AT204194B

AT204194B - Verfahren zur Herstellung von Dehydroverbindungen der Steroidreihe

Info

Publication number: AT204194B
Application number: AT51856A
Authority: AT
Original assignee: Ciba Geigy
Priority date: 1955-02-07
Filing date: 1956-01-26
Publication date: 1959-07-10

Description

Verfahren zur Herstellung von Dehydroverbindungen der Steroidreihe
Die vorliegende Erfindung betrifft ein besonderes Verfahren zur Herstellung von Dehydroverbindungen der Steroidreihe, die in 1, 2- und 4, 5-Stelll1ng eine Doppelbindung aufweisen.

Das in der Patentschrift Nr. 201246 beschriebene Verfahren zur Herstellung von Oxydationsprodukten der Steroidreihe betrifft den biochemischen Abbau der Seitenkette von Pregnanverbindungen zu Androstanverbindungen und gegebenenfalls Aufspaltung des Ringes D, wobei gleichzeitig in 1, 2-und ge-
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5-StellungProgesteron. wie auch As-38-Oxy-20-oxo-pregnen, 11-Desoxycorticosteron oder 3, 20-Dioxo-allopregnan in einer Verfahrensstufe in Al, 4-3, 17-Dioxo-androstadien bzw. 1, 2-Dehydro-testolacton. überführen.

Es wurde nun gefunden, dass in Steroidverbindungen, insbesondere der Pregnanreihe, die 1, 2-und bzw. oder die 4, 5-Doppelbindung ohne Seitenkettenabbau oder Ringaufspaltung auf biochemischem Wege eingeführt werden kann, wenn man in 1, 2-und bzw. oder in 4, 5-Stellung gesättigte Steroidverbindungen der aeroben Einwirkung von Enzymen von Didymella lycopersici, Calonectria decora, Alternaria passiflorae, Ophiobolus heterostrophus, oder Ophiobolus Miyabeanus unterwirft.

Die als Ausgangsstoffe verwendeten Steroidverbindungen sind z. B. Abkömmlinge des Spirostans, Allospirostans, Furostans, Allofurostans, Cholans, Allocholans, Pregnans, Allopregnans, Androstans und Testans und weisen vorzugsweise in 3-Stellung eine freie oder funktionell abgewandelte Oxy- oder Oxogruppe auf. Sie können gesättigt sein oder Doppelbindungen enthalten, z. B. in l-oder 4-Stellung, ferner in 5-, 6-, 7-, 8-, 9 : 11-, 14-oder 16-Stellung, oder zusätzliche Substituenten besitzen, wie freie oder abgewandelte Oxy-, Oxo-oder Carboxylgruppen, ferner Epoxygruppen oder Halogenatome, beispielsweise
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oder 17ss-Stellung. Die oben genannten Ausgangsstoffe sind von beliebiger sterischer Konfiguration und können auch als Racemate vorliegen.

Sie umfassen auch solche der sogenannten Nor- und/oder HomoReihen, insbesondere 19-Nor-und D-Homo-Verbindungen. Besonders wichtige Ausgangsstoffe sind Verbindungen der Pregnanreihe, die in 3- und 20-Stellung freie oder funktionell abgewandelte Oxy- oder
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B.pregnan-3, 20-dion, Pregnan- und Allopregnan-3,11,20-trion-17&alpha;,21-diol, Pregnan- und Allopregnan- 3, 20-dion-llss 17ct, 21-triol, Pregnan- und Allopregnan-3, 18, 20-trion-llss, 21-diol, Pregnan- und Allo- pregnan-3,20-dion-11ss,18,21-triol, Pregnan- und Allopregnan-3,0-dion-18,21-diol, die entsprecheuden 21-Oxo-verbindungen und bzw. oder 9a-Fluor- und Chlor-derivate, beispielsweise 9a-Fluor- cortison, 9&alpha;

-Fluor-hydrocortison, 9&alpha;-Fluor-aldosteron und 9c < -Fluor-18-oxy-corticosteron, ferner in.

1, 2- und bzw. oder in 4, 5-Stellung gesättigte Androstanverbindungen, z. B. A -oderAS-Androsten-

3, 17-dion, Testosteron, AS-Androsten-3-ol-17-on, Adrenosteron, Androstan-3, 17-dion, Ätiansäuren, z. B. #4- oder #5-Ätiensäuren, Alloätiansäuren, die insbesondere in3-, 11-und bzw. oder 18-Stellung Oxy- oder Oxogruppen aufweisen bzw. funktionelle Derivate der genannten Verbindungen, d. h. entsprechendeVerbindungen mit funktionell abgewandelten Oxy- oder Oxogruppen. In den Ausgangsstoffen stellt die funktionell abgewandelte Oxygruppe z.

