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Verfahren zur Herstellung von 6-Methyl-17 a, 21-dioxy-1,4-pregnadien-3,20-dionen
und deren 21-Acylaten Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur
Herstellung von 6-Methyl-17a,21-dioxy-1,4-pregnadien-3,20-dionen und deren 21-Acylaten
nach folgendem Reaktionsschema:
in denen R eine ß-ständige Oxygruppe oder Ketosauerstoff und R' Wasserstoff oder
einen Acylrest einer organischen Carbonsäure mit vorzugsweise 1 bis 12 Kohlenstoffatomen
bedeutet.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man
ein in 11-Stellung eine Sauerstoffurnktion tragendes 6-Methyl-17a,21-dioxy-4-pregnen-3,20-dion
(das 6a- oder 6ß-Epimere) oder einen Ester dieser Verbindung (Formel I) in bekannter
Weise der Fermentierung mit einem die 1(2)-Stellung eines 3-Keto-4-pregnens dehydrierenden
Mikroorganismus unterwirft. Besonders geeignet hierfür sind Mikroorganismenstämme
der Gattungen Calonectria, Altemaria, Collectotrichum, Cylindrocarpon, Ophiobolus,
Septomyxa, Didymella, Corynebacterium, Fusarium, Listeria, Erysipelothrix, insbesondere
Septomyxa affinis ATCC 6737 und Corynebacterium simplex.
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Die Veresterung der so erhaltenen Produkte kann ebenfalls nach üblichen
Methoden erfolgen, z. B. durch Umsetzung mit einem acylicrenden Mittel, wie einem
Keten, Isopropenylacylat, einem Anhydrid oder Halogenid einer organischen Carbonsäure
mit vorzugsweise 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, bei Temperaturen zwischen 0 und 100°C,
wobei Zimmertemperatur bevorzugt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht
die Herstellung von 6-Methyl-l-dehydro-analogen des Cortisons, Hydrocortisons und
von deren 21-Estem, d. h. des 1-Dehydro-6a-methylhydrocortisons und 1-Dehydro-6a-methylcortisons.
Letztere stellen insbesondere in der 6a-epimeren Form hochaktive Nebennierenrindenhormone
dar, deren glucocorticoide Wirkung größer ist als die des Hydrocortisons, Cortisons
und deren 1-Dehydroanalogen, wie aus folgender Tabelle hervorgeht:
| Tabelle I |
| Glucocorticoide Wirkung der erfindungsgemäß herstell- |
| baren Steroidverbindungen (im Vergleich zu Hydro- |
| cortison = 1) |
| Glucocorticoide |
| Steroid Wirkung |
| oral 1subcutan |
| Hydrocortison .................. 1 1 |
| 1-Dehydrohydrocortison ......... 2,9 |
| 1-Dehydro-6a-methylhydro- |
| cortison ...................... 18 10,6 |
| Cortison ....................... 0,60 |
| 1-Dehydrocortison .............. 3 |
| 1-Dehydro-6a-methylcortison ..... 5,6 |
Die neuen Verbindungen, 1-Dehydro-6a-methylcortison und 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison,
besitzen außerdem den Vorteil einer geringen Salzretention und hoher antiphlogistischer
Wirksamkeit, was sie speziell für die systemische und lokale äußerliche Anwendung
geeignet macht. Die antiphlogistische (entzündungshemmende) Wirkung von 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison
ist im Granulomtest sechs- bis siebenmal stärker als die des Hydrocortisons. Die
1-Dehydro-6a-methyl-epi-F-Verbindung, 6a-Methyl-11a,17a,21-trioxy-1,4-pregnadien-3,20-dion,
besitzt ebenfalls entzündungswidrige Wirkung. Sie kann z. B. durch Oxydation des
Acylats mit Chromsäure leicht in 6a-Methyl-d l-cortison-ester umgewandelt werden.
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Die erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen lassen sich für die
human- oder veterinärmedizinische Anwendung zu Präparaten mit verschiedenartigster
Applizierbarkeit verarbeiten. So kann man aus ihnen mit festen, flüssigen oder salbenartigen
Trägerstoffen Mittel zur oralen, parenteralen oder äußerlichen Applikation herstellen.
In Kombination mit Aerosolen kann man auch Sprays für Inhalationszwecke herstellen.
Gegebenenfalls lassen sie sich mit andern Wirkstoffen wie Antibiotika, Sulfonamiden,
Acetylsalicylsäure und/oder Vitaminen kombinieren.
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Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet
man ein in 11-Stellung eine Hydroxyl-oder Ketogruppe enthaltendes 6(a oder ß)-Methyl-17a,
21-dioxy-4-pregnen-3,20-dion oder dessen 21-Ester.
