DEC0009818MA - - Google Patents
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.Tag'der Anmeldung: 16. August 1954
Btekaiimtgemacht am 2. August 1956
DEUTSCHES PATENTAMT
Gegenstand der Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung von Oxydationsprodukten der Steroidreihe,
insbesondere zum Abbau der Seitenkette von Pregnanverbindungen und zur Herstellung von un-
-gesättigten Verbindungen der Androstanreihe auf biochemischem-Wege.
'. Das; Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß
man auf gesättigte oder ungesättigte Androstane oder Pregnane, die in der 3- und der 17- bzw. in der
<2O-Stellung eine freie oder geschützte Oxy- oder Oxogru'ppe
aufweisen, Kulturen von Fusarium solani, Fusarium caucasicum, Rhizopus suinus, Venturia
chlorospora oder Venturia linicerae bzw. darin enthaltene Enzyme einwirken ■ läßt. . -;.-i .
Zur Kultur der genannten Pilze eignen sich die an sich hierfür bekannten Nährböden, z. B. solche mit
Zuckern, wie Glucose oder Lactose, mit Peptonen, ■ Maisquellwasser oder Sojaprodukten sowie mit Mineralsalzen,
oder aber synthetische Nährlösungen. Man arbeitet insbesondere unter aeroben Bedingungen,
beispielsweise in einer Schüttelkultur oder bei untergetauchtem Wachstum unter Rühren und Luftzufuhr.
Die Eumyceten unterscheiden sich von anderen Mikroorganismen; z.B. den Bakterien, durch gutes
Wachstum unter verhältnismäßig einfachen Zuchtbedingungen. Die verfahrensgemäße Reaktion findet
in der beschriebenen Pilzkultur bzw. mit den darin enthaltenen/gegebenenfalls angereicherten oder ab-
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getrennten Enzymen statt, im einfachsten Fall also in einer Aufschlämmung des abgetrennten Pilzmyzels,
des homogenisierten Pilzmyzels oder in dessen Filtraten bzw. wasserhaltigen Extrakten.
Als Ausgangsstoffe für das neue Verfahren verwendet man gesättigte oder ungesättigte Verbindungen
der Pregnan- und Androstanreihe, z. B. Progesteron, ii-Dehydroprogesteron, ii-Ketoprogesteron,
ii-, 12- oder 14-Oxyprogesterone, 5- oder
4"Pregnen-3-ol-2O-one, 5-Pregnen-3, 20-diole, ii-Desoxycorticosteron,
Corticosteron, 11-Dehydrocorticosteron, 4- oder 5-Androsten-3, 17-dion, Testosteron,
5-Androsten-3-ol-i7"On, Adrenosteron, Pregnan-3,
20-dion, Pregnan-3-ol-2O-on, Androstan-3, 17-dion, Allopregnan-3, 20-dion, 3 (3-Acetoxyallopregnan-2O-on
bzw. entsprechende Verbindungen mit geschützten Oxy- oder Oxogruppen. In den Ausgangsstoffen
stellt die geschützte Oxygruppe z. B. eine mit einer aliphatischen, aromatischen oder heterocyclischen
Carbonsäure, beispielsweise Essigsäure, Propionsäure, Benzoesäure oder Furancarbonsäure, veresterte
oder eine verätherte Oxygruppe dar, z. B. die Tetrahydropyranyloxy-, Benzyloxy- oder Triphenylmethoxygruppe.
Die geschützte Oxogruppe ist vorteilhaft eine ketalysierte Oxogruppe, abgeleitet insbesondere
von einem zweiwertigen Alkohol, wie die Äthylendioxygruppe. Im übrigen können die Ausgangsstoffe
Doppelbindungen enthalten, z. B. in 4-, 5". 6-, 7-, 8-, 9 (11)-, 11- oder 14-Stellung, oder
zusätzliche Substituenten aufweisen, wie freie oder geschützte Oxy-, Oxo- oder Carboxylgruppen, ferner
Epoxygruppen oder Halogenatome, beispielsweise in 4-, 5-/6-, 7-, 8-, 9-, 11-, 12-, 14-, 15- oder 21-Stellung.
Die vorstehend genannten Ausgangsstoffe sind von beliebiger sterischer Konfiguration. Das Verfahren
läßt sich auch mit Gemischen durchführen, die einen oder mehrere der vorstehend genannten Ausgangsstoffe
enthalten,- So erhält man z. B., ausgehend von dem bei der Cholesterinoxydation gebildeten Neutralteil,
insbesondere nach anschließender Dehydrierung der 3-ständigen Oxygruppe unter anderem das
i, 4"Androstadien-3, 17-dion.