B. eine mit einer aliphatischcn, aromatischen oder hetero cyclischen Carbonsäure, beispielsweise Essigsäure, Propionsäure, Benzoesäure oder Furancarbonsäure ver- esterte oder eineverätherte Oxygruppe dar, z. B. die Tetrahydropyranyloxy-, Benzyloxy- oder Triphenyl- methoxygruppe. Die funktionell abgewandelte Oxogruppe ist vorteilhaft eine ketalisierte Oxogruppe, abgeleitet insbesondere von einem zweiwertigen Alkohol, wie die Äthylendioxygruppe.

Die genannten Ausgangsstoffe werden verfahrensgemäss mit Enzymen von Didymella lycopersici, Calonectria decora, Alternaria passiflorae, Ophiobolus heterostrophus oder Ophiobolus Miyabeanus in Reaktion gebracht. Für ihre Gewinnung eignen sich Kulturen dieser Pilze in an sich hiefür bekannten Medien, z. B. solche mit Zuckern, wie Glucose oder Lactose, mit Peptonen, Maisquellwasser, Sojaprodukten u. dgl., sowie mit Mineralsalzen, oder aber synthetische Nährlösungen. Man arbeitet insbesondere unter aeroben Bedingungen, beispielsweise in Schüttelkultur oder bei submersem Wachstum unter Rühren und Luftzufuhr. Die genannten Pilze unterscheiden sich von andern Mikroorganismen, z. B. den Bakterien, durch gutes Wachstum unter verhältnismässig einfachen Zuchtbedingungen.

Die verfahrensgemässe Reaktion findet in der beschriebenen Pilzkultur bzw. mit Hilfe der darin enthaltenen, gegebenenfalls angereicherten oder abgetrennten Enzyme statt, im einfachsten Fall also in einer Aufschwemmung des abgetrennten Pilzmycels, des homogenisierten Pilzmycels oder in Filtraten bzw. wasserhaltigen Extrakten davon.

Die Isolierung der Verfahrensprodukte lässt sich nach bekannten Methoden vornehmen. Ihre Abtrennung kann z. B. durch Extraktion des Reaktionsgemisches mit einem organischen Lösungsmittel, z. B.

Methylenchlorid oder Essigester, erfolgen. Für die weitere Reinigung des so erhaltenen Extraktes eignen sich besonders Chromatographie, z. B. an Aluminiumoxyd oder Silicagel, Anwendung von Verteilungsmethoden, z. B. dem Gegenstromverfahren, oder die Trennung mittels Girard-Reagentien, wie Trimethylammonium- oder Pyridinium-essigsaurehydrazid. Anschliessend an die Reinigung oder an ihrer Stelle wird schliesslich vorzugsweise aus organischen oder wasserig-organischen Ihungsmitteln umkristal- lisiert.

Durch Einführung der l, 2-und bzw. oder 4, 5-Doppelbindung gelangt man an wertvollen Heilmitteln der Steroid-, insbesondere der Pregnanreihe, die sich verglichen mit den i)) l, 2-Stelllng gesättigten,
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die entsprechenden 21-Oxo-sowie 21-Desoxy-verbindungen, ferner entsprechende funktionelle Derivate, wie Ester, Äther, Halogen-Derivate, z. B. 9a-Halogen-, insbesondere die Fluor- oder Chlorverbindungen. Sofern die Verfahrensprodukte nicht die Konfiguration und die Substituenten von therapeutisch verwendbaren Steroiden aufweisen, können sie als Zwischenprodukte zu deren Herstellung, z. B. der obengenannten Verbindungen dienen.

Die verfahrensgemäss erhältlichen Umsetzungsprodukte lassen sich in an sich bekannter Weise in ihre funktionellen Derivate, wie Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffderiva te, beispielsweise Ester, Äther, Enolester, Enoläther, Ketale, Thioäther und Thioketale, ferner Hydrazone, Oxime und Enamine überführen.

In diesen Verbindungen können die Oxy- und/oder Oxogruppen vollständig oder teilweise funktionell abgewandelt sein.
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fluoressigsäure, Propionsäure, Buttersäuren, Valeriansäuren, Diäthylessigsäure, Capronsäuren, Önanthsauren, Caprylsauren, Palmitinsäuren, Crotonsäure, Undecansäure, Undecylensäure, Oxalsäure, Bernsteinsäure, Pimelinsäure, Maleinsäure, Milchsäure, Carbaminsäuren, Alkoxycarbonsäuren, ss-Cyclopentylpropion- säure, Hexahydrobenzoesäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, Cyclohexylebsigsäure.

Phenylpropion-

säuren, Trimethylgallussäure, Phthalsäure, Furan-2-carbonsäure, Isonicotinsäure, Methansulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Schwefelsäuren, Halogenwasserstoffsäuren oder Phosphorsäuren.

