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Verfahren zur Herstellung von in l-und 4-Stellung ungesättigten Steroiden
Es wurde gefunden, dass in l-und 4-Stellung ungesättigte Steroide der Pregnanreihe der allgemeinen Formel I,
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sättigten Steroide aufweisen.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der in 1- und 4-Stellung ungesättigten Steroide der Formel I, das darin besteht, dass man entsprechende Steroide, die in 11-oder 11-und 21Stellung nicht substituiert sind, auf mikrobiologische Weise hydroxyliert, indem man durch Behandlung mit Mikroorganismen der Gattung Rhizopus oder Aspergillus, vorzugsweise der Arten Rhizopus nigricans, Rhizopus arrhizus oder Aspergillus niger, die lla-Hydroxylgruppe oder durch Behandlung mit Mikroorganismen der Gattung Curvularia oder Cunninghamella, vorzugsweise der Arten Curvularia lunata oder
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handelt.
Sofern die als Ausgangsstoffe verwendeten Steroide ausser in 11- und gegebenenfalls in 21-Stellung auch in 17a-Stellung nicht substituiert sind, kann man ferner zur Einführung der 17a-Hydroxylgruppe mit Mikroorganismen der Gattung Trichothecium, vorzugsweise der Art Trichothecium roseum, behandeln.
Nach der Erfindung kann man die erhaltenen Endprodukte weiterhin mit organischen oder anorganischen Säuren in 21-Stellung verestern. Falls die Endprodukte in l1-Stellung eine Hydroxylgruppe enthalten, kann man diese mit einem milden Oxydationsmittel in eine l1-Ketogruppe umwandeln.
Die mikrobiologischen Umwandlungen können in verschiedener Reihenfolge durchgeführt werden.
Man kann z. B. zunächst eine 11-Hydroxylgruppe einführen und gegebenenfalls anschliessend in 17- und/ oder 21-Stellung hydroxylieren. Anderseits ist es auch möglich, von Verbindungen auszugehen, die be-
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In einigen Fällen ist es vorteilhaft, die bereits im Molekül vorhandenen Hydroxylgruppen vor der folgenden mikrobiologischen Reaktion zu schützen, indem man sie verestert.
Wie schon oben erwähnt, ist es möglich, die Endprodukte mit einer Hydroxylgruppe in 11-Stellung durch Behandlung mir einem milden Oxydationsmittelin dieentsprechendenll-Ketoverbindungen umzuwandeln. Als Oxydationsmittel hiefür eignet sich insbesondere eine Lösung von Chromsäure in Pyridin.
Die oben ebenfalls schon erwähnte fakultative Veresterung der 21-Hydroxylgruppe der erfindungsgemässen Endprodukte dient besonders zur Herstellung von Produkten mit guter Wasserlöslichkeit und/oder erhöhter Wirkungsdauer. Die Veresterung kann mit einer organischen oder anorganischen Säure oder einem zur Veresterung geeigneten Derivat einer solchen Säure vorgenommen werden. Es können zur Veresterung z. B. die folgenden Säuren oder deren zur Veresterung geeignete Derivate verwendet werden : Alkancarbonsäuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, oder anorganische Säuren, wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure, mehrbasische organische Säuren, wie Bernsteinsäure, Maleinsäure, Malonsäure, Zitronensäure oder Weinsäure usw.
Es ist gewöhnlich am einfachsten, die Veresterung durch Behandlung eines 21-Hydroxy-steroids der Formel I mit einem Säureanhydrid oder Säurechlorid in Gegenwart oder Abwesenheit einer Base vorzunehmen. Man kann die Veresterung aber auch durchführen, indem man das betreffende 21-Hydroxy-steroid unter dehydratisierenden Bedingungen in Gegenwart eines sauren Katalysators mit einer freien Säure behandelt.
Nach der Erfindung werden die folgenden Endprodukte erhalten : l, 4-Pregnadien-3, ll, 20-trion-
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Die Verbindungen nach der Erfindung können z. B. per os in Form von Tabletten gegeben werden, wobei die üblichen für pharmazeutische Zubereitungen verwendeten Trägersubstanzen zugemischt werden können. Ferner können die neuen Substanzen in Form ihrer wasserlöslichen Ester auch parenteral appliziert werden. Zur Herstellung von solchen Lösungen werden die Verbindungen in einem geeigneten, nicht toxischen flüssigen Träger gelöst oder suspendiert. Ferner lassen sich die neuen Substanzen zu Zäpfchen oder Dragees verarbeiten.
Für die lokale äusserliche Anwendung können die Endprodukte nach der Erfindung zu Salben oder Cremes verarbeitet werden, wobei die üblichen Salben- oder Cremegrundlagen Verwendung finden können.