Die Abtrennung der Verfahrensprodukte läßt sich nach bekannten Methoden durchführen. Sie kann
z.B. durch Extraktion des Reaktionsgemisches mit einem organischen Lösungsmittel, z.B. Methylenchlorid
oder Essigester, erfolgen. Für die weitere Reinigung des so erhaltenen Extraktes eignen sich
besonders chromatographische Methoden, z.B. Adsorption an Aluminiumoxyd oder Silicagel, Anwendung
von Verteilungsmethoden, z.B. dem Gegenstromverfahren, oder die Trennung mit den sogenannten
»Girard-Reagenzien«, wie Trimethylammonium- oder Pyridinium-essigsäurehydrazid. Anschließend
an die Reinigung oder an ihrer Stelle wird schließlich vorzugsweise aus organischen oder wäßrigorganischen Lösungsmitteln umkristallisiert.
Mit dem neuen biochemischen Verfahren lassen sich z.B. das Progesteron wie auch das 5-Pregnen-3
(5-ol-2o-on, n-Desoxy-corticosteron oder 4-Androsten-3,
17-dion unter Verwendung z. B. von Fusarium solani in nur einer Verfahrensstufe und mit
hoher Ausbeute in das 1, 4-Androstadien-3, 17-dion überführen. Diese Umwandlung ist auf chemischem
Wege nur in einem vielstufigen Verfahren mit wesentlieh
niedrigerer Gesamtausbeute möglich. Das 1, 4-Androstadien-3, 17-dion stellt ein wichtiges Ausgangsmaterial
für die Synthese des Oestrons dar, das daraus in einer einzigen Verfahrensstufe erhältlich ist. Aus
den in der 4 (5)- und 5 (6)-Stellung gesättigten, in 3-Stellung eine freie oder geschützte Oxy- oder Oxogruppe
aufweisenden Pregnanverbindungeri lassen sich je nach der Dauer der Bebrütung die entsprechenden
gesättigten 17-Ketone oder deren im Ring A dehydrierten Derivate, beispielsweise die
i, 4-Androstadien-3, 17-dione gewinnen. Analog erhält
man aus den entsprechenden gesättigten Androstanverbindungen deren im Ring A dehydrierten Abkömmlinge.
Bei längerer Bebrütung wird aus Progesteron, aus dem i, 4"Androstadien-3, 17-dion und
aus anderen genannten Ausgangsstoffen eine neue Verbindung, das 1, 2-Dehydrotestolacton vom F. = 219
bis 220° und der spezifischen Drehung [α] 2 D 2 = —49 ±3°
(c = 1,025 m CHCl3), erhalten. Dieses weist ini
Ultraviolettspektrum bei 242 ταμ ebenfalls eine starke Bande auf (ioge = 4,23) und enthält 75,70% Kohlenstoff
und 8,05 % Wasserstoff (berechnet für C19H24O3 :
C 75,97; H 8,05%). Mit anderen Pilzen, z.B. Rhizopus suinus, erhält man an Stelle dieser Verbindung auch
das bekannte Testolacton.
Die Verfahrensprodukte können als Heilmittel oder als Zwischenprodukte zu deren Herstellung dienen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
4 1 einer Nährlösung, bestehend aus 30 cm3 Maisquellwasser,
50 g Pepton, 200 mg Rohglucose und Leitungswasser, werden gleichmäßig in 13 Erlenmeyerkolben
je 11 Fassungsvermögen verteilt und sterilisiert. Das pH dieser Lösungen beträgt 6,4. Sie
werden mit einer Kultur des' Pilzes Fusarium solani beimpft und bei. 25° mechanisch geschüttelt. Nach
48 Stunden hat sich der Pilz stark vermehrt. Auf die 13 Erlenmeyerkolben verteilt man unter sterilen
Bedingungen eine Lösung aus ig Progesteron in
45 cm3 Aceton. Man schüttelt noch weitere 48 Stunden bei der vorstehend genannten Temperatur und filtriert
dann vom Myzel ab. Das pH des Kulturfiltrates beträgt jetzt 7,9.
Die Lösung wird einmal mit 1500 cm3, zweimal mit
je 1000 cm3 und schließlich zweimal mit je 500 cm3
Methylenchlorid ausgeschüttelt. Der Extrakt wird zweimal mit je 300 cm3 0,1 η-Salzsäure, zweimal mit
je 300 cm3 i°/oiger Natriumbicarbonatlösung und
dreimal mit je 300 cm3 Wasser gewaschen, über Natriumsulfat
getrocknet und im Vakuum eingedampft. Den teilweise kristallinen Rückstand (1,14 g) chromatographiert
man an einer mit 30 g Aluminiumoxyd bereiteten Säule in einer Benzol-Petroläther-(6 : 4)-Lösung
nach der Durchlaufmethode.
Die Benzol-Petroläther- und die Benzol-Eluate werden vereinigt und aus Aceton-Petroläther umkristallisiert.