Wenn erwünscht, lassen sich in erhaltenen Verbindungen funktionell abgewandelte Oxy- oder Oxogruppen in freie Gruppen überführen. Auf diese Weise können insbesondere in polysubstituierten Derivaten die funktionell abgewandelten Gruppen auch teilweise in Freiheit gesetzt werden. Dies erfolgt z. B. aurch chemische oder enzymatische Hydrolyse, beispielsweise unter Verwendung saurer oder basischer Mittel, durch Umesterung oder Umacetalisierung. Aus den auf diese Weise oder auch direkt erhaltenen, nur partiell abgewandelten, wie veresterten bzw. verätherten Derivaten lassen sich durch anschliessende funktionelle Abwandlung, z. B. Veresterung oder Verätherung, polysubstituierte Derivate, insbesondere auch gemischte Ester oder Äther bzw. Ester-Äther, herstellen.

Die Verfahrensprodukte können als Heilmittel oder als Zwischenprodukte zu deren Herstellung Verwendung finden.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
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teln. Nach 2 Tagen wird das Mycel abgetrennt und gut mit Wasser und Essigester gewaschen. Nach er- schöpfender Extraktion dervereinigtenFiltrate mit insgesamt 4 I Essigester werden die Extrakte mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der so gewonnene rohe Extrakt (1, 1 g) wird an einer Säule von 30 g Silicagel nach der Durchlaufmethode chromatographiert, wobei man mit Chloroform und mit Chloroform-Aceton-Gemischen steigenden Acetongehaltes eluiert. Die einzelnen Fraktionen (je 100 cm ?) untersucht man papierchromatographisch.

Die mit Chloroform eluierten Anteile enthalten nur Verunreinigungen, während sich in den Chloroform- Aceton (9 : 1) -Fraktionen eine neue Substanz befindet, die im Papierchromatogramm (System Propylenglykol-Toluol) etwas weniger weit als Cortexon wandert. Die Fraktionen mit höherem Acetongehalt enthalten nur wenig hochpolares Material. Die die erwähnte neue Substanz enthaltenden Fraktionen vereinigt man und dampft sie im Vakuum ein. Durch Umkristallisieren des Rückstandes aus Aceton-Petroläther-Gemischen erhält man das reine 1-DehydroCortexon vom F. = 185-1920 in beinahe quantitativer Ausbeute. Diese Verbindung reduziert alkalische Silberdiamin-Lösung rasch und stark. Die Analyse stimmt auf die BruttoformelC.H 0, (Ber. C 76, 79 H 8, 59%, Gef.

C 76,67 H 8, 84%). Das UV-Spektrum der freien Verbindung zeigt eine starke Bande mit dem Maximum bei 244 mll (E = 14200), dasjenige des Dinitrophenylhydrazons eine solche bei 388 mu (E = 39000). Die entsprechenden Banden des Cortexons liegen bei 240 mg (E = 16200) resp. 378 mg (E = 39000).
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das 1-Dehydro-Cortexon in hoher Ausbeute.

Beispiel 3 : Man züchtet, wie in Beispiel 1 beschrieben, in einem Schüttelgefäss 4 I einer Kultur von Calonectria decora und gibt unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g Cortison in 25 cm ! Methanol zu. Das Gefäss wird darauf bei 27 geschüttelt. Nach 4 Tagen trennt man das Mycel ab und extrahiert das Kulturfiltrat erschöpfend mit insgesamt 3 l Essigester. Die vereinigten Extrakte werden mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der so erhaltene rohe Rückstand wird wie in Beispiel 1 beschrieben, an 30 g Silicagel nach der Durchlaufmethode chromatographiert. Die mit Chloroform-Aceton (6 : 4)-Gemischen eluierten Anteile bestehen zur Hauptsache aus einer Substanz, die etwas polarer ist als das Ausgangsmaterial.

Diese Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum eingedampft.

Aus Aceton-Äther-Gemischen wird das 1-Dehydro-Cortison kristallisiert. F. = 231-2340. Die Substanz reduziert alkalische Silberdiamin-Lösung rasch und stark und zeigt im UV-Spektrum eine starke Absorption bei 240 mg (e = 15800). Durch Acetylierung mit Pyridin-Acetanhydrid erhält man das entsprechende 21-Acetat vom F. = 224-2300C. In ähnlicher Weise lässt sich z. B. das Önanthat oder Un- decylenat herstellen.

Beispiel 4: Zu 4 l einer gut entwickelten Kultur von Calonectria decora gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g Hydrocortison in 25 cms Methanol. Nach 4-tägigem Schütteln bei 270 wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, extrahiert und chromatographiert. Die mit Chloroform-Aceton (1 : 1)-Gemischen eluierten Anteile enthalten eine Substanz, die etwas polarer als Hydrocortison ist. Die-

se Fraktionen vereinigt man und dampft sie ein. Das 1-Dehydro-Hydrocortison wird aus Methanol oder Aceton-Äther-Gemischen umkristallisiert. F. = 238-241 . Es reduziert alkalische Silberdiamin- Lösung rasch und stark und zeigt im UV-Spektrum eine starke Absorption bei 244 mu (e = 5100).