Beispiel l : a) Zu 61 einer 24h-Wachstumskultur vonRhizopusnigricanswird lg 1, 4-Pregnadien-21-ol-3, 20-dion in 200 cm3 Äthanol hinzugefügt. Nach einer 48stündigen Wachstums periode in der Anordnung und in dem Medium, wie in Journal of the Amer can Chemical Society, Band 74 [1952], S. 5933, beschrieben, wird die Kultur mit Methylenchlorid extrahiert, der Extrakt unter vermindertem Druck eingeengt und der rohe kristalline Rückstand aus Aceton-Hexan umkristallisiert.
Man erhält das kristalline 1, 4-Pregnadien- - l1a, 21-diol-3, 20-dion.. b) Eine Lösung von 3 g 1, 4-Pregnadien-llcx, 21-diol-3, 20-dion in 30 ems Pyridin wird unter Rühren langsam zu 1, 5 g einer Lösung von Chromsäure in 15 cama Pyridin (vgl. Journal of the American Chemical Society, Band 75 [1953], S. 422) hinzugeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Zimmertemperatur weitergerührt. Anschliessend werden 4, 5 g Natriumsulfit in 45 cm3 Wasser hinzugefügt, und das Rühren wird für weitere 2 h fortgesetzt. Danach wird die Reaktionslösung in 600 cm3 Wasser eingegossen und die wässerige Lösung anschliessend dreimal mit Methylenchlorid extrahiert.
Die Extrakte werden nacheinander mit verdünnter Schwefelsäure, wässerigem Natriumcarbonat und Wasser gewaschen und anschliessend über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird abgedampft, und man erhält nach Umkristallisieren des Rückstandes aus Aceton-Hexan kristallines 1, 4-Pregnadien-21-ol-3, ll, 20-trion. c) 2 1 Czapek-Dox-Medium werden in einem Schüttelkolben sterilisiert und mit einem Stamm von Trichothecium roseum angeimpft. Nach dreitägigem Schütteln bei 270C werden der Kultur aseptisch 500 mg 1, 4-Pregnadien -21-01-3, 11, 20 -trion in 15 ml Aceton zugefügt. Das Schütteln wird 60 h bei 270C fortgeführt. Das Mycel wird abgetrennt und ebenso wie das wässerige Filtrat mit Methylenchlorid¯ extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden gut mit Wasser gewaschen, getrocknet und konzentriert.
Die konzentrierte Lösung wird über Florisil (Magnesiumsilikat) chromatographiert und 1-Dehydro-cortison wird in den 0, 5 und 1,0%Methanol enthaltenden Methylenchloridfraktionen eluiert und anschliessend mit Methylenchlorid aus der Säule gewaschen. Die Umkristallisation der erhaltenen Kristalle aus Aceton liefert reines 1-Dehydro-cortison (= , 4-Pregnadien-17K, 21-diol-3, ll, 20-trion), Fp. 226-229 C (Zersetzung).
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Beispiel 2 : a) Eine Kultur von Curvularia lunata (Identifizierung nach "United States Quartermaster Corps.
Philadelphia) lässt man in Kolben wachsen, die das gleiche Medium enthalten, wie es in Beispiel 1 der USA-Patentschrift Nr. 2, 658, 023 beschrieben ist. 100 ml dieses Impfmittels werden unter sterilen Bedingungen in 2 1 eines wässerigen Mediums gegeben, das die folgenden Bestandteile enthält :
Rohrzucker 1 g "Difco"-Trypton (hergestellt durch tryptische Verdauung von Casein 1 g
Natriumnitrat 0, 2 g
Dikaliumhydrogenphosphat 0, 1 g
Magnesiumsulfat-Heptahydrat 0, 05 g"
Kaliumchlorid 0, 05 g
Ferrosulfat-Heptahydrat 0, 001 g
Diese Mischung wird mit Schwefelsäure auf ein PH von 7 gebracht und, ehe die Mischung sterilisiert wird, wird 0, 250/0 Calciumcarbonat zugesetzt.
Das geimpfte Medium wird 24 h bei 27 - 280c belüftet, u. zw. pro Minute mit etwa 1/2-1/1 des Volumens der Lösung. Während dieser Zeit wird die Mischung mit einem Rührer, der mit etwa 1700 Umdr/min rotiert, gerührt. 1/2 g von l, 4-Pregnadien-21-ol- -3,20-don wird in 20 ml 95% Lgem Äthanol gelöst, Die Lösung wird der Fermentationsmischung unter sterilen Bedingungen zugefügt. Die Reaktion wird dann weitere 24 h unter den gleichen Bedingungen fortgesetzt.
Die Fermentationsmischung wird mit 3 Teilen Methylenchlorid extrahiert, die vereinigten Extrakte werden über Magnesiumsulfat getrocknet und auf ein kleines Volumen eingeengt. Die konzentrierte Lösung wird einer Säule von Florisil (Magnesiumsilikat ; 30 g) zugefügt, die mit Hexan beschickt ist, und wird anschliessend mit Hexan, das Äther in wechselnden Mengen (zwischen 1 und 99%) enthält, eluiert.
