mit Chloroform extrahiert und lassen sich aus Methanol Umkristallisieren.

Die Ausgangsverbindungen der Formel III werden durch fermentative 11-Hydroxylierung in die gewünschten Verbindungen der Formel I übergeführt. Zur Einführung der lla-Hydroxygruppe in die Ausgangssteroide sind z. B. Mikroorganismen aus den folgenden Gattungen geeignet: Absidia, Aspergillus, Cephalothecium, Cercospora, Coryneum, Cunninghamella, Dactylium, Delacroixia, Eurotium, Fusarium, Gloeosporium, Glomerella, Helicostylum, Metarrhizium, Mucor (und andere Gattungen der Ordnung Mucorales), Neurospora, Penicillium, Pestalotia, Rhizopus, Sporotrichium, Trichoderma, Trichothecium, Bacillus. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von Pilzen der Gattungen Penicillium und Fusarium.

Zur Einführung einer 11/3-Hydroxygruppe auf mikrobiologischem Weg sind insbesondere Mikroorganismen der Gattung Curvularia, wie Curvularia lunata, geeignet. Jedoch können auch alle anderen hierfür geeigneten Mikroorganismen, z. B. solche der Gattungen Absidia, Coniothyrium, Cunninghamella oder Stachylidium, eingesetzt werden.

Die Fermentation wird in an sich bekannter Weise ausgeführt und ist nach 10 bis 48 Stunden beendet, je nachdem, welche Ausgangsverbindungen und Mikroorganismen verwendet werden. Das entstandene 11-Hydroxy-steroid wird aus dem Reaktionsgemisch zweckmäßigerweise durch Extraktion mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie Chloroform oder Methylenchlorid, isoliert.

Zur Umwandlung der Ausgangsverbindungen der Formel IV in die Verbindungen der Formel I wird ein in 21-Stellung des Steroidmoleküls befindliches Wasserstoffatom durch eine O-Acyl- bzw. eine OH-Gruppe substituiert. Die 21-Desoxy-steroide der Formel IV werden hierzu mit einer alkalischen Jodlösung, vorzugsweise einem Gemisch aus Jod und Calciumoxyd, gegebenenfalls in Gegenwart von Calciumchlorid, behandelt, wobei das entsprechende 21-Mono- oder 21-Dijodsteroid entsteht, das durch Umsetzung mit einem Alkaliacylat, vorzugsweise Kaliumacetat, in das entsprechende 21-O-Acylsteroid übergeführt wird. Durch alkalische Verseifung, dieser Verbindung in an sich bekannter Weise, z. B. mit Natriumbicarbonat, erhält man das 21-Hydroxy-steroid.

Die nach einer der vorstehend beschriebenen Verfahrensweisen hergestellten Steroide können, sofern sie in 1-Stellung gesättigt sind, chemisch oder mikrobiologisch in die entsprechenden 1-Dehydro-steroide übergeführt werden.

Als chemisches Dehydrierungsmittel ist beispielsweise Selendioxyd geeignet. Man führt die Reaktion zweckmäßig in einem geeigneten Lösungsmittel, wie tert.-Butanol, unter Zusatz geringer Mengen Essigsäure und durch Kochen des Reaktionsgemisches am Rückfluß durch. Das während der Reaktion ausfallende Selen wird nach Beendigung der Umsetzung von der Lösung des entstandenen 1-Dehydro-steroids abgetrennt.

Ferner kann die 1-Dehydrierung mit 2,3-Dichlor-5,6-dicyan-p-benzochinon durchgeführt werden. Als Lösungsmittel verwendet man in diesem Fall zweckmäßigerweise Benzol oder Dioxan.

Mikrobiologisch kann die 1(2)-Doppelbindung mit Arten folgender Gattungen in das Steroid eingeführt werden: Alternaria, Didymella, Calonectria, Colletotrichum, Cylindrocarpon, Fusarium, Ophiobolus, Septomyxa, Vermicularia, Acetobacter, Aerobacter, Alcaligenes, Bacillus (besonders Bacillus sphaericus), Corynebacterium (besonders Corynebacterium simplex), Erysipelothrix, Listeria, Micromonospora, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Pseudomonas, Streptömyces.

Die Fermentation ist nach etwa 4 bis 14 Stunden beendet. Besitzen die für die mikrobiologische 1(2)-Dehydrierung eingesetzten Verbindungen eine veresterte Hydroxygruppe in 21-Stellung, so wird diese in manchen Fällen während der Fermentation durch den Mikroorganismus in eine freie Hydroxygruppe umgewandelt.

Eine im Molekül vorhandene 11-Hydroxygruppe kann durch Behandlung mit milden Oxydationsmitteln zur 11-Ketogruppe oxydiert werden. Beispielsweise können für diese Verfahrensstufe Chromsäureanhydrid in Eisessig oder ein Gemisch aus Chromsäureanhydrid und Pyridin oder Chromschwefelsäure in Aceton oder unterchlorige bzw. unterbromige Säure verwendet werden. Die gebildeten 11-Keto-steroide werden aus dem Reaktionsgemisch beispielsweise durch Extraktion oder Ausfallen mit Wasser isoliert.

Sofern in den verfahrensgemäß hergestellten Steroiden veresterte Hydroxygruppen in 21-Stellung vorliegen, können diese in an sich bekannter Weise,

z. B. durch Erhitzen des Steroids in einem Lösungsmittel, wie Dioxan, zusammen mit einem alkalischen Mittel, wie Kaliumcarbonat oder Natriumcarbonat, verseift werden.
Falls erwünscht, kann anschließend die 21-OH-Gruppe nach üblichen Methoden wieder verestert werden. Als Veresterungsmittel sind alle diejenigen Säuren bzw. deren zur Veresterung geeignete Derivate verwendbar, die physiologisch verträgliche Ester ergeben. Zum Beispiel können die folgenden Säuren oder deren zur Veresterung geeignete Derivate verwendet werden: Carbonsäuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Trimethylessigsäure, tert.-Butylessigsäure, Cyclopentylpropionsäure, Phenylpropionsäure, Phenylessigsäure, Capronsäure, Caprylsäure, Palmitinsäure, Undecylensäure, aber auch Benzoesäure oder Hexahydrobenzoesäure, sowie Halogencarbonsäuren, wie Chloressigsäure. Gegebenenfalls kann man auch zwecks Herstellung

wasserlöslicher Derivate die 21-Hydroxygruppe mit Dicarbonsäuren, Amino- oder Alkylaminocarbonsäuren oder mit Phosphor- oder Schwefelsäure verestern. Auf diese Art lassen sich z.B. herstellen: Succinate, Oxalate oder die Säureadditionssalze von Aminocarbonsäureestern, z. B. von Asparaginsäure- oder Diäthylaminoessigsäureestern.

