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Verfahren zur Herstellung von ungesättigten 16-Methylen-3-keto-steroiden
Es wurde gefunden, daß 9.x-Fluor-16-methylen-4,6-pregnadien-llß,17a,21-triol-3,20-dion
(VIIa, vgl. das Reaktionsschema) und 21-Ester desselben (VIIb) hervorragende corticoide
Eigenschaften besitzen. Überraschenderweise sind diese Verbindungen stärker wirksam
als die entsprechenden in 6,7-Stellung gesättigten 16-Methylen-steroide.
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Es wurde gefunden, daß man diese Verbindungen nach dem Reaktionsschema
herstellen kann. Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur
Herstellung von ungesättigten 16-Methylen-3-keto-steroiden, welches darin besteht,
daß man in an sich bekannter Weise 16a,17cx-Oxido-16ß-methyl-4-pregnen-21-ol-3,20-dion
(Ia) oder einen entsprechenden 21-Ester (Ib) mit Chloranil behandelt und das erhaltene
16-Methylen-4,6-pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion (IIa bzw. den erhaltenen 21-Ester
(IIb) in 11a oder l lß-Stellung mikrobiologisch hydroxyliert, das erhaltene 11a-
bzw. llß-Hydroxysteroid (IIIa, b) zu dem entsprechenden 9(11)-Dehydrosteroid (IVa,
b) dehydratisiert, an die 9(11)-ständige Doppelbindung dieser Verbindung (IVa, b)
HOBr oder HOCl anlagert, das so erhaltene 9a-Brom- bzw. 9x-Chlor-1 lß-hydroxy-steroid
(V a b) mit einem alkalischen Mittel behandelt und das gebildete 9ß,11ß-Oxido-steroid
(VIa, b) in bekannter Weise durch Einwirkung von Fluorwasserstoff in 9x-Fluor-16-methylen
- 4,6 - pregnadien - l Iß,17oc,21 - triol - 3,20-dion (VIIa) bzw. den entsprechenden
21-Ester (VII b) umwandelt und daß man gegebenenfalls eine in den erhaltenen Zwischen-
oder Endprodukten in 21-Stellung vorhandene Hydroxygruppe nach bekannten Methoden
verestert bzw. eine an dieser Stelle befindliche Estergruppe nach bekannten Methoden
verseift. Die Durchführung der Verfahrensstufe Ia, b -> Ha, b erfolgt gemäß der
Erfindung durch Behandlung mit Chloranil. Dabei findet nicht nur die Dehydrierung
in 6(7)-Stellung statt, sondern überraschenderweise wird gleichzeitig der Epoxydring
in 16a,17a-Stellung aufgespalten unter Bildung der 17a-Hydroxygruppe und der exocyclischen
Methylengruppe in 16-Stellung. Die Chloranilbehandlung führt man vorteilhaft in
Gegenwart eines inerten Lösungsmittels, wie Benzol, Toluol, Xylol, Chloroform, Methylenchlorid,
Aceton, Methanol, Äthanol, tert.Butanol, Tetrahydrofuran oder Eisessig, durch. Zweckmäßig
arbeitet man in der Wärme, gegebenenfalls bei Siedetemperatur des verwendeten Lösungsmittels.
Das Chloranil wird im Molverhältnis 1: 1 angewendet. Ein Überschuß ist nicht schädlich.
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Für die nach der Erfindung durchzuführende mikrobiologische Hydroxylierung
der Verbindungen IIa, b kommen die üblichen 11-hydroxylierenden Mikroorganismen
in Frage, die beispielsweise den folgenden Gattungen angehören können: 1 lß-Hydroxylierung
Absidia, Acrothecium, Botrytis, Cephalothecium, Chaetomella, Colletotrichum, Coniothyrium,
Corticium, Cunninghamella, Curvularia, Dothichiza, Epicoccum, Mucor, Pycnosporium,
Rhodoseptoria, Spondylocladium, Stachylidium, Streptomyces, Thamnidium, Trichothecium.