Beispiel 5 : In einem Erlenmeyerkolben von 500 ems Fassungsvermögen werden 150 cm3 tige Bierwürze sterilisiert und mitCalonectria decora beimpft. Man lässt 2 Tage bei 27 schütteln und gibt zu der nun gut entwickelten Kultur unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg Aldosteron in 1, 5 cm* Aceton zu. Dann schüttelt man bei 270 weiter und filtriert nach 38 Stunden das Mycel ab. Das Kulturfiltrat wird mit Essigester erschöpfend extrahiert, die Extrakte mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingedanpft. Der Rückstand wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, an 1 g Silicagel chromatographiert, wobei die einzelnen Fraktionen (je 20 cms) papierchromatographisch untersucht werden.

In den mit Chloroform-Aceton (l : l)-Gemischen eluierten Anteilen befindet sich eine Substanz, die etwas polarer ist als Aldosteron und alkalische Silberdiamin-Lösung reduziert. Sie wird aus Aceton-Äther-Gemischen kristallisiert und stellt das 1-Dehydro-Aldosteron dar. Im UV-Spektrum zeigt sie starke Absorption bei 244 mull.

Beispiel 6 : In 14 Erlsnmeyerkclben von 200 cm* Fassungsvermögen werden je 50 cl* 70%oigne
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3, 17-don. Man lässt 2 Tage lang bei 270 weiter schütteln und extrahiert dann die Kulturen mit Essigester. Die papierchromatographische Untersuchung der einzelnen Extrakte zeigt, dass alle Ausgangssubstanzen in die entsprechenden l-Deyhdro-Verbindungen übergeführt worden sind, die gegenüber den Ausgangsstoffen ganz leicht erhöhte Polarität besitzen und sich in ihren Spektren charakteristisch von diesen unterscheiden.

Beispiel 7 : Verwendet man zur Dehydrierung der in Beispiel 6 genannten Substanzen statt der dort beschriebenen Kulturen von Calonectria decora Kulturen von Alternaria passiflorae Ophiobolus heterostrophus oder Ophiobolus Miyabeanus, so zeigt die papierchromatographische Untersuchung der Extrakte die gleichen Umsetzungsprodukte wie sie in Beispiel 6 beschrieben sind.

Beispiel 8 : Zu 41 einer gut entwickelten Kultur von Calonectria decora gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g 3,11, 20-Triketo-17a, 21-dioxy-allopregnan in 25 cm3 Methanol. Man lässt 3 Tage bei 270 schütteln und trennt dann das Mycel ab. Die Extraktion des Kulturfiltrates und die Chromatographie des Rohextraktes wird. in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt.

Die mit Chloroform-Aceton (1-1)-Gemischen eluierten Anteile enthalten das 1-Dehydro-cortison, das aus Aceton-Äther-Gemischen kristallisiert erhalten wird, F. = 230-233 . Es besitzt die in Beispiel 3 beschriebenen Eigenschaften.

Wird an Stelle der Lösung von 3, 11, 20-Triketo-17&alpha;,21-dioxy-alloprognan eine Lösung von 3, 11,20Triketo-17a, 21-dioxy-pregnan in 25 cru ? Methanol einer analogen Kultur von Calonectria decora zugesetzt und in der beschriebenen Weise aufgearbeitet, so erhält man ebenfalls das 1-Dehydro-cortison in guter Ausbeute.

Beispiel 9 : Unter sterilen Bedingungen wird eine Lösung von 1 g 3, 29-Diketo-llss, 17a, 21- trioxy-allopregnan in 25 cm3 Methanol zu 4 l einer Kultur von Calonectria decora gegeben und die Mischung 4 Tage bei 27 geschüttelt. Dann trennt man vom Mycel ab und führt die Extraktion des Kulturfiltrates und die chromatographische Auftrennung des Extraktes wie in Beispiel 1 beschrieben durch. Aus den mit Chloroform-Aceton-(1:1)-Gemischen eluierten Anteilen wird das 1-Dehydrocortison in guter Ausbeute kristallisiert erhalten, F. = 239-242 . Es besitzt die in Beispiel 4 beschriebenen Eigenschaften.