Als Ausgangsverbindungen für das erfindungsgemäße Verfahren werden beispielsweise die folgenden Verbindungen verwendet:

lo-Fluormethylen-cortisol^l-acetat, 16-Fluormethylen-cortison-21-acetat, lo-Chlormethylen-cortisol^l-acetat, 16-Chlormethylencortison-21-acetat, 6-Methyl-16-fluormethylen-cortisol-21-acetat, o-Methyl-lo-fluormethylen-cortison^l-acetat, 6-Methyl-16-chlormethylen-cortisol-21 -acetat, o-Methyl-lo-chlormethylen-cortison^l-acetat, o-Fluor-lo-fluormethylen-cortisol^l-acetat, o-Fluor-lo-fluormethylen-cortison^l-propionat, 6-Fluor-16-chlormethylen-cortisol-21-acetat, ö-Fluor-lo-chlormethylen-cortison^l-valerianat, lo-Fluormethylen^o-pregnadien-na^l-diol-3,20-dion bzw. dessen 21-Acetat,

3,20-dion bzw. dessen 21-Acetat, 6-Methyl-16-fluormethylen-4,6-pregnadien-

17«,21-diol-3,20-dion bzw. dessen 21-Acetat, 6-Methyl-16-chlormethylen-4,6-pregnadien-

17«.21-diol-3,20-dion bzw. dessen 21-Acetat, 6-Fluor-16-fluormethylen-4,6-pregnadien-

17a,21-diol-3,20-dion bzw. dessen 21-Acetat, o-Fluor-lo-chlormethylen^o-pregnadien-

17«,21-diol-3,20-dion bzw. dessen 21-Acetat, 16-Fluormethylen-4,6-pregnadien-11 ß, 17a-diol-

3,20-dion,
1 o-Chlormethylen^o-pregnadien-11 ß, 17u-diol-3,20-dion.

³⁵

paJ,

20-trion,

lo-Chlormethylen^^-pregnadien-na-ol-S.ll,

20-trion,
6-Methyl-16-fiuormethylen-4,6-pregnadien-

11 ZU 7a-diol-3,20-dion,
6-Methyl-16-chlormethylen-4,6-pregnadien-

ll/U7a-diol-3,20-dion,
6-Methyl-16-fluormethylen-4,6-pregnadien-

17a-ol-3,ll,20-trion,
o-Methyl-lo-chlormethylen^o-pregnadien-

17a-ol-3,ll,20-trion,
6-Fluor-16-fluormethylen-4,6-pregnadien-

ll/U7a-diol-3,20-dion,
o-Fluor-lo-chlormethylen-^ö-pregnadien-

ll/U7a-diol-3,20-dion,
o-Fluor-lo-fiuormethylen^o-pregnadien-

17«-ol-3,ll,20-trion,
6-Fluor-16-chlormethylen-4,6-pregnadien-17«-ol-3,ll,20-trion.

Die als Ausgangsmaterial benötigten Steroide können durch Behandlung der zugrunde liegenden lou.nu-Oxido-loß-chlormethyl- bzw. 16a,17a-Oxido-16/i-fluormethyl-steroide mit Bromwasserstoff in einem inerten Lösungsmittel erhalten werden.

Die neuen, verfahrensgemäß erhaltenen Verbindüngen können im Gemisch mit üblichen Arzneimittelträgern in der Human- oder Veterinärmedizin eingesetzt werden. Als Trägersubstanzen kommen

⁴⁵

⁵°

⁵⁵ solche organischen oder anorganischen Stoffe in Frage, die für die parenterale, enterale oder topikale Applikation geeignet sind und die mit den neuen Verbindungen nicht in Reaktion treten, wie beispielsweise Wasser, pflanzliche öle, Polyäthylenglykole, Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, Vaseline, Cholesterin usw. Zur parenteralen Applikation dienen insbesondere Lösungen, vorzugsweise ölige oder wäßrige Lösungen, sowie Suspensionen, Emulsionen oder Implantate. Für die enterale Applikation können ferner Tabletten oder Dragees, für die topikale Anwendung Salben oder Cremes, die jeweils gegebenenfalls sterilisiert oder mit Hilfsstoften, wie Konservierungs-, Stabilisierungs- oder Netzmitteln oder Salzen zur Beeinflussung des osmotischen Druckes, oder mit Puffersubstanzen versetzt sind, angewendet werden.

Beispiel 1

8.5 g 16 - Fluormethylen - 4 - pregnen - 1 l/i, 17a, 21-triol-3.20-dion-21-acetat werden in 335 ml tert.-Butanol mit 59 g Chloranil 7 Stunden unter Rückfluß gekocht. Danach wird das Reaktionsgemisch auf ein Volumen von 100 ml eingeengt, mit 380 ml Wasser versetzt und erschöpfend mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformextrakte werden mit eiskalter Natronlauge ausgeschüttelt, mit Wasser neutral gewaschen und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird aus Essigester umkristallisiert, wobei das 21-Acetat des 16 - Fluormethylen - 4,6 - pregnadien -1 Iß, 17«,21 - triol-3,20-dions in farblosen Kristallen erhalten wird. Ämax = 283 τημ; e = 26 600;F. 219°C;[a]_D = +104° (Dioxan).

Beispiel 2

5,8 g des nach Beispiel 1 erhaltenen 16-Fluormethylen-4,6-pregnadien-11^.17«.21-triol-3.20-dion-21-acetats werden in 160 ml Methanol gelöst und nach Zusatz einer heißen Lösung von 1,28 g Natriumhydrogencarbonat in 19 ml Wasser 14 Minuten am Rückfluß gekocht. Das abgekühlte Gemisch wird in 900 ml Wasser, dem 3 ml Eisessig zugesetzt sind, eingerührt und mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformauszüge werden mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird aus Methanol umkristallisiert, wobei das 16 - Fluormethylen - 4.6 - pregnadienll/U7a,21-triol-3,20-dion in farblosen Kristallen anfällt. Xmax = 283 πΐμ; f = 26 200; F. 253°C; [a]_D = +76° (Dioxan).

Beispiel 3

10 g 16-Chlormethylen-4-pregnen-ll/:U7a,21-triol-3,20-dion-21-acetat werden in 300 ml Essigsäureäthylester und 30 ml Essigsäure zusammen mit 7 g Chloranil 10 Stunden unter Rückfluß gekocht. Das R.eaktionsgemisch wird danach abgekühlt, in Wasser eingegossen, mit Chloroform extrahiert, der Extrakt zunächst mit Wasser, dann mit Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, bis die gesamte Essigsäure entfernt ist, dann erneut einmal mit Wasser und anschließend mit 225 ml 1 %iger NaOH geschüttelt, wieder mit Wasser gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Einengen kristallisiert aus Essigester das 16-Chlormethylen-4,6-pregnadien-ll/U7a,21-triol-3,20-dion-21 -acetat.

Wc = 282,5 πΐμ, e = 28 500; F. 206^oC;\a]_a = +26° (Dioxan).

Durch Verseifung analog Beispiel 2 wird daraus das 16 - Chlormethylen - 4,6 - pregnadien - Ιίβ,Πα, 21 - triol - 3,20 - dion erhalten. A_max = 282,5 ηΐμ, ε = 28 000.

Beispiel 4

3 g 6a - Methyl - 16 - fluormethylen - 4 - pregnenll(S,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat werden in 90 ml Dioxan gelöst und mit 2,1 g Chloranil 7 Stunden unter Rückfluß gekocht. Die hellbraune Lösung wird nach dem Abkühlen in Wasser eingegossen, mit Chloroform ausgeschüttelt und der Chloroformauszug zunächst mit Wasser, dann mit 210 ml n/10-Natronlauge und schließlich wieder mit Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und abdestilliert. Aus Methanol kristallisiert das 6-Methyl-16 - fluormethylen - 4,6 - pregnadien -11β,17α,21 - triöl-3,20-dion-21-acetat. l_max = 287,5 πΐμ, ε = 25 400.