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11 x-Hydroxylierung: Absidia, Aspergillus, Cephalothecium, Cercospora,
Coryneum, Cunninghamella, Dactylium, Delacroixia, Eurotium, Fusarium, Gloeosporium,
Glomerella, Helicostylum, Metarrhizium, Mucor (und andere Gattungen der Ordnung
Mucorales), Neurospora, Penicillium, Pestalotia, Rhizopus, Sporotrichium, Trichoderma,
Trichothecium, Bacillus.
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Die Dehydratisierung der Verbindungen Hl a, b unter Erhalt der entsprechenden
9(11)-Dehydro-Verbindungen IV a, b kann nach den üblichen Methoden durchgeführt
werden. Bei Verwendung von llß-Hydroxysteroiden sind alle üblichen trans-Dehydratisierungsmittel
geeignet, z. B. Phosphoroxychlorid oder Thionylchlorid in Pyridin. Bei Verwendung
von lla-Hydroxysteroiden als Ausgangsmaterial sind die üblichen cis-Dehydratisierungsmethoden
geeignet, z. B. Veresterung der 11 a-Hydroxgruppe und anschließende basische
oder thermische Abspaltung der entsprechenden Säure.
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Überraschenderweise gelingt es nach dem Verfahren der Erfindung, an
die 9(11)-ständige Doppelbindung
des 16-Methylen-4,6,9(11)-pregnatrien-17:x,21-diol-3,20-dions
(IV a) bzw. eines entsprechenden 21-Esters (IVb) HOBr bzw. HOCI anzulagern, ohne
daß die ebenfalls reaktionsfähige Doppelbindung in 6(7)-Stellung bei der Behandlung
mit HOBr bzw. HOCI liefernden Mitteln wesentlich angegriffen wird. Es wurde festgestellt,
daß die 6(7)-ständige Doppelbindung ebenso wie die exocyclische Doppelbindung in
16-Stellung nur in äußerst geringem Umfang reagiert.
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Aus dem so erhaltenen 9x-Brom- bzw. 9x-Chlor-1 lß-hydroxy-steroid
(Va, b) wird durch übliche Behandlung mit einem alkalischen Mittel, vorzugsweise
mit einem Alkaliacylat, wie Kaliumacetat, das entsprechende 9ß,llß-Oxido-steroid
(VIa, b) hergestellt, das durch Behandlung mit Fluorwasserstoff bei tiefen Temperaturen
in einem inerten Lösungsmittel, wie Chloroform, Methylenchlorid, Tetrahydrofuran
oder Dioxan, in 9x - Fluor - 16 - methylen - 4,6 - pregnadien-1 lß,17x,21-triol-3,20-dion
(VII a) bzw. den entsprechenden 21-Ester (VIIb) umgewandelt wird.
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Nach dem Verfahren der Erfindung ist es ferner möglich, eine in 21-Stellung
befindliche Hydroxygruppe der erhaltenen Zwischen- oder Endprodukte nach üblichen
Methoden zu verestern. Als Veresterungsmittel sind alle diejenigen Säuren bzw. deren
zur Veresterung geeignete Derivate verwendbar, die physiologisch verträgliche Ester
ergeben. Zum Beispiel können die folgenden Säuren oder deren zur Veresterung geeignete
Derivate verwendet werden Carbonsäuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure,
Trimethylessigsäure, Cyclopentylpropionsäure, Phenylpropionsäure, Phenylessigsäure,
Capronsäure, Caprylsäure, Palmitinsäure, Undecylensäure, aber auch Benzoesäure oder
Hexahydrobenzoesäure, sowie Halogencarbonsäuren, z. B. Chloressogsäure. Gegebenenfalls
kann man zur Herstellung wasserlöslicher Derivate die 21-Hydroxygruppe auch mit
Dicarbonsäuren, Amino- oder Alkylaminocarbonsäuren oder mit Phosphor- oder Schwefelsäure
verestern. Auf diese Art lassen sich z. B. herstellen: Succinate, Oxalate sowie
Aminocarbonsäureester, z. B. Asparaginsäure-oder Diäthylaminoessigsäureester, in
Form ihrer Säureadditionssalze.