Beispiel 10: Eine Lösung von 1 g Androstan-3,17-dion in 25 cm* Aceton wird unter sterilen Bedingungen zu 4 l einer Kultur von Calonectria decora gegeben. Nach 36-stündigem Schütteln bei 27 trennt man das Mycel ab und schüttelt das Kulturfiltrat erschöpfend mit Methylenchlorid aus. Der Extrakt
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waschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Den Rückstand (1, 2 g) chromatographiert man an 30 g Aluminiumoxyd nach der Durchlaufmethode, wobei man mitPetroläther-Benzol-Gemischen, mit Benzol, mit Benzol-Äther-Gemischen und mit Äther eluiert. Die mit Petroläther-Benzol und mit Benzol abgelösten Anteile enthalten das bekannte #1,4-Androstadien, 3,17-dion, das aus einem Aceton-Petrol- rather-gemisch in rhombischen Platten kristallisiert.

F. = 140-146 ; < x]D = + 1100 (CHC ).
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Pyridin werden mit 2 cnss Essigsäureanhydrid versetzt und bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Nach 16 Stunden dampft man die Lösung im Vakuum bei 300 ein und nimmt den Rückstand in einem Chloro- form-Äther- (1 : 4) -Gemisch auf. Man wäscht die Lösung je dreimal mit 0, In-Salzsäure, mit 2 %iger Natriumbicarbonatlösung und mit Wasser, trocknet sie und dampft sie im Vakuum ein. Durch Umkristallisieren des erhaltenen Rückstandes aus einem Aceton-Petroläther-Gemisch erhält man das reine 1-De-
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turfiltrates und die Chromatographie des Rohextraktes an Silicagel wird wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.

Die Chloroform- und die Chloroform-Aceton (95 : 5)-Fraktionen enthalten Verunreinigungen und etwas Ausgangsmaterial, während die Chloroform-Aceton (90 : 10)-Fraktionen zur Hauptsache aus einer Substanz bestehen, die im Papierchromatogramm etwas langsamer läuft als das Ausgangsmaterial.

Diese Substanz stellt das #1,4-3,11,20-Triketo-21-oxy-pregnadien dar, das aus Aceton-Äther kristallisiert wird. Die Kristalle zersetzen sich zwischen 200 und 2200, je nach Heizgeschwindigkeit etwas verschieden. Die Substanz absorbiert im UV bei 240 mg und zeigt im IR die für die A-3-Keto-Gruppie- rung charakteristischen Banden bei 5, 99 , 6, 14p und 6, 22je. Durch Acetylierung mit Pyridin-Acetanhydrid erhält man das entsprechende 21-Acetat vom F. = 188-1910. In ähnlicher Weise lässt sich z. B. das Önanthat oder Undecylenat herstellen.

Beispiel 13 : Zu 4 l einer Kultur von Calonectria decora, die wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet wird, gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g Corticosteron in 25 cm3 Aceton.

Man lässt 4 Tage bei 27 schütteln und filtriert dann das Mycel ab. Die Extraktion des Kulturfiltrates und die Chromatographie des Rohextraktes an Silicagel wird wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die mit Chloroform und mit Chloroform-Aceton (95:5) eluierten Auteile enthalten Verunreinigungen und Ausgangsmaterial. Mit Chloroform-Aceton (90:10) und (80:20) wird zur Hauptsache eine Substanz eluiert, die im Papierchromatogramm etwas langsamer wandert als das Ausgangsmaterial. Es handelt sich um das 1-Dehydro-corticosteron, das aus Aceton umkristallisiert wird. F. = 216-2200 (Zers. ), [cdD=+1580
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=Beispiel 14 : Zu 4 l einer Kultur von Calonectria decora, die wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet wird, gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g 17 a- OXy-cortexon (Reichstein's Substanz S) in 25 cm3 Methanol. Man lässt 3 Tage bei 270 schütteln und filtriert dann das Mycel ab.

Die Extraktion des Kulturfiltrates und die Chromatographie des Rohextraktes an Silicagel wird wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Chloroform- und die Chloroform-Aceton (9/, 5 : 2, 5)-Fraktionen enthalten Verunreinigungen, während mit Chloroform-Aceton (95 : 5) etwas Ausgangsmaterial eluiert wird.

Die Chloroform-Aceton (90 : 10)-Fraktionen bestehen aus einem Gemisch, das neben wenig Ausgangsmaterial und höher polaren Produkten zur Hauptsache 1-Dehydro-17&alpha;-oxy-cortexon enthält. Dieses wird durch Kristallisation aus Aceton rein erhalten ; F. = 227-2330 (Zers.); [&alpha;]D = +76 (Äthanol); UV-Ab- sorptionsspektrum : #max 244 m (# = 16200). Im IR finden sich Banden u. a. bei 2, 76p,' 2, 85 p, 5,84 , 6,00 ,6,15 ,6,23 ,9,01 ,9,20 ,9,55 und10,04 .

Das mittels Pyridin-Acetanhydrid hergestellte 21-Acetat schmilzt bei 216-2220, [c < ] p = + 86 (Dioxan); UV-Absorptionsspektrum 3max 244 m (# = 15400).