Durch Verseifung analog Beispiel 2 wird daraus das 6 - Methyl -16 - fluormethylen - 4,6 - pregnadien- liß,17a,21 - triol - 3,20 - dion hergestellt. l_max = 287,5 πΐμ, ε = 25 800.

Beispiel 5

5 g 6α - Methyl - 16 - chlormethylen -A- pregnen- Πα,1ίβ,21 - triol - 3,20 - dion - 21 - acetat werden in 100 ml Methyläthylketon zusammen mit 7 g Chloranil 7 Stunden unter Rückfluß gekocht. Das Reaktionsgemisch wird abgekühlt, in Wasser eingegossen und mit Chloroform ausgezogen. Der Auszug wird zunächst mit Wasser, dann mit 100 ml l%iger NaOH geschüttelt, wieder mit Wasser gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Einengen kristallisiert aus Methanol das ö-Methyl-16-chlor-

21-acetat aus. Xmax = 288 πΐμ, ε = 25 800.

Durch Verseifung analog Beispiel 2 wird daraus das 6 - Methyl -16 - chlormethylen - 4,6 - pregnadiennaJl^l-triol-S^O-dion erhalten. X_max = 288 ηΐμ, ε = 26 200.

Beispiel 6

5 g analog Beispiel 1 hergestelltes 16-Fluormethylen - 4,6 - pregnadien - 11β,Πα,21 - triol - 3,20 - dion werden in 50 ml Acetanhydrid und 50 ml Pyridin 1 Stunde auf 100°C erhitzt. Man läßt abkühlen, rührt in 750 ml Eiswasser ein, filtriert das kristalline 16 - Fluormethylen - 4,6 -pregnadien - ίίβ,Πα,21 - triol-3,20-dion-21-acetat ab und kristallisiert aus Aceton um. l_max = 283 ΐημ, ε = 26 600; F. 219°C; [a]_D = +104° (Dioxan).

Beispiel 7

5 g des nach Beispiel 2 erhaltenen 16-Fluormethylen - 4,6 - pregnadien - 11,8,17α,21 - triol - 3,20 - dions werden in 110 ml absolutem Dioxan mit 1,55 ml Chloracetylchlorid und 2 ml Pyridin versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann gießt man das Reaktionsgemisch in Wasser ein, saugt den Niederschlag ab und wäscht ihn mit Wasser.

Das getrocknete, rohe 21-Chloracetat wird in 400 ml Aceton gelöst und mit 55 ml Diäthylamin und 4 ml Wasser über Nacht bei 0⁰C stehengelassen. Beim Einengen unter vermindertem Druck kristallisiert das 21-Diäthylaminoacetat aus. A_max = 282 ηΐμ, ε = 26 500.

3,6 g 16 - Fluormethylen - 4,6 - pregnadien -1 Ιβ,Πα, 21-triol-3,20-dion-21-diäthylaminoacetat werden in 85 ml absolutem Tetrahydrofuran gelöst und mit 70 ml einer Chlorwasserstofflösung in Chloroform versetzt. Das ausfallende Hydrochlorid wird abgesaugt, mit Tetrahydrofuran gewaschen und getrocknet.

Beispiel 8

20 g des nach' Beispiel 4 erhaltenen 6-Methyl-16 - fluormethylen - 4,6 - pregnadien - 11β,Πα,2ί - triol-3,20-dions und 20 g Bernsteinsäureanhydrid werden in 200 ml absolutem Pyridin über Nacht stehengelassen. Man rührt bei 5 bis 10⁰C in ein Gemisch von 210 ml konzentrierter Schwefelsäure und 31 Wasser ein, saugt den Niederschlag ab und trocknet ihn bei 80⁰C unter vermindertem Druck. Durch Umkristallisieren aus Essigester wird das reine 21-Hemisuccinat gewonnen.

20 g Hemisuccinat werden in 260 ml Isopropanol gelöst und im Laufe von 20 Minuten mit 179,5 ml 0,23 n-Natriumisopropylatlösung unter Rühren versetzt. Das ausfallende Salz wird abgesaugt und über Phosphorpentoxyd getrocknet. Man erhält reines 6 - Methyl -16 - fluormethylen - 4,6 - pregnadienll/S,17a,21-triol-3,20-dion-21-hemisuccinat-Natriumsalz.

Beispiel 9

10 g des nach Beispiel 2 erhaltenen 16-Fluormethylen - 4,6 - pregnadien -1 Ιβ,Πα,ΙΙ - triol - 3,20 - dions werden in 20 ecm absolutem Pyridin mit 9,3 g Phosphoryldimorpholidchlorid 10 Tage verschlossen stehengelassen. Man gießt dann den Ansatz in die berechnete Menge verdünnte Schwefelsäure und extrahiert das 21-Dimorpholidphosphat mit Chloroform.

Der Chloroformrückstand wird in 40 ml Äthanol gelöst, mit Wasser bis zur ersten bleibenden Trübung versetzt und nach Zusatz von 110 g Kationenaustauscherharz, bekannt unter dem Handelsnamen Amberlite IR-120, 36 Stunden gerührt. Man filtriert ab, wäscht den Austauscher mit Äthenol, neutralisiert das Filtrat mit Natronlauge und engt unter vermindertem Druck stark ein. Man läßt abkühlen, extrahiert mit Chloroform alle Neutralteile, säuert dann die wäßrige Phase mit verdünnter Schwefelsäure an und extrahiert mit n-Butanol. Der Extrakt wird mit Natriumsulfat getrocknet, mit Natriummethylat neutralisiert und etwas eingeengt. Beim Abkühlen kristallisiert das Natriumsalz aus. Es wird abfiltriert, heiß mit Methanol extrahiert, der Extrakt mit Butanol versetzt und stark eingeengt, wobei das reine 16 - Fluormethylen - 4,6 - pregnadien - ΙΙβ,Πα, 21 - triol - 3,20 - dion - 21 - orthophosphat- Natrium ausfällt.

Beispiel 10

0,5 g des nach Beispiel 4 erhaltenen 6a-Methyl - 16 - fluormethylen - 4,6 - pregnadien - ΙΙβ,Πα, 21 - triol - 3,20 - dions werden in 10 ml absolutem Chloroform und 3 ml absolutem Pyridin gelöst und bei O⁰C im Laufe von 5 Minuten unter Rühren mit einer Lösung von 0,5 ml tert.-Butylessigsäurechlorid in 5 ml Chloroform versetzt. Man rührt weitere 5 Minuten bei Eiskühlung und dann 4 Stun-

den bei Raumtemperatur. Der Ansatz wird auf Eis gegossen und mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird mit verdünnter Schwefelsäure und Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird in Chloroform über 10 g Magnesiumaluminiumsilikat, bekannt unter dem Handelsnamen Florisil, filtriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Aus Methanol kristallisiert das reine 21-tert.-Butylacetat.

Beispiel 11

IO

Ein 10-1-Versuchsfermenter mit einer Nährlösung aus 3% Malzextrakt, 0,5% Glukose und 0,3% Pepton aus Casein wird mit 500 ml einer Sporensuspension von Curvularia lunata beimpft. Der Pilz wächst unter starker Belüftung und Rühren bei 28 ⁰C und erhält nach 24 Stunden einen Zusatz zu 5 g 16 - Fluormethylen - 4,6 - pregnadien - 17a,21 - diol-3,20-dion oder dessen 21-Acetat in 200 ml Methanol. Die Umsetzung wird dünnschichtchromatographisch verfolgt. Nach 30 Stunden ist kein Ausgangsmaterial mehr nachzuweisen; die Kultur wird dreimal mit je 101 Chloroform extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden eingeengt und über eine kleine Säule mit aktiviertem Kieselgel gegeben. Nach Umkristallisation aus Aceton erhält man das reine 16-Fluormethylen-4,6-pregnadien-ll/3,17a,21-triol-3,20-dion. Xmax = 283 ΐημ, ε = 26 200; F. 253°C; [a]_D = +76° (Dioxan).