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Ferner ist es nach dem Verfahren der Erfindung möglich, eine in 21-Stellung
der erhaltenen Zwischen-oder Endprodukte befindliche Estergruppe nach üblichen Methoden
zu verseifen. Als Verseifungsmittel können z. B. wäßrige Lösungen von Natriumhydrogencarbonat,
Natriumcarbonat oder Natriumhydroxyd verwendet werden. Vorteilhaft arbeitet man
dabei unter Ausschluß von Sauerstoff.
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In der USA.-Patentschrift 2 865 808 wird bereits ein Verfahren zur
Herstellung der Verbindungen VIIa, b beschrieben, doch sind in dieser USA.-Patentschrift
weder von den Zwischen- noch von den Endprodukten physikalische Daten angegeben.
Das Verfahren nach der Erfindung ist wesentlich vorteilhafter als das in der USA.-Patentschrift
2 865 808 beschriebene Verfahren. Die Vorteile bestehen im wesentlichen darin, daß
die 16-ständige Methylengruppe nach dem Verfahren der Erfindung auf einem erheblich
einfacheren Weg eingeführt und ein Ausgangsmaterial verwendet werden kann, das leichter
zugänglich ist als das 16-Ketosteroid, das bei dem Verfahren nach der zitierten
USA.-Patentschrift als Ausgangsmaterial dient.
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Das gemäß Beispiel 1 als Ausgangsmaterial verwendete 16a,17x-Oxido-4-pregnen-17x,21-diol-3,20-dion-21-acetat
ist aus dem 16-Methyl-5,16-pregnadien-3ß-ol-20-on acetat durch Epoxydierung in 16,17-Stellung
mit alkalischem Wasserstoffperoxyd, anschließende Oxydation zur entsprechenden 3-Keto-4-dehydro-Verbindung
nach der Methode von Oppenauer und darauffolgende Jodierung und Umsetzung mit einem
Alkaliacetat in 21-Stellung zugänglich. Für die Herstellung des verfahrensgemäß
eingesetzten Ausgangsverbindungen wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung Schutz
nicht begehrt.
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Die Verfahrensprodukte können im Gemisch mit üblichen Arzneimittelträgern
in der Human- oder Veterinärmedizin eingesetzt werden. Als Trägersubstanzen kommen
solche organischen oder anorganischen Stoffe in Frage, die für die parenterale,
enterale oder topikale Applikation geeignet sind und die mit den Verfahrensprodukten
nicht in Reaktion treten, beispielsweise Wasser, pflanzliche Öle, Polyäthylenglykole,
Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, Vaseline oder Cholesterin.
Zur parenteralen Applikation dienen insbesondere Lösungen, vorzugsweise ölige oder
wäßrige Lösungen, sowie Suspensionen, Emulsionen oder Implantate. Für die enterale
Applikation können ferner Tabletten oder Dragdes, für die topikale Anwendung Salben
oder Cremes, die gegebenfalls sterilisiert oder mit Hilfsstoffen, wie Konservierungs-,
Stabilisierungs- oder Netzmitteln oder Salzen zur Beeinflussung des osmotischen
Druckes, oder mit Puffersubstanzen versetzt sind, angewendet werden.
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Die nach dem Verfahren der Erfindung erhaltenen Endprodukte werden
in den verschiedenen Applikationsformen in Einzeldosen zwischen 0,3 und 1 mg angewendet.