Das erwünschte Produkt wird aus den am stärksten voneinander entfernten Elutionen (25% Äther -- 99% Äther) gesammelt und aus Aceton-Hexan umkristallisiert, wobei kristallines 1, 4-Pregnadien-1l8, 21-diol- - 3, 20-dion erhalten wird. b) Analog Beispiel 1b) wird 1, 4-Pregnadien -118, 21-diol-3, 20-dion in I, 4-Pregnadien -21-01- -3, 11, 20-trion umgewandelt, von dem man nach Beispiel lc) zum l, 4-Pregnadien-17a, 21-diol- -3,11,20-trio gelangt.
Beispiel 3 : Analog Beispiel 1c) wird 1. 4-Pregnadien-lla, 21-diol-3, 20-dion (das Produkt von Beispiel la) in 1,4-Pregnadien-11α, 17α, 21-triol-3,20-dion umgewandelt, Das Endprodukt wird durch
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-2%ol-3, 20-dion mit einem Schmelzpunkt von 243-245 C.
Beispiel 4 : Analog Beispiel 1c) wird l, 4-Pregnadien-llss, 21-diol-3, 20-dion (das Produkt von Beispiel 2a) in 1,4-Pregnadien-11ss,17α,21-triol-3,20-dion umgewandelt. Die Verbindung wird durch Chromatographie über Florisil und Elution mit 1 und 2% Methanol enthaltendemMethylenchlorid isoliert.
Nach Umkristallisation aus Aceton schmilzt die Verbindung bei 238 - 240UC.
Beispiel 5 : Analog Beispiel lb) werden 1,4-Prcgnadien-11α-oder-11ss, 17α, 21-triol-3,20-dion (die Produkte von Beispiel 3 bzw. 4) je in 1,4-Pregnadien-17α,21-diol-3,11,20-trion umgewandelt.
Vorteilhaft geht man von den 21-Estern, z. B. den 21-Acetaten, aus. Dabei erhält man zunächst 1,4-Pregnadien-17α,21-diol-3,10,20-trion-21-acetat, dessen 21-Acetatgruppe z. B. durch Erwärmen
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4-Pregnadien-17a, 2l-diol-- 3, 11, 20-trion hydrolysiert werden kann.
Beispiel 6 : a) Eine Kultur von Curvularia lunata (Identifizierung nach "United States Quartermaster Corps", Philadelphia) lässt man in Kolben wachsen, die das gleiche Medium enthalten, wie es in Beispiel 1 der USA-Patentschrift Nr. 2, 658, 023 beschrieben ist. 100 ml dieses Impfmittels werden unter sterilen Bedingungen in 2 1 eines wässerigen Mediums gegeben, das die folgenden Bestandteile enthält :
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Rohrzucker 1 g "Difco" -Trypton 1 g Natriumnitrat 0, 2 g
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Magnesiumsulfat-Heptahydrat 0, 05 g
Kaliumchlorid 0, 05 g
Ferrosulfat-Heptahydrat 0, 001 g
Diese Mischung wird mit Schwefelsäure auf ein PH von 7 gebracht und, ehe die Mischung sterilisiert wird, wird 0, 25% Calciumcarbonat zugesetzt. Das geimpfte Medium wird 24 h bei 27 - 280C belüftet, u. zw. pro Minute mit etwa 1/2 - 1 Volumen Luft pro Volumen Lösung. Während dieser Zeit wird die Mischung mit einem Rührer, der mit etwa 1700 Umdr/min rotiert, gerührt. 1/2 g von l, 4-pregnadien- - 17a-ol-3, 20-dion wird in 20 ml 950/obigem Äthanol gelöst.
Die Lösung wird der Fermentationsmischung unter sterilen Bedingungen zugefügt. Die Reaktion wird dann weitere 24 h unter den gleichen Bedingun-
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worin R = H oder Acyl, W = H und X = O: αH. ssOH oder W = F und X = ocH, ssOH bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dass man entsprechende Steroide, die in 11-oder 11-und 21-Stellung nicht substituiert sind, auf mikrobiologische Weise hydroxyliert, indem man durch Behandlung mit Mikroorganismen der Gattung Rhizopus oder Aspergillus, vorzugsweise der Arten Rhizopus nigricans, Rhizopus arrhizus oder Aspergillus niger.
die llcc-Hydroxylgruppe oder durch Behandlung mit Mikroorganismen der Gattung Curvularia oder Cunninghamella, vorzugsweise der Arten Curvularia lunata oder Cunninghamella blakesleeana, die llss-Hydroxylgruppe einführt bzw. zur Einführung der 21-Hydroxylgruppe mit Mikroorganismen der
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