In gleicher Weise geht die Umsetzung vor sich, wenn das Mycel nach 24 Stunden durch Filtration von der Nährlösung abgetrennt und in Wasser resuspendiert wird, worauf der Zusatz erfolgt.

B e i s ρ i e 1 12 ,,

In einem Kleinfermenter werden 151 einer Nährlösung aus 5% Malzextrakt, 1% Saccharose, 0,2% Natriumnitrat, 0,1% Dikaliumphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,05% Kaliumchlorid und 0,005% Eisen(II)-sulfat (pH eingestellt auf 7,0) mit 800 ml einer Schüttelkultur von Curvularia lunata (W a k k e r) Boadijn beimpft und unter · Rühren und starker Belüftung bei 28 ⁰C bebrütet. Nach 24stündigem Wachstum werden 5 g 6-Fluor-.16-fluormethylen-4,6-pregnadien-170,21-diol-3,20-dion oder dessen 21-Acetat, gelöst in 40 ml Dimethylformamid, zugesetzt. Die Umsetzung wird papierchromatographisch verfolgt. Wenn im Papierchromatogramm kein Ausgangsmaterial mehr nachweisbar ist, wird die Kulturlösung dreimal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformlösungen werden eingedampft und der Rückstand zur Entfernung der Begleitprodukte über Kieselgel filtriert. Das erhaltene 6-Fluor-16-fluormethylen-4,6-pregnadien-ll/},17a,21-triol-3,20-dion wird aus Aceton—Äther umkristallisiert. l_max = 282 ηΐμ, f = 24 800.

Beispiel 13

In einem Kleinfermenter werden 15 1 einer Nährlösung aus 5% Malzextrakt, 1% Saccharose, 0,2% Natriumnitrat, 0,1% Dikaliumphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,05% Kaliumchlorid und 0,005% Eisen(II)-sulfat (pH eingestellt auf 7,0) mit 800 ml einer Schüttelkultur von Curvularia lunata (W a k k e r) Bodadijn beimpft und unter Rühren und starker Belüftung bei 28 ⁰C bebrütet. Nach 24stündigem Wachstum werden 5 g o-Fluor-lo-chlormethylen - 4,6 - pregnadien - 17a,21 - diol - 3,20 - dion oder dessen 21-Acetat, gelöst in 40 ml Dimethylformamid, zugesetzt. Die Umsetzung wird papierchromatographisch verfolgt. Wenn im Papierchromatogramm kein Ausgangsmaterial mehr nachweisbar ist, wird die Kulturlösung dreimal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformlösungen werden eingedampft und der Rückstand zur Entfernung der Begleitprodukte über Kieselgel filtriert. Das mit Chloroform—Essigester (1:3) erhaltene Eluat enthält das gewünschte 6-Fluor-16-chlormethylen-4,6-pregnadien-11/?,17α,21 -triol-3,20-dion. l_max = 281 πΐμ, ε = 24 400.

Beispiel 14

In einem Kleinfermenter werden 15 1 einer Nährlösung aus 5% Glukose, 0,2% Hefeextrakt, 0,3% Natriumnitrat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,001% Eisen(II)-sulfat und ¹Iw Mol Phosphatpuffer nach Sörensen (pH 5,6) mit 800ml Schüttelkultur von Metarrhizium anisobliae beimpft. Die Kultur wächst unter Rühren und starker Belüftung und erhält nach 24 Stunden einen Zusatz von 5 g 16-Fluormethylen - 4,6 - pregnadien - 17a,21 - diol - 3,20 - dion, gelöst in 40 ml Dimethylformamid. Die Hydroxylierung wird papierchromatographisch verfolgt. Nach Beendigung der Umsetzung wird durch Ausschütteln mit Chloroform aufgearbeitet. Durch Umkristallisieren aus Aceton wird reines 16-Fluormethylen-4,6-pregnadien-lla,17a,21-triol-3,20-dion erhalten. hnax = 283,5 Πΐμ, ε = 23 900.

Beispiel 15

Ein 10-1-Kleinfermenter mit einer Nährlösung aus 3% Saccharose, 1% Malzextrakt, 0,1% Hefeextrakt und 0,2% NaNOe wird mit einer Sporensuspension von Metarrhizium anisopliae beimpft. Der Pilz wächst als Schüttelkultur bei 28° C und erhält nach 30 Stunden einen Zusatz von 5 g 16-Chlormethylen - 4,6 - pregnadien - 17a,21 - diol - 3,20 - dion in 200 ml Methanol. Nach 20 Stunden Fermentationsdauer läßt sich dünnschichtchromatographisch kein Ausgangsmaterial mehr nachweisen; die Kultur wird dreimal mit je 8 1 Chloroform extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden eingeengt, der Rückstand wird aus Essigester umkristallisiert. Man erhält das reine 16 - Chlormethylen - 4,6 - pregnadien - 11α,17α, 21-triol-3,20-dion. l_max = 283 ηΐμ, ε = 25 000.

Beispiel 16

In 30 ml Methanol, das 0,6 g wasserfreies Calciumchlorid enthält, werden 6 g 16-Chlormethylen-4,6-pregnadien-17a-ol-3,ll,20-trion suspendiert und mit 3 g Calciumoxyd versetzt. Innerhalb 30 Minuten läßt man unter Rühren eine Lösung von 9 g Jod in 30 ml Methanol, die ebenfalls 0,6 g wasserfreies Calciumchlorid enthält, zutropfen, wobei die Temperatur bei 25 bis 28⁰C gehalten wird. Man rührt weitere 30 Minuten, kühlt auf O⁰C ab und gießt in ein Gemisch von 150 ml Eiswasser und 4,5 ml Eisessig. Das ausgefallene Jodid wird abgesaugt, mit Wasser gewaschen und bei 50⁰C getrocknet.

Dann löst man es bei 40⁰C in 100 ml Aceton, das 1 ml Wasser, 0,5 ml Eisessig und 20 g Kaliumacetat enthält, erhitzt 2 Stunden unter Rückfluß zum Sieden und rührt in 1,5 1 Eiswasser ein. Man saugt ab und wäscht mit 200 ml Wasser. Das feuchte Material wird in 120 ml Methanol heiß gelöst und nach Zu-

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satz einer Lösung von 3,1 g Natriumpyrosulfit in 45 ml Wasser 2 Stunden unter Rückfluß zum Sieden erhitzt. Dann werden 35 ml abdestilliert, worauf die 21-Acetoxyverbindung auskristallisiert. Nach dem Abfiltrieren und Trocknen wird das reine 16-Chlormethylen-4,6-pregnadien-17a,21 ^101-3,11,20-UiOn-21-acetat durch Umkristallisieren aus Essigester gewonnen. X_max = 281 ηΐμ, ε = 27 000.