Beispiel 1 a) Die Lösung von 2 g 16ß-Methyl-16x,17a-oxido-4-pregnen-21-ol-3,20-dion-21-acetat
(Ib, Y = O Acetyl) in 60 ml Tetrahydrofuran wird nach Zugabe von 1,58 g Chloranil
12 Stunden unter Rückfiuß erhitzt. Danach wird das Reaktionsgemisch mit Wasser verdünnt
und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte werden mit verdünnter Natronlauge und
danach mit Wasser gewaschen und getrocknet. Aus den eingedampften Extrakten kristallisiert
mit Methanol das 16-Methylen - 6 - dehydro - Reichsteins - Substanz-S-[21- acetat
(II b, Y = O - Acetyl). Am. 282 mA,] s = 25100; F. 206 bis 207°C; [a]D in Chloroform
-f-26,6°.
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b) In einem Kleinfermenter werden 151 einer Nährlösung aus 501,) Malzextrakt,
10/, Saccharose, 0,2"/, Natriumnitrat, 0,1 °/o Dikaliumphosphat, 0;05 °/a
Magnesiumsulfat, 0,05 °/o Kaliumchlorid und 0,005 °/o Eisen(rI)-sulfat (pH eingestellt
auf 7,0) mit 800 ml einer Schüttelkultur von Curvularia lunata (Wakker) Boadijn
beimpft und unter Rühren und starker Belüftung bei 28°C bebrütet. Nach 24stündigem
Wachstum werden 5 g 16-Methylen-6-dehydro-Reichsteins-Substanz-S-21-acetat (IIb,
Y = O-Acetyl), gelöst in 40 ml Dimethylformamid, zugesetzt. Die Umsetzung wird papierchromatographisch
verfolgt. Wenn im Papierchromatogramm kein Ausgangsmaterial mehr nachweisbar ist,
wird die Kulturlösung dreimal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. Die
vereinigten Chloroformlösungen werden eingedampft und der Rückstand nach dreimaligem
Digerieren mit Petroläther aus Aceton kristallisiert. Das erhaltene 16-Methylen-6-dehydrohydrocortison
(IIIa)
zeigt im UV-Licht ein Maximum bei 283 m#L, e = 24900; F.
234 bis 236°C; [x]D+81° (Dioxan).
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e) 5,1 g 16-Methylen-6-dehydro-hydrocortison (III a) werden mit 25m1
Pyridin und 25m1 Essigsäureanhydrid eine Stunde auf dem Dampfbad erwärmt. Das Gemisch
wird in Wasser eingegossen und das ausgefallene 16 - Methylen - 6 - dehydro - hydrocortison-21-acetat
(IIIb, Y = O-Acetyl) abgesaugt. Die Reinigung erfolgt durch Umkristallisieren aus
Aceton. Am.. 283 m#t, = 25000; F. 222°C; [a]D+91 °. (Chloroform).
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d) 1,5 g 16-Methylen-6-dehydro-hydrocortison-21-acetat (IIIb, Y =
O-Acetyl) werden in 15 ccm Pyridin mit 0,250 ccm Thionylchlorid versetzt. Das Reaktionsgemisch
wird anschließend 15 Minuten auf 100°C erhitzt. Nach dem Erkalten wird das Gemisch
in 100 ccm Wasser eingegossen, und die ausgefallenen Kristalle werden abgesaugt.
Man erhält 16-Methylen-4,6,9(11)-pregnatrien-17a,21-diol-3,20-dion-21-acetat (IV
b, Y = O-Acetyl), das aus Essigester umkristallisiert wird. Amax 283 m#t, e = 24500.
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e) 7,0g 16-Methylen-4,6,9(11)-pregnatrien-17a,21-diol-3,20-dion-21-acetat
(IVb, Y = O-Acetyl) werden in 280 ml Dioxan und 36 ml Wasser gelöst, 4,1 g N-Bromsuccinimid
und 1,51 ml 70°/oige Perchlorsäure zugegeben und eine Stunde bei Zimmertemperatur
stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird in Wasser eingegossen, der ausgefallene
Niederschlag abgesaugt, mit Wasser nachgewaschen und getrocknet. Das rohe 16-Methylen-6-dehydro-9a-brom-hydrocortison-21-acetat
(Vb, Y = O-Acetyl, X = Br) wird direkt in die nachfolgende Stufe eingesetzt.