Beispiel'15., Zu 4 l einer Kultur von Calonectria decora, die wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet wird, gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g Progesteron in 25 cms Aceton.

Man lässt 24 Stunden bei 27 schütteln und filtriert dann das Mycel ab. Die Extraktion des Kulturfiltrates wird wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Der Rohextrakt wird an einer Säule von 30 g alkalifreiem Aluminiumoxyd chromatographiert, wobei die einzelnen Fraktionen (je 100 cm3) papierchromatographisch untersucht werden. Die Petroläther-Benzol-Fraktionen enthalten Ausgangsmaterial, während mit Benzol zur Hauptsache 1-Dehydro-progesteron eluiert wird. Dieses wird aus Äther-Petroläther kri- stallisiert, F. =151-1520; [&alpha;]D23 = + 12 (Äthanol); UV.-Absorptionsspektrum #max 245 mp (# = 16150).
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Cortison in 8 cms Methanol.

Man schüttelt weiter bei 270, filtriert nach 3 Tagen das Mycel ab und ex- trahiert das Kulturfiltrat wie in Beispiel 1 beschrieben mit Essigester. Die papierchromatographische
Untersuchung des Rohextraktes zeigt, dass neben wenig höherpolaren Anteilen nur 1-Dehydro-cortison, aber kein Ausgangsmaterial mehr vorhanden ist. Mittels Kristallisation aus Aceton-Äther und aus Me- thanol wird das 1-Dehydro-cortison rein erhalten.

Beispiel 17 : 2 g Natriumnitrat, 1 g prim. Kalium-ortho-phosphat, 0, 5 g Magnesiumsulfat- heptahydrat, 0, 5 g Kaliumchlorid, 50 g Glucose und 1 g Difco-Hefeextrakt werden in 1 1 Leitungswasser gelöst, durch Zusatz von Natronlauge auf Ph 5 gebracht und sterilisiert. Die erhaltene Nährlösung be- impft man mit 50 cms einer 4 Tage alten Schüttelkultur von Didymella lycopersici und schüttelt sie
48 Stunden bei 270, wobei sich die Kultur gut entwickelt. Dann wird unter sterilen Bedingungen eine
Lösung von 250 mgCortexon in 10 cm'Aceton zugegeben. Man schüttelt weitere 2 Tage bei 270, nutscht dann das Mycel ab, wäscht es mit Wasser und Essigester und extrahiert die vereinigten Filtrate mit Essig- ester.

Die Essigester-Lösungen wäscht man mit Wasser, trocknet sie und dampft sie im Vakuum ein, wo- bei sich der erhaltene kristalline Rückstand bei der papierchromatographischen Untersuchung im System
Bush Bs [ Ligroin:benzol:Methanol:Wasser (6, 67:3, 33:8, 0:2, 0)]als fast reines 1-Dehydrocortexonerweist.

Zur Reinigung lässt man es in Chloroformlösung durch eine Schicht Silicagel laufen. Das Chloroform-
Filtrat enthält wenig Öl. Die weiteren, mit Chloroform unter Zusatz von 1 bis 30/0 tertiar-Butanol erhal- tenen Filtrate vereinigt man und dampft sie ein. Der Rückstand liefert, aus einem Aceton-Isopropyl- äther-Gemisch umkristallisiert 220 mg 1-Dehydrocortexon vom F. = 189-1950 (Zers.).

Beispiel 18 : Zu 1 l einer gut entwickelten, wie im Beispiel 17 dargestellten Kultur von Didy- mella lycopersici gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 250 mg Cortison in 10 cm* Me- thanol und lässt 72 Stunden bei 270 schütteln, wonach die Kultur-Flüssigkeit wie in Beispiel 17 angege- ben aufgearbeitet wird. Auf Grund der papierchromatograplilichen Untersuchung im System Propylen- glykol-Toluol enthält der Rückstand der Essigester-Extrakte als Steroidantell praktisch ausschliesslich
1-Dehydrocortison. Man filtriert den Rückstand in Chloroform-Lösung durch Silicagel. Die Chloroform-
Filtrate geben wenig Öl.

Mit Chloroform-Aceton (6 : 4) erhält man einen krista lliL en Ruckstand, der aus einem Aceton-Äther-Gemisch umkristallisiert 225 mg reines 1-Dehydrocortison vom F. = 231-2340 lie- fert.