Beispiel 17

Eine Suspension von 6,5 g 6-Methyl-16-fluormethylen - 4,6 - pregnadien - 17a - öl - 3,11,20 - trion in 98 ml Tetrahydrofuran und 59 ml Methanol wird innerhalb 3 Stunden portionsweise mit 9,8 g Jod und 9,8 g Calciumoxyd versetzt. Danach wird das Reaktionsgemisch in 2 1 Eiswasser, das 32 ml Eisessig enthält, eingegossen, der Niederschlag abgesaugt und getrocknet.

Die so erhaltenen 11 g rohes 21-Jodid werden in 550 ml Aceton gelöst und zusammen mit 33 g Kaliumacetat 20 Stunden unter Rückfluß gekocht. Danach wird das Aceton zum Teil unter vermindertem Druck abgezogen, das Gemisch mit Wasser verdünnt, der Niederschlag abgesaugt. Er wird noch feucht in einem Gemisch aus 130 ml Methanol, 3,25 g Natriumpyrosulfit und 48,5 ml Wasser 2 Stunden unter Rückfluß gekocht. Nach Abkühlen wird das Reaktionsgemisch mit Wasser verdünnt, der entstandene Niederschlag abgesaugt und getrocknet. Durch Umkristallisieren aus Aceton—Äther erhält man das 6-Methyl-16-fluormethylen-4,6-pregnadien-17a,21-diol-3,ll,20-trion-21-acetat. Xmax = 287 πΐμ, ε = 22 800.

Beispiel 18

Zu einer Lösung von 4,6 g 6-Fluor-16-fluormethylen-4,6-pregnadien-17a-ol-3,ll,20-trion in einem Gemisch aus 100 ml Tetrahydrofuran und 12 ml Methanol werden bei O⁰C unter Rühren 7,3 g Jod gegeben. Dann wird innerhalb einer Stunde tropfenweise eine 10%ige wäßrige Natriumhydroxydlösung zugegeben, bis die Jodfarbe verschwunden ist. Nach einer weiteren Stunde wird in Wasser eingegossen, der harzig ausfallende Niederschlag wird in Äther aufgenommen, die vereinigten Ätherauszüge werden mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und bei Raumtemperatur im Vakuum abgezogen. Die rohe 21-Jodverbindung wird in 300 ml Aceton mit 13,5 g wasserfreiem Kaliumacetat 24 Stunden am Rückfluß erhitzt. Anschließend wird die Reaktionslösung auf ein kleines Volumen eingedampft und mit Wasser versetzt. Das ausgeschiedene 6-Fluor-16 - fluormethylen - 4,6 - pregnadien - 17a,21 - diol -3,11, 20-trion-21-acetat wird abgesaugt und aus Aceton oder Methanol umkristallisiert. X_max = 281,5 πΐμ, ε = 25 000.

Beispiel 19

Ein 10-1-Fermenter mit einer Nährlösung aus 1% Hefeextrakt, pH 6,5, wird mit 500 ml einer Schüttelkultur von Bacillus sphaericus beimpft. Die Kultur wird bei 28 ⁰C wachsen gelassen. Nach 8 Stunden erhält die Fermentationslösung einen Zusatz von 5 g lo-Fluormethylen^o-pregnadien-ll^na^l-triol-3,20-dion oder dessen 21-Acetat, erhalten gemäß Beispiel 2 bzw. 1, in 200 ml Methanol. Die Umsetzung wird dünnschichtchromatographisch überwacht und ist nach 22 Stunden beendet. Die Kulturlösung wird dreimal mit je 8 1 Chloroform ausgeschüttelt und der aus dem eingeengten Extrakt erhaltene Rückstand aus Essigester umkristallisiert. Man erhält reines lo-Fluormethylen-Mjo-pregnatrien-ll/^na^l-triol-3,20-dion. X_max = 221, 254, 298 πΐμ, EJ* = 326, 258 und 340; F. 254 bis 255°C; [a]_B = +2,5° (Dioxan).

Beispiel 20

5 g des nach Beispiel 19 erhaltenen 16-Fluormethylen-l,4,6-pregnatrien-llß,17a,21-triol-3,20-dions werden in 30 ml Pyridin und 30 ml Essigsäureanhydrid 1 Stunde auf dem Dampfbad erwärmt. Das Gemisch wird in Wasser eingegossen und das ausgefallene lo-Fluormethylen-lAo-pregnatrien-ll/SjlTa^l-triol-3,20-dion-21-acetat abgesaugt. Die Reinigung erfolgt durch Umkristallisation aus Methanol. X_ma.x = 221, 254 und 298 ηΐμ, EJ ?_m = 290, 238 und 280; F. 246⁰C; [_a]» = +20^er (Chloroform).

Beispiel 21

2 g des nach Beispiel 19 erhaltenen 16-Fluormethylen-1,4,6-pregnatrien-l Iß, 17a,21-triol-3,20-dions werden zusammen mit 2 g Bernsteinsäureanhydrid in 20 ml trockenem Pyridin über Nacht stehengelassen. Danach läßt man das Reaktionsgemisch in verdünnte Schwefelsäure einlaufen, der Niederschlag wird abgesaugt und gut mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen wird durch Kristallisation aus Essigester das reine lo-Fluormethylen-l^o-pregnatrien - ίίβ,Πα,2ί - triol - 3,20 - dion - 21 - hemisuccinat gewonnen. X_max = 221, 254 und 298 πΐμ.

Beispiel 22

5 g des nach Beispiel 19 erhaltenen 16-Fluormethylen-l,4,6-pregnatrien-ll/S,17a,21-triol-3,20-dions werden in 120 ml absolutem Dioxan gelöst, mit 1,55 ml Chloracetylchlorid und 1,5 ml Pyridin versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird das Reaktionsgemisch in Wasser eingegossen, der Niederschlag abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das so erhaltene rohe 16 - Fluormethylen -1,4,6 -pregnatrien - ΙΙβ,Πα, 21-triol-3,20-dion-21-chloracetat wird in 400ml Aceton gelöst und mit 55 ml Diäthylamin und 4 ml Wasser über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird danach im Vakuum bei 20⁰C eingeengt. Dabei kristallisiert das 16 - Fluormethylen -1,4,6 - pregnatrien - 110,17a, 21 - triol - 3,20 - dion - 21 - diäthylaminoacetat aus. Imax = 221, 254 und 298 Ίημ.

0,7 g dieses 16-Fluormethylen-1,4,6-pregnatrien-110,17(1,21 - triol - 3,20 - dion - 21 - diäthylaminoacetats werden in 17 ml absolutem Tetrahydrofuran gelöst und mit 15 ml einer Chlorwasserstofllösung in Chloroform versetzt. Dabei fällt das 16-Fluormethylen-lAo-pregnatrien-ll&na^l-triol^O-dion-21-diäthylaminoacetathydrochlorid aus, das mit Tetrahydrofuran gewaschen und anschließend getrocknet wird.

Beispiel 23

10 g des nach Beispiel 19 erhaltenen 16-Fluormethylen-1,4,6-pregnatrien-l Iß, 17a,21-triol-3,20-dions werden in 20 ml absolutem Pyridin mit 9,3 g Phosphoryldimorpholidchlorid 10 Tage verschlossen stehengelassen. Man gießt dann den Ansatz in die berechnete Menge verdünnter Schwefelsäure und

extrahiert das 21-Dimorpholidphosphat mit Chloroform.