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Die fermentative Dehydrierung gemäß Erfindung kann unter den in der
USA.-Patentschrift 2 602 769 beschriebenen Bedingungen erfolgen, unter Verwendung
eines geeigneten Nährmediums, das assimilierbaren Kohlenstoff, Stickstoff, Schwefel
und Phosphor in entsprechender Form sowie andere Verbindungen (Vitamine, z. B. Thiamin,
Thiaminthiazol, Pflanzenhormone, z. B. Auxine) und Mineralstoffe (z. B. Zink, Eisen,
Kobalt, Kupfer, Kalium, Mangan usw.) enthält, die für das Wachstum der Mikroorganismen
erforderlich sind. Die Luftzufuhr zur Fermentationsmischung kann durch gesteuerte
Belüftung, Einschluß von Luft in Schüttelflaschen oder andere Maßnahmen erfolgen.
Das zu dehydrierende Material wird vorzugsweise in Lösung oder Suspension zugesetzt,
nachdem dem Mikroorganismus Zeit gelassen wurde, sich zu entwickeln. Es wurde gefunden,
daß der Zusatz bestimmter Steroidverbindungen, -wie 3-Keto-bisnor-4-cholen-22-al,
3-Keto-bisnor-4-cholensäure, rohes llß,21-Dioxy-1,4,17(20)-pregnatrien-3-on und
Progesteron die Ausbeute an dehydriertem Produkt beträchtlich verbessert. Andere
Verbindungen steroidaler oder nichtsteroidaler Natur können die Ausbeute ebenfalls
günstig beeinflussen.
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Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.
Beispiel 1 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison (6a-Methyll lß,17a,21-trioxy-1,4-pregnadien-3,20-dion)
Sechsmal je 100 ccm Nährmedium aus
10/, Glukose, 20/, Maisquellwasser (600/,
Feststoffe) und Leitungswasser wurden in Erlenmeyerkolben gefüllt, auf p$ 4,9 eingestellt,
45 Minuten bei einem Druck von etwa 1 kg/Cm2 sterilisiert und dann mit einer 1 bis
2 Tage alten Kultur von Septomyxa affinis ATCC 6737 geimpft. Die Kolben wurden bei
einer Temperatur von etwa 24°C 3 Tage geschüttelt. Darauf wurden diese 600 ccm zur
Beimpfung von 101 der obigen Nährlösung, die noch 10 ccm eines Antischaummittels
(Specköl -E- Octadecanol) enthielten, verwendet. Das Gärgefäß wurde in ein auf 28°C
gehaltenes Wasserbad gestellt und sein Inhalt gerührt (300 U/min) und belüftet (0,51
Luft je 10l Flüssigkeit). Nach 17stündiger Inkubation, nachdem sich ein gutes Wachstum
entwickelt hatte und der pH-Wert auf 6,7 gestiegen war, wurden 2 g 6a-Methylhydrocortison
und 1 g 3-Ketobisnor-4-cholen-22-al, in 115 ccm Dimethylformamid gelöst, zugesetzt
und die Inkubation bei gleicher Temperatur und Belüftung 24 Stunden fortgesetzt
(End-pH 7,9). Man filtrierte vom Mycel (56 g Trockengewicht) und extrahierte das
Steroidmaterial mit Methylenchlorid. Die Extrakte wurden zur Trockne eingedampft
und der Rückstand über eine Säule aus synthetischem Magnesiumsilikat (bekannt unter
dem Handelsnamen »Florisil«) chromatographiert. Die Säule war mit 200 g »Florisih
beschickt und wurde je fünfmal mit 400 ccm Fraktionen der folgenden Lösungsmittel
eluiert; Methylenchlorid, Hexankohlenwasserstoffe (bekannt unter dem Handelsnamen
»Skellysolve B«), Acetonmischungen 9:1, 8:2, 7:3, 1:1 und Methanol. Die mit »Skellysolve
B«-Aceton (7:3) eluierte Fraktion wog 1,545 g und ergab beim Umkristallisieren aus
Aceton, in drei Fraktionen, 928 mg eines bei 210 bis 235°C schmelzenden Produktes.
Eine daraus hergestellte Analysenprobe schmolz bei 245 bis 247°C; [a]D + 83° in
Dioxan.
Infrarotabsorption in Nujol-Mineralölsuspension: O H . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 3430 3330 3180 cm-' 20-Keto .................. 1706 Konjugierte
3-Keto . . . . . . . . 1645 ,d"4-Doppelbindung ....... 1592 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison-acetat
Man stellte eine Mischung aus 500 mg 1-Deliydro-6a-methylhydrocortison in 500 ccm
Pyridin und 5 ccm Essigsäureanhydrid her, hielt 6 Stunden auf Zimmertemperatur (22
bis 24°C), goß hernach in 100 ccm Eiswasser und extrahierte die wäßrige Mischung
dreimal mit je 25 ccm Methylenchlorid. Die vereinigten Methylenchloridextrakte wurden
gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Nach dreimaligem
Umkristallisieren des Rückstands aus Aceton-»Skellysolve B« erhielt man das reine
1-Dehydro-6a-methylhydrocortison-21-acetat (6-Methyl-11ß,17a-dioxy 21-acetoxy-1,4-pregnadien-3,20-dion).