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f) Das in der vorigen Stufe erhaltene rohe 16-Methylen-6-dehydro-9a-brom-hydrocortison-21-acetat
(Vb, Y = 'O-Acetyl) wird in 400 ml Äthanol gelöst, mit 17 g Kaliumacetat versetzt
und die Lösung 2 Stunden unter Rückfluß gekocht. Das Gemisch wird in Wasser eingegossen
und die entstehende Emulsion mehrfach in Chloroform extrahiert. Die vereinigten
Chloroformlösungen werden in üblicher Weise aufgearbeitet. Der Eindampfrückstand
ergibt nach Filtration über Kieselgel und aus Methanol umkristallisiert das 16-Methylen-6-dehydro-9ß,llß-oxido-4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion-21-acetat
(VIb, Y = O-Acetyl). Am"., 283 bis 284 m#t, e = 24300; F. 209°C; [a]e in Chloroform
-I-5°.
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g) 3,8 g 16-Methylen-6-dehydro-9ß,llß-oxido-4-pregnen -17a,21- diol
- 3,20 - dion-21- acetat (VI b, Y = O-Acetyl) werden in 38 ml absolutem Chloroform
gelöst und bei -60°C zu 23 ml eines Gemisches von 36 ml Tetrahydrofuran, 13,5 ml
Chloroform und 23 g Fluorwasserstoff gegeben. Die Reaktionslösung wird 4 Stunden
bei -30°C, anschließend weitere 4 Stunden bei 0°C stehengelassen. Sie wird dann
in Natriumhydrogencarbonatlösung eingegossen, das Steroid mit Chloroform extrahiert,
die Chloroformlösung getrocknet und eingedampft. Der aus 9a-Fluor-16-methylen-6-dehydrohydrocortison-21-acetat
(VIIb, Y = O-Acetyl) bestehende Rückstand wird aus Aceton umkristallisiert. Rmax
280 MD, s = 23500; F.228 bis 229°C; [x]D in Dioxan -1-50°.
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h) 1,1 g 9a-Fluor-16-methylen-6-dehydro-hydrocortison-21-acetat (VIIb,
Y = O-Acetyl) werden in 25 ml Methanol zum Sieden erhitzt, sodann wird zu der siedenden
Lösung eine heiße Lösung von 0,37 g Natriumhydrogencarbonat in 5 ml Wasser zugegeben
und das Gemisch 7 Minuten zum Sieden erhitzt. Es wird in etwa 300 ml Wasser eingegossen
und das ausgefallene rohe Verseifungsprodukt abgesaugt. Man erhält 9x-Fluor-16-methylen-6-dehydro-hydrocortison
(VIIa), das aus Aceton umkristallisiert wird. Amax 280 mp., e = 23100; F. 267 bis
268°C; [a]D in Dioxan -1-23,8°.
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Beispiel 2 a) In einem Kleinfermenter werden 151 einer geeigneten
Nährlösung (z. B. 5 °/o Glukose, 0,1 °/o Hefeextrakt, 0,05 °/o Sojamehl,
0,30/, NaN03, 0,05 °/o MgS04 - 7 H20, 0,1 °/o KH,P04, 0,05 °/o KCl, 0,001
°/o FeS04 - 7 H20) mit 750 ml einer gut gewachsenen Schüttelkultur von Fusarium
sp. (Sammlung E. Merck Nr. 2083) beimpft. Die Kultur wächst unter starkem Belüften
und Rühren bei 28'C und erhält nach 24 Stunden einen Zusatz von 5 g des nach Beispiel
1, a) hergestellten 16-Methylen-6-dehydro-Reichsteins-Substanz-S-21-acetats (IIb,
Y = O-Acetyl) in 40m1 Dimethylformamid. Die Umsetzung wird papierchromatographisch
verfolgt. Wenn im Chromatogramm keine Ausgangssubstanz mehr nachweisbar ist, wird
der Ansatz abgebrochen und die Kulturlösung dreimal mit 101 Chloroform extrahiert.