Der Chloroformrückstand wird in 40 ml Äthanol gelöst, mit Wasser bis zur ersten bleibenden Trübung versetzt und nach Zusatz von HOg »Amberlite IR-120« 36 Stunden gerührt. Man filtriert ab, wäscht den Austauscher ■ mit Äthanol, neutralisiert das Filtrat mit Natronlauge und engt unter vermindertem Druck stark ein. Man läßt abkühlen, extrahiert mit Chloroform alle Neutralteile, säuert dann die wäßrige Phase mit verdünnter Schwefelsäure an und extrahiert mit n-Butanol. Der Extrakt wird mit Natriumsulfat getrocknet, mit Natriummethylat neutralisiert und etwas eingeengt. Beim Abkühlen kristallisiert das Natriumsalz aus. Es wird abfiltriert, heiß mit Methanol extrahiert, der Extrakt mit Butanol versetzt und stark eingeengt, wobei das reine 16 - Fluormethylen -1,4,6 - pregnatrien -1 Iß, 17a, 21 - triol - 3,20 - dion - 21 - orthophosphat-Natrium ausfällt.

Beispiel 24

0,5 g des nach Beispiel 19 erhaltenen 16-Fluormethylen-l,4,6-pregnatrien-llj3,17a,21-triol-3,20-dions werden in 10 ml absolutem Chloroform und 3 ml absolutem Pyridin gelöst und bei 0⁰C im Laufe von 5 Minuten unter Rühren mit einer Lösung von 0,5 ml tert.-Butylessigsäurechlorid in 5 ml Chloroform versetzt. Man rührt weitere 5 Minuten bei Eiskühlung und dann 4 Stunden bei Raumtemperatur. Der Ansatz wird auf Eis gegossen und mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird mit verdünnter Schwefelsäure und Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird in Chloroform über 10 g »Florisil« filtriert und das Filtrat zur Trockne 'eingedampft. Aus Methanol kristallisiert das reine 21-tert.-Butylacetat.

Beispiel 25
910 mg des nach Beispiel 19 erhaltenen 16-Fluor-

ypg/
werden bei 0⁰C in eine Suspension aus 366 mg Schwefeltrioxyd-Pyridin-Komplex in 7 ml Pyridin gegeben und 2 Stunden bei 0⁰C gerührt sowie 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Man filtriert, zieht unter vermindertem Druck bei 4O⁰C das Pyridin ab, arbeitet den Rückstand mit Äther durch und filtriert das Pyridinsalz des Sulfats ab.

Dieses wird in 15 ml Methanol gelöst und mit 2,1 ml n-Natriummethylatlösung auf pH 10,4 eingestellt. Man filtriert, engt das Filtrat bei 40⁰C unter vermindertem Druck auf etwa 8 ml ein und fällt das lo-Fluormethylen-lAo-pregnatrien-ll^na^l-triol-3,20-dion-21-sulfat-Natriumsalz mit Äther aus.

Beispiel 26

55

In einem Kleinfermenter werden 15 1 einer Nährlösung aus 1% Hefeextrakt, pH 6,8, mit 0,5 1 Schüttelkultur von Bacillus sphaericus (Sammlung E. Merck, Nr. 1001) beimpft. Die Kultur wächst unter ständigern Rühren und starker Belüftung bei 28 ⁰C und erhält nach etwa 10 Stunden einen Zusatz von in 300 ml Methanol gelösten 7,5 g des nach Beispiel 3 erhaltenen 16 - Chlormethylen - 4,6 - pregnadien-11/3,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetats. Die Dehydrierung wird papierchromatographisch verfolgt (Lösungsmittelsystem B4 nach Bush, aufsteigend) und ist nach 28 bis 36 Stunden vollständig. Die Kulturlösung wird dreimal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert, die vereinigten Chloroformlösungen werden eingedampft. Aus Aceton kristallisiert das 16 - Chlormethylen - 1,4,6 - pregnatrien-Ilj8,17a,21-triol-3,20-dion. F. 244 bis 245⁰C; [a]l° = +5° (Dioxan); l_max = 219, 255,5 und 297 ηΐμ, E₁ ¹* = 335, 247 und 327.

Beispiel 27

5 g des nach Beispiel 26 erhaltenen 16-Chlormethylen-l,4,6-pregnatrien-ll^,17a,21-triol-3,20-dions werden mit 30 ml Pyridin und 30 ml Essigsäureanhydrid 1 Stunde auf dem Dampfbad erwärmt. Das Gemisch wird in Wasser eingegossen und das ausgefallene lo-Chlormethylen-lAo-pregnatrien-ll^na, 21-triol-3,20-dion-21-acetat abgesaugt. Die Reinigung erfolgt durch Umkristallisieren aus Methanol. X_max = 222, 255 und 296 πΐμ.

Beispiel 28

a) 10 g des nach Beispiel 1 erhaltenen 16-Fluormethylen-4,6-pregnadien-ll^,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetats werden in 80 ml absolutem Pyridin gelöst und bei 0⁰C mit einem Gemisch aus 8 g Chromsäureanhydrid und 80 ml Pyridin versetzt. Nach 12 Stunden wird das Reaktionsgemisch in 800 ml Essigester eingegossen, vom Niederschlag abgesaugt und mit Essigester gut nachgewaschen. Eindampfen der Essigesterlösungen führt zu 16-Fluormethylen-4,6-pregnadien - 17a,21 -diol - 3,11,20 - trion -21 - acetat {X_max = 281 πΐμ), das mit wäßrig-methanolischem Natriumhydrogencarbonat analog Beispiel 2 zu 16-Fluormethylen - 4,6 - pregnadien - 17a,21 - diol - 3,11,20 - trion verseift wird.

b) In einem Kleinfermenter von 201 Inhalt werden

15 1 einer Nährlösung aus 0,1% Hefeextrakt, pH 6,8, mit 1,51 Schüttelkultur von Cornynebacterium simplex (Sammlung E. Merck, Nr. 1002) beimpft. Die Kultur wächst unter ständigem Rühren und starker Belüftung bei 28 ⁰C und erhält nach etwa 4 bis 8 Stunden einen Zusatz von in 300 ml Methanol gelöstem 7,5 g 16 - Fluormethylen - 4,6 - pregnadien-17a,21-diol-3,ll,20-trion. Die Dehydrierung wird papierchromatographisch verfolgt und ist im allgemeinen nach 14 Stunden beendet. Die Kulturlösung wird dreimal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert, die vereinigten Chloroformlösungen werden eingedampft. Aus Aceton kristallisiert das

16 - Fluormethylen -1,4,6 - pregnatrien - 17a,21 - diol-3,11,20-trion. l_max = 222, 255 und 298 ηΐμ.

Beispiel 29

In einem Kleinfermenter werden 121 einer Nährlösung aus 0,1% Hefeextrakt mit 800 ml Submerskultur von Corynebacterium simplex beimpft. Die Kultur wächst unter Rühren und starker Belüftung bei 28 ⁰C und erhält nach 6 bis 8 Stunden einen Zusatz von in 200 ml Methanol gelöstem 6 g 16-Chlormethylen-4,6-pregnadien-17a,21-diol-3,ll,20-trion, das gemäß Beispiel 16 und durch daran anschließende Verseifung erhalten worden ist. Die 1 ^-Dehydrierung wird dünnschichtchromatographisch verfolgt und ist nach 5 bis 8 Stunden beendet. Die Kultur wird sofort dreimal mit dem gleichen Volumen Chloroform ausgerührt, die vereinigten Chloroformextrakte werden eingedampft, der Rückstand wird mit Petroläther gewaschen. Aus Chloroform kristallisiert das

16 - Chlormethylen -1,4,6 - pregnatrien - 17α,21 - diol-3,11,20-trion. l_max = 221, 254 und 298 ηΐμ.