Beispiel 19 : Zu l l einer gut entwickelten, wie in Beispiel 17 hergestellten Kultur von Didy- mella lycopersici gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 250 mg Hydrocortison in 10 cm*
Methanol. Nach 10-tagigem Schütteln bei 27 wird die Kultur wie in Beispiel 17 ausgeben, aufgear- beitet. Der Rückstand der Essigesterlösungen erweist sich im Papierchromatogramm (System Propylen- ; glykol-Toluol) als fast reines 1-Dehydro-hydrocortison. Zur Abtrennung von Begleitsubstanzen nimmt man ihn in Chloroform auf und filtriert die Lösung durch Silicagel. Die Chlufuform-Eluate, die eine kleine Menge eines Öls enthalten, werden verworfen. Die Chloroform-Aeeton (t : l)-Eluate vereinigt man und dampft sie ein.

Der Rückstand wird aus Methanol oder einem Aceton-Äther-Gemisch umkristallisiert,
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dioxy-allopregnan in 2 cm* Methanol. Man lässt 10 Tage bei 27 schütteln und arbeitet die Kultur wie in Beispiel 17 angegeben, auf. Der Rückstand der Essigester-Extrakte enthält auf Grund der papierchromatographischen Untersuchung im System Propylenglykol-Toluol neben unverändertem ausgangsmateriall- Dehydrocortison, das durch Chromatographie an Silicagel und anschliessende Kristallisation aus einem Aceton-Äther-Gemisch In reiner Form gewonnen wird. beispiel 21 :

Auf analoge Weise erhält man aus Progesteron, #1-Allopregnen-3,20-dion, Pregnan- 3,20-dion, Corticosteron, 11-Dehydro-corticosteron, 17&alpha;-Oxy-cortexon, Testosteron, #1- oder #4-An- drosten- 3, 17 ; "dion die entsprechenden ta4 -Diene.
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+ 1350 (Chloroform), UV.-Absorptionsspektrum #max 240 m (# = 14800).

Beispiel 23 : Zu 4 1 einer gut entwickelten, wie in Beispiel 17 erhaltenen Kultur von Didymella lycopersici gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g 17 ct-Äthinyl-testosteron in 25 cm ! Aceton. Man lässt 8 Tage lang, bei 270 schütteln und arbeitet dann die Kultur gemäss den Angaben in Beispiel 17 auf. Die papierchromatographische Untersuchung des Extraktionsrückstandes zeigt, dass er praktisch nur aus 1-Dehydro-17 tx-äthinyl-testosteron besteht. Durch Kristallisation aus einem Aceton- Äther-Gemisch wird die reine Substanz erhalten. F. = 228-2330, [&alpha;]D = -17 (Chloroform).

Beispiel 24 : Zu 2 I einer gut entwickelten, wie in Beispiel 17 erhaltenen Kultur von Didymella lycopersici gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 180 mg 6-Dehydro-cortexon-21-acetat in 10 cm'Aceton und lässt dann 3 Tage lang bei 270 schütteln. Dann wird die Kultur wie in Beispiel 17 beschrieben, aufgearbeitet. Der Extraktionsrückstand (190 mg) besteht gemäss papierchromatographischer Untersuchung praktisch ausschliesslich aus freiem 1, 6-Bis-dehydro-cortexon, das aus Aceton-Äther-Ge-
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t, 4-3-Ketonelycopersici gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g 11-Dehydro-progesteron in 20 cm2 Aceton. Man lässt 8 Tage bei 27 schütteln und arbeitet dann wie in Beispiel 17 beschrieben auf.

Im Extraktionsrückstand kann mittels papierchromatographischer Untersuchung ausschliesslich das 1, 11- Bis-de-
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u,Beispiel 26 : Zu 2 1 einer gut entwickelten, wie in Beispiel 17 erhaltenen Kultur von Didymella lycopersici wird unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 500 mg 17cx-Methyl-tlZStosteron in 15 cms Aceton gegeben. Man lässt 3 Tage bei 270 schütteln und arbeitet dann die Kultur gemäss den Angaben
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wenigheptahydrat, 0, 5 g Kaliumchlorid, 50 g Glucose und 1 g Difco-Hefeextrakt werden in 11 Leitungswasser gelöst, durch Zusatz von Natronlauge auf PH 5 gebracht und sterilisiert.

Die erhaltene Nährlösung beimpft man mit 50 cm2 einer 4 Tage alten Schüttelkultur von Didymella lycopersici und schüttelt sie 48 Stunden bei 270, wobei sich die Kultur gut entwickelt. Zu 120 cm ? dieser Kultur von Didymella lycopersici gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg 9 &alpha;-fluor-hydrocortison in 2 cmsMe- thanol. Man lässt 5 Tage bei 270 schütteln, nutscht dann das Mycel ab, wäscht es mit Wasser und Essigester und extrahiert die vereinigten Filtrate mit Essigester. Die Essigester-Lösungen wäscht man mit Wasser, trocknet sie und dampft sie im Vakuum ein.