Der vereinigte Chloroformextrakt wird eingedampft, der Rückstand mit Petroläther
digeriert und aus Aceton umkristallisiert. Man erhält reines 16-Methylen-6-dehydro-11-epi-hydrocortison
(IIIa). .imax 283,5 mp@, e = 23900.
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b) 2 g 16-Methylen-6-dehydro-ll-epi-hydrocortison (III a, Y = OH)
werden in 10 ml Pyridin gelöst und 0,36 g Essigsäureanhydrid zugegeben. Nach 15stündigem
Stehen bei Zimmertemperatur wird in Wasser eingegossen, mit Chloroform dreimal extrahiert,
die Chloroformlösung durch Schütteln mit Natriumhydrogencarbonatlösung neutralisiert,
getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der amorphe Rückstand von 16-Methylen-6-dehydro-11-epi-hydrocortison-21-acetat
(IIIb, Y = O-Acetyl) wird direkt in die nachfolgende Verfahrensstufe eingesetzt.
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e) Der aus 5 g 16-Methylen-6-dehydro-11-epihydrocortison (IIIa) gemäß
Beispiel 2, b) erhaltene Ester (IIlb, Y = O-Acetyl) wird in 25 ml absolutem Chloroform
und 25 ml Pyridin gelöst. Unter Kühlen auf 0°C und Rühren werden 7 g p-Toluolsulfonsäurechlorid
zugegeben. Das Gemisch wird noch 2 Stunden bei 0°C weitergerührt, anschließend über
Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen, in Wasser eingegossen und mehrfach mit
Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformlösungen werden neutralisiert und
getrocknet. Nach Eindampfen wird der Rückstand von 16-Methylen-6-dehydro-ll-epi-hydrocortison-11-tosylat-21-acetat
aus Methanol umkristallisiert.
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Der auf diese Weise erhaltene Ester wird in 70 ml Eisessig gelöst
und nach Zugabe von 9 g wasserfreiem Natriumacetat 30 Minuten unter Rückfluß gekocht.
Das Gemisch wird in 500 ml Wasser eingerührt und die Fällung von rohem 16-Methylen-4,6,9(11)-pregnatrien
- 17a,21 - diol - 3,20 - dion-21-acetat (IV b, Y = O-Acetyl) abgesaugt. Das Produkt
wird zur Reinigung aus Essigester umkristallisiert. Amax 283 m#t, e = 24500.
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Das erhaltene 16-Methylen-4,6,9(11)-pregnatrien-17a,21-diol-3,20-dion-21-acetat
(IVb, Y = O-Acetyl) wird anschließend, wie in den Beispielen 1, e) bis h) beschrieben,
in 9x-Fluor-16-methylen-6-dehydrohydrocortison (VII a) umgewandelt.
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5,5 g 9x-Fluor-16-methylen-6-dehydro-hydrocortison (erhalten nach
Beispiel 1 oder 2) und 27 ml
tert.-Butylessigsäureanhydrid werden
in 27 ml Pyridin eine Stunde auf dem Dampfbad erhitzt. Nach dem. Abkühlen wird in
Wasser eingegossen, die entstehende Suspension mit Chloroform extrahiert und der
durch Eindampfen erhaltene Rückstand von 9a-Fluor-16-methylen- 6-dehydro-hydrocortison-21-tert.-butylacetat
aus Aceton umkristallisiert. Am" 280 mt,, s = 22700; F. 238'C.