Beispiel 30

5 g des nach Beispiel 4 erhaltenen 6-Methyl-16 - fluormethylen - 4,6 - pregnadien -11 ß, 17a,21 - triol-3,20 - dion - 21 - acetats werden zusammen mit 4,8 g 2,3 - Dichlor - 5,6 - dicyan - ρ - benzochinon in 75 ml Dioxan 20 Stunden unter Rückfluß gekocht. Danach wird das Reaktionsgemisch mit Chloroform verdünnt, nacheinander mit Wasser, verdünnter Natriumhydroxydlösung und wieder mit Wasser ausgeschüttelt, die Chloroformlösung getrocknet und eingeengt. Aus dem Rückstand kristallisiert das o-Methyl-lo-fluormethylen-lAo-pregnatrien-ll/?,!?«, 21-triol-3,20-dion-21-acetat, das sich durch Umkristallisieren aus Methanol reinigen läßt. X_max = 227, 253 und 304 πΐμ.

Beispiel 31

20

1 g des nach Beispiel 30 erhaltenen 6-Methyllo-fluormethylen-lAo-pregnatrien-ll&na^l-triol-3,20-dion-21-acetats wird in 25 ml Methanol zum Sieden erhitzt, sodann zu der siedenden Lösung eine heiße Lösung von 0,33 g Natriumhydrogencarbonat in 5 ml Wasser zugegeben und das Gemisch 7 Minuten zum Sieden erhitzt. Es wird in etwa 300 ml Wasser eingegossen und das ausgefallene rohe Verseifungsprodukt abgesaugt. Man erhält das 6-Methyl-16-fluormethylen-l,4,6-pregnatrien-ll)S,17a,21-triol-3,20-dion, das durch Umkristallisieren aus Aceton rein erhalten wird. X_max = 226, 253 und 303 πΐμ.

Beispiel 32

35

3,5 g des nach Beispiel 18 erhaltenen 6-Fluor-16 - fluormethylen - 4,6 - pregnadien - 17a,21 - diol-3,ll,20-trion-21-acetats werden in 70 ml Dioxan gelöst und mit 3,5 g 2,3-Dichlor-5,6-dicyan-p-benzochinon versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 6 Stunden unter Rückfluß gekocht, dann mit Chloroform verdünnt und nacheinander mit 30 ml 1 n-Natriumhydroxydlösung und mehrfach mit Wasser gewaschen. Die Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der aus o-Fluor-lo-fluormethylenl,4,6-pregnatrien-17a,21-diol-3,ll,20-trion-21-acetat bestehende Rückstand wird aus Aceton—Äther umkristallisiert. Imax = 224, 255 und 296 ηΐμ. .

5° Beispiel 33

2,3 g des nach Beispiel 3 erhaltenen 16-Chlormethylen-4,6-pregnadien-ll^,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetats werden in 23 ml absolutem Pyridin gelöst und bei 0⁰C mit einem Gemisch aus 2,3 g Chromsäureanhydrid und 23 ml Pyridin versetzt. Nach 12 Stunden wird das Reaktionsgemisch in 250 ml Essigester eingegossen, der Niederschlag abgesaugt und mit Essigester gut gewaschen. Die vereinigten Essigesterlösungen werden eingeengt, wobei das im Beispiel 16 beschriebene 16-Chlormethylen-4,6-pregnadien - 17a,21 - diol - 3,11,20 - trion - 21 - acetat auskristallisiert. Xmax = 281 Πΐμ, S = 27 000.

65 Beispiel 34

2 g des nach Beispiel 14 erhaltenen 16-Fluormethylen - 4,6 - pregnadien - 11α,17α,21 - triol - 3,20 - dions werden in 10 ml Pyridin gelöst und 0,36 g Essigsäureanhydrid zugegeben. Nach 15stündigem Stehen bei Zimmertemperatur wird in Wasser eingegossen, mit Chloroform dreimal extrahiert, die Chloroformlösung durch Schütteln mit Natriumhydrogencarbonatlösung neutralisiert, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der amorphe Rückstand von 16-Fluormethylen -11α,17α,21- triol - 3,20 - dion - 21 - acetat wird direkt in die nachfolgende Oxydation eingesetzt. Dazu wird das rohe Material in 70 ml Aceton gelöst und bei 10⁰C unter Rühren mit 1,5 ml einer Oxydationslösung tropfenweise versetzt. (Die Oxydationslösung wird durch Lösen von 5 g Chromtrioxyd in 4,4 ml konzentrierter Schwefelsäure und Auffüllen mit Wasser auf 20 ml hergestellt.) Man rührt den Oxydationsansatz 30 Minuten bei Zimmertemperatur und arbeitet mit Chloroform und Wasser wie üblich auf. Die neutral gewaschene und getrocknete Chloroformlösung wird unter vermindertem Druck zur Trockne abgezogen. Man erhält aus Methanol das 16 - Fluormethylen - 4,6 - pregnadien - 17a,21 - diol-3,ll,20-trion-21-acetat. X_max = 281,5 ηΐμ, ε = 25 400.

Beispiel 35

2,5 g o-Fluor-lö-fluormethylen-l^ö-pregnatrienll^,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat (erhalten aus dem Verfahrensprodukt des Beispiels 12 durch anschließende mikrobiologische Dehydrierung in 1(2)-Stellung analog Beispiel 19 und Acetylierung analog Beispiel 20) werden in 25 ml Pyridin gelöst und zu einer Mischung aus 2,5 g Chromsäureanhydrid und 25 ml Pyridin gegeben. Nach 12 Stunden wird das Reaktionsgemisch in 250 ml Essigester eingegossen und 5 Minuten am Rückfluß gekocht. Der Niederschlag wird abgesaugt und gut mit heißem Essigester gewaschen. Die Filtrate werden mit verdünnter Schwefelsäure neutral gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand von rohem 6-Fluor- 16-fluormethylen-l,4,6-pregnatrien-17a,21-diol-3,ll,20-trion-21-acetat wird durch Umkristallisieren aus Methanol oder Essigester rein erhalten. l_max = 221, 254 und 298 πΐμ.

Beispiel 36

. Ein 10-1-Fermenter mit einer Nährlösung aus 0,1% Hefeextrakt, die mit Sörensen-Phosphatpuffer auf pH 6,8 gepuffert ist, wird mit 500 ml einer Schüttelkultur von Corynebacterium simplex beimpft. Die Kultur wird bei 28 ⁰C wachsen gelassen. Nach 16 Stunden erhält die Fermentationslösung einen Zusatz von 5 g des nach Beispiel 5 erhaltenen 6-Methyl- lo-chlormethylen^o-pregnadien-ll^na, 21-triol-3,20-dions in 200 ml Methanol. Dünnschichtchromatographisch ist nach 14 Stunden neben dem Umsetzungsprodukt kein Ausgangsmaterial mehr nachzuweisen. Die Kulturlösung wird dreimal mit je 101 Chloroform ausgeschüttelt. Die vereinigten Extrakte werden eingeengt und der Rückstand aus Essigester umkristallisiert. Man erhält reines 6-Methyl -16 - chlormethylen -1,4,6 - pregnatrien -11/3,17«, 21-triol-3,20-dion. X_max = 227, 252 und 303 ΐημ.