Der Extraktionsrückstand enthält auf Grund der papierchromatographischen Untersuchung 1-Dehydro-9&alpha;-fluor-hydrocortison, das mittels eines präpa- rativen Papierchromatogramms (System Propylenglykol-Toluol) von unverändertem Ausgangsmaterial abgetrennt wird. Aus Aceton bildet es Kristalle vom F. = 263-2660 (Zers.), [&alpha;]D23= +108 (Äthanol) UV.-Absorptionsspektrum #max 240 m (# = 15800). Es wird im Hochvakuum getrocknet und mit 4 cm3 Pyridin-Essigsäureanhydrid-(1:1)-Gemisch in üblicher Weise bei Zimmertemperatur acetyliert.
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(Zers. al D = +1080 spektrum ,max 240 n (e= 16250).

Beispiel 28 : 2 g Natriumnitrat, 1 g prim. Kalium-ortho-phosphat, 0, 5 g Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,5 g Kaliumchlorid, 50 g Glucose und 1 g Difco-Hefeextrakt werden in 11 Leitungswasser gelöst, durch Zusatz von Natronlauge auf pH 5 gebracht und sterilisiert. Die erhaltene Nährlösung beimpft man mit 50 cnss einer 4 Tage alten Schüttelkultur von Didymella lycopersici und schüttelt sie 48 Stunden bei 270, wobei sich die Kultur gut entwickelt. Zu 120 cm3 dieser Kultur von Didymella lycopersici gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg 9, 11-Oxido-17&alpha;-oxy-cortexon-21- acetat in 2 ems Methanol. Man lässt 5 Tage bei 270 schütteln, nutscht dann das Mycel ab, wäscht es mit Wasser und Essigester und extrahiert dievereinigtenFiltrate mit Essigester.

Die Essigester-Lösungen wäscht

man mit Wasser, trocknet sie und dampft sie im Vdkuum ein. Der Extraktionsrückstand enthält auf Grund der papierchromatographischen Untersuchung 1-Dehydr-9,11ss-oxido-17&alpha;-oxy-cortexon, das mittels eines praparativen Papierchromatogramms (System Propylenglykol-Toluol) von unverändertem Ausgangsmaterial abgetrennt wird. Das Rohprodukt wird im Hochvakuum getrocknet und mit 4 CIT. Pyridin-Essig-
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peratur stehen. Dann gibt man Wasser zu und extrahiert mit Chloroform-Äther (1 ; 3). Nach dem Waschen mit Wasser, Trocknen und Verdampfen der Lösungsmittel im Vakuum erhält man das 1-Dehydro-9 < x- fluor-hydrocortison-21-acetat. vomF. = 235- 2370.

PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von Dehydroverbindungen der Steroidreihe, die in 1, 2- und 4. 5-Stellung je eine Doppelbindung aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass man in 1, 2-Stellung gesättigte Steroid-Verbindungen der aeroben Einwirkung von Enzymen von Calonectria decora, Alternaria passi- florae. Ophiobolus heterostrophus oder Ophiobolus Miyabeanus unterwirft.
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Claims

verbindungen als Ausgangsstoffe verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ais Ausgangsstoff Cortison verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff Hydrocortison verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff 11-Epi-hydro- cortison verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff Corticosteron verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als ujgangssfoffll-Desoxy- corticosteron verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Auzgaugsstoff #5-3ss-Oxy-20- oxo-pregnen verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Augangsstoff aldosteron verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Aurgangsstoff 18-Oxy-corticosteron verwendet.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff 18-Oxy-cortexon verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgjnistoff 18-Oxo-cortexon verwendet.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff Progesteron verwendet.

14. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff Allopregnan-3,20-dion verwendet.

15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in l, 2-Stellung gesättigte Androstanverbindungen als Ausgangsstoffe verwendet.

16. Verfahren nach den Ansprüchen 1,2 und 15, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoffe 9a-Fluor-oder 9 < x-Chlorderivate verwendet.

17. Abänderung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass man den genannten Verbindungen entsprechende Ausgangsstoffe verwendet, die eine Doppelbindung in 1, 2-statt in 4,5-Stellung aufweisen.

18. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff Pregnan- oder Allopregnan-3, 11, 20-trion-17a, 21-diol verwendet.

19. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff Pregnan- oder Allopregnan-3, 20-dion-llss, 17a, 21-triol verwendet.

20. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 15, dadurch gekennzeichnet, dass Iran in 1, 2-Stellung gesättigt Androstan-Verbindungen, die in 17-Stellung eine freie Oxy-, Oxo-oder Carboxylgruppe aufweisen, als Ausgangsstoffe verwendet. <Desc/Clms Page number 9>

21. Abänderung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass man an Stelle von. Enzymen der in Anspruch 1 genannten Mikroorganismen solche der Pilzart Didymella lycopesici verwendet.

22. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff no-Methyl- testosteron verwendet.

23. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff 17α-Äthinyl- testosteron verwendet.