Schmelzpunkt 204 bis 208° C. Infrarotabsorption in Nuljol-Mineralölsuspension: O
H . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3400 3280 cm-1 11-Keto und
20-Keto . . . . . . . . . . 1722 1700 Konjugierte 3-Keto . . . . . . . . . . . .
1655 d"4-Doppelbindung ........... 1611 1597 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison-21-hemisuccinat
Zu einer Lösung von 2,5 g Berüsteinsäureanhydrid in 25 ccm Pyridin wurden unter
Rühren 2,0 g 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison gegeben und gerührt, bis alles 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison
in Lösung gegangen war. Man ließ über Nacht stehen und goß dann langsam in eine
kräftig gerührte Mischung aus 30 ccm konzentrierter Salzsäure, 102 ccm Wasser und
127 g Eis. Man rührte 1 Stunde weiter und sammelte das ausgeschiedene rohe 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison-21-hemisuccinat
auf einem Filter, wusch, bis das p$ der Waschlauge 4,0 betrug, trocknete und kristallisierte
aus 45 ccm Methyläthylketon
und 36 ccm »Skellysolve B<c um,
worauf man das reine 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison-21-hemisuccinat erhielt. Schmelzpunkt
254 bis 258°C.
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Natriumsalz des 1-Dehydro-6a-methylhydrocortisonhemisuccinats Zu einer
Lösung von 2 g 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison-21-hemisuccinat in 50 ccm Aceton
wurde unter Rühren langsam 0,1 n-Natronlauge gegeben, bis das pg auf 7,4 gestiegen
war. Gleichzeitig mit der Natronlauge wurden 100 ccm Wasser zugegeben.
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Die Lösung wurde im Vakuum bei 25°C vom Aceton befreit. Die verbleibende
wäßrige Lösung des Salzes wurde filtriert, der Gefriertrocknung unterworfen und
der Rückstand umkristallisiert, worauf man das reine Natriümsalz des 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison-21-hemisuccinats
erhielt. 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison-21-(ß,ß-dimethylglutarat) Zu einer Lösung
von 260 mg ß,ß-Dimethylglutarsäureanhydrid in 2 ccm Pyridin wurden 200 mg 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison
gegeben. Die Mischung wurde gerührt, bis alles in Lösung gegangen war, und der Kolben
mit Stickstoff ausgespült. Man ließ über Nacht (18 Stunden) stehen und goß dann
unter Rühren langsam in eine kalte Lösung von 2,4 ccm konzentrierter Salzsäure in
18 ccm Wasser. Die Mischung wurde dreimal mit je 5 ccm Äthylacetat extrahiert, die
vereinigten Extrakte mit verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen, über wasserfreiem
Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck auf 1,5 ccm eingedampft.
Dazu gab man 1 ccm »SkeHysolve B«c und kühlte auf O' C ab. Nach 24 Stunden
wurde filtriert, um das kristalline 1-Dehydro-6-methylhydrocortison-21-(ß,ß-dimethylglutarat)
zu gewinnen. Schmelzpunkt 212 bis 215°C.
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Ein Metallsalz dieser Verbindung kann man, wie nachstehend beschrieben,
herstellen. Natriumsalz des 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison-21-(ß,ß-dimethylglutarats)
Zu einer Lösung von 2 g 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison-21-(ß,ß-dimethylglutarat)
in 100 ccm Aceton gibt man langsam unter Rühren 0,1 n-Natronlauge, bis das p$ auf
7,4 gestiegen ist. Während des Zusatzes der Natronlauge werden gleichzeitig 100
ccm Wasser zugesetzt.
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Die Lösung wird im Vakuum bei 25°C vom Aceton befreit. Dann filtriert
man die Lösung und unterwirft sie der Gefriertrocknung, um das Natriumsalz des 1-Dehydro-6a-methylhydrocortison-21-(ß,ß-dimethylglutarats)
zu isolieren. Beispiel 2 1-Dehydro-6a-methylcortison In gleicher Weise, wie im Beispiel
l beschrieben, wurde 6a-Methylcortison mit Septomyxa affinis im gleichen Nährmedium
unter Verwendung von rohem llß,21-Dioxy-1,4,17(20)-pregnatrien-3-on als Promotor
fermentiert, wobei 1-Dehydro-6a-methylcortison vom Schmelzpunkt 230 bis 232°C erhalten,
wurde.
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An Stelle von 3-Keto-bisnor-4-cholen-22-al kann man als Promotor auch
llß,21-Dioxy-1,4,17(20)-pregnatrien-3-on oder 3-Keto-bisnor-4-cholensäure verwenden.