Beispiel 37

3 g 6 - Fluor -16 - chlormethylen - 4,6 - pregnadien-SJl^O-trion-na^l-diol^l-acetat (erhalten aus dem Verfahrensprodukt des Beispiels 13 durch Acetylierung analog Beispiel 20 und nachfolgende Oxydation mit Chromtrioxyd analog Beispiel 34) werden in

200 ml Butanol mit 1,95 g Selendioxyd und 1,5 ml Eisessig 48 Stunden unter Rückfluß zum Sieden erhitzt. Das ausgefallene Selen wird abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Das anfallende 6-Fluor-lo-chlormethylen-1 Ao-pregnatrien-S, 11,20-trion- 17a,21-diol-21-acetat wird zur Reinigung über wenig Kieselgel chromatographiert. l_max = 224, 256 und 296 πΐμ.

B e i s ρ i e 1 38

Eine Suspension von 6,5 g o-Methyl-lo-chlormethylen - 4,6 - pregnadien -17a - öl - 3,11,20 - trion in 98 ml Tetrahydrofuran und 59 ml Methanol wird innerhalb 3 Stunden portionsweise mit 9,8 g Jod und 9,8 g Calciumoxyd versetzt. Danach wird das Reaktionsgemisch in 21 Eiswasser, das 32 ml Eisessig enthält, eingegossen, der Niederschlag abgesaugt und getrocknet.

Die so erhaltenen 11g rohes 21-Jodid werden in 550 ml Aceton gelöst und zusammen mit 33 g Kaliumacetat 20 Stunden unter Rückfluß gekocht. Danach wird das Aceton zum Teil unter vermindertem Druck abgezogen, das Gemisch mit Wasser verdünnt und der Niederschlag abgesaugt. Er wird noch feucht in einem Gemisch aus 130 ml Methanol, 3,25 g Natriumpyrosulfit und 48,5 ml Wasser 2 Stunden unter Rückfluß gekocht. Nach Abkühlen wird das Reaktionsgemisch mit Wasser verdünnt, der entstandene Niederschlag abgesaugt und getrocknet. Durch Umkristallisation aus Methanol erhält man das 6 - Methyl -16 - chlormethylen - 4,6 - pregnadienna^l-diol-SJl^O-trion-^l-acetat. X_max = 288,5 ηΐμ, f = 23 400.

Zum Nachweis der Überlegenheit der Verfahrensprodukte wurde deren antiphlogistische Wirkung mit derjenigen von Hydrocortison, Prednisolon und 16-Methylen-prednisolon im Granulombeuteltest an Ratten verglichen.

Die Versuehsanordnung entsprach der in Archives Internationales de Pharmacodynamie et de Therapie, Bd. Ill, S. 420 bis 436 (1957), beschriebenen Methode.

Für die Versuche wurden je Präparat und Dosis Gruppen von je zehn Tieren mit einem Körpergewicht zwischen 100 und 160 g eingesetzt. Die Tiere wurden am Rücken mit einer Haarschneidemaschine geschoren. Dann wurde durch subkutane Injektion von 25 ml Luft eine Luftblase gesetzt und in diese, ohne die Injektionskanüle herauszuziehen, 0,5 ml einer 0,5%igen Lösung von Krotonöl in Sesamöl injiziert. Am 4. Tag nach dem Setzen der Luftblase wurden nochmals 0,5 ml einer 3%igen Lösung von Krotonöl in Sesamöl injiziert. Die Füllungsgrade der Beutel an Exsudat wurden durch Transillumination erfaßt. Am 10. Tag nach der zweiten Krotonölinjektion wurden die Tiere getötet.

Die Versuchspräparate wurden 10 Tage lang oral verabreicht, beginnend mit dem Tag der zweiten Injektion von Krotonöl. Appliziert wurde eine 2,5%ige Suspension in 5%iger Gummiarabikumlösung.

Die prozentuale Abschwächung der Exsudatmengen gegenüber den Kontrollen wurde statistisch nach dem von Llaurado in Acta Endocrinologica, Bd. 38, S. 151 (1961), beschriebenen Verfahren ausgewertet, wobei sich die angegebenen Wirkungsrelationen im Vergleich zu Hydrocortison ergaben.

Das Ergebnis der Vergleichsversuche ist in
folgenden Tabelle niedergelegt. Darin bedeutet

I = Hydrocortison,
II = Prednisolon,

III = 16-Methylen-prednisolon,

IV = lö-Chlormethylen-o-dehydro-prednisolon,
V = lo-Fluormethylen-o-dehydro-hydrocortison, VI = 16-Fluormethylen-6-dehydro-prednisolon.

In der rechten Spalte der Tabelle sind die Wirkungsrelationen für die Exsudathemmung (Hydrocortison = 1) eingetragen.

I =	1
11 =	2,3
IH =	10
IV =	42
V =	22
VI =	147

Wie aus der obigen Tabelle zu entnehmen ist, sind die nach dem Verfahren der Erfindung erhaltenen Verbindungen erheblich stärker wirksam als die Vergleichssubstanzen .

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von Λ⁴·⁶- bzw. ^1,4,6.16-Halogenmethylen-3,20-diketo-steroiden der allgemeinen Formel I

   CH₂R₃

   CHR₄

   worin Ri = H, CH₃ oder F, R₂ = =O oder H, OH (α oder ß), R₃ = freie oder veresterte OH-Gruppe und R₄ = Cl oder F bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise

   a) ein 4-Dehydro-16-halogenmethylen-3,20-diketo-steroid der allgemeinen Formel II

   CH₂R₃

   O=*

   CHR₄

   (II)

   Ri

   worin Ri bis R₄ die angegebene Bedeutung

   609 609/405

   haben, durch Behandlung mit Chloranil in 6-Stellung dehydriert oder

   b) ein zl⁴·⁶-16-Halogenmethylen-3,20-diketosteroid der allgemeinen Formel III

   CH₂R₃

   (HI)

   20 CH₃

   CHR₄

   20

   worin R₁, R₃ und R4 die angegebene Bedeutung haben, durch Behandlung mit einem 11 - hydroxylierenden Mikroorganismus in Ha- bzw. llß-Stellung fermentativ hydroxyliert oder

   c) ein z!⁴·⁶-16-Halogenmethylen-3,20-diketosteroid der allgemeinen Formel IV

   (IV)

   worin R₁, R₂ und R4 die angegebene Bedeutung haben, durch aufeinanderfolgende Behandlung mit alkalischer Jodlösung und einem Alkaliacylat in die entsprechende 21-Acyloxyverbindung überführt,

   und daß man gegebenenfalls nach an sich bekannten Methoden in dem so hergestellten zI⁴'⁶-Steroid mit Hilfe eines chemischen oder mikrobiologischen Dehydrierungsmittels in 1(2)-Stellung eine Doppelbindung einführt und/ oder eine in 11-Stellung befindliche Hydroxygruppe durch Behandlung mit einem milden Oxydationsmittel in die ll-Ketogruppe überführt und/oder eine in 21-Stellung befindliche Estergruppe alkalisch verseift und/oder einen etwa erhaltenen 21-Alkohol in einen entsprechenden Ester bzw. in ein Salz eines solchen überführt.