Man erhält papierchromatographisch einheitliche farblose, rhombische Platten vom F. = 145
bis 1460; [a]D = +110° ±4° (CHCl3), +1120 ±4°
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(Alkohol). . Diese Verbindung stellt das bekannte i, 4-Androstadien-3, 17-dion dar. Ausbeute etwa 80%.
Wird an Stelle der Progesteronlösung eine Lösung aus ι g n-Desoxycorticosteron oder aus 1 g 4-Androsten-3,
17-dion in 45 cm3 Aceton einer entsprechenden Kultur von Fusarium solani zugesetzt,
die Kultur in der oben beschriebenen Weise behandelt und aufgearbeitet, so erhält man das 1,4-Androstadien-3,
17-dion ebenfalls in hoher Ausbeute.
Ersetzt man im obigen Beispiel die Kultur von Fusarium solani durch eine auf gleichem Nährboden hergestellte Kultur von Fusarium caucasicum, so wird Progesteron mit gleich hoher Ausbeute in i, 4-Androstadien-3, 17-dion übergeführt.
Ersetzt man im obigen Beispiel die Kultur von Fusarium solani durch eine auf gleichem Nährboden hergestellte Kultur von Fusarium caucasicum, so wird Progesteron mit gleich hoher Ausbeute in i, 4-Androstadien-3, 17-dion übergeführt.
Zu 4 1 einer Kultur von Fusarium solani, die, wie im Beispiel 1 beschrieben, hergestellt wurde, gibt
man unter sterilen Bedingungen eine Lösung aus '20 ig 5-Pregnen-3/S-ol-2O-on in 37 cm3 Methanol. Die
Kultur wird weitere 48 Stunden bei 260 geschüttelt, das Myzel darauf abfiltriert und das Kulturfiltrat,
wie im Beispiel 1 beschrieben, mit Methylenchlorid extrahiert.
Den Extraktionsrückstand chromatographiert man an einer mit 30 g Aluminiumoxyd bereiteten Säule
in einer Benzol-Petroläther-(8 : 2)-Lösung nach der Durchlaufmethode. Die ersten Benzol-Petroläther-Fraktionen
werden vereinigt (etwa 140 mg) und aus Aceton-Petroläther umkristallisiert. Die erhaltenen
rhombischen Platten vom F. = 145 bis 146° stellen das i, 4-Androstadien-3, 17-dion dar. Einzelne weitere
Fraktionen des Chromatogramms enthalten in kleiner Menge das 5-Androsten~3ß-ol-i7-on.
Eine Lösung aus 20 g des bei der Chromsäureoxydation des Cholesterylacetatdibromids gebildeten,
entbromten, hydrolysierten und anschließend nach der Methode von Oppenauer dehydrierten Neutralteils
in 700 cm3 Aceton gibt man zu 40 1 einer Kultur von Fusarium solani, dargestellt nach Beispiel 1, in einem
üblichen Kulturansatz unter Rühren und Belüften. Nach der im Beispiel 1 beschriebenen Bebrütung und
Aufarbeitung gewinnt man 5,2 g 1, 4-Androstadien-3, 17-dion.
Zu 4 1 einer nach Beispiel 1 bereiteten Kultur von Fusarium caucasicum gibt man die Lösung aus 1 g
I, 4"Androstadien-3, 17-dion in 35 cm3 Aceton. Nach 7tägiger Bebrütung wird, wie im Beispiel 1 beschrieben,
aufgearbeitet und der' erhaltene Extrakt nach der Entmischungsmethode gereinigt. Durch Umkristallisieren
aus Aceton erhält man schließlich etwa 6o°/0 der neuen Verbindung 1, 2-Dehydrotestolacton vom
F. = 219 bis 220° und der spezifischen Drehung [α] % = —49 ±5° (c = 1,025 in CHCl3); Ultraviolettspektrum:
Xmax = 242m/*; log.Z' = 4,23. Mikroanalyse:
C = 75,70, H = 8,05%.
Die gleiche Verbindung wird unter den Bedingungen des Beispiels 1 aus Progesteron, 5-Pregnen-3,
20-dion, 5-Pregnen-3/3-ol-2O-on, ii-Desoxy-corticosteron
oder 4-Androsten-3, 17-dion gewonnen, wenn man an Stelle von 2 Tagen 6 bis 10 Tage bebrütet.
Drei Erlenmeyerkolben von je 200 Cm3 Fassungsvermögen, die je 50 cm3 der im Beispiel 1 beschriebenen
sterilen Nährlösung enthalten, werden mit Fusarium solani beimpft und 48 Stunden bei 260
mechanisch geschüttelt. Dann gibt man zu jeder Kultur eine Lösung aus je 10mg Allopregnan-3,20-dion
in 0,5 cm3 Aceton und schüttelt weiter bei 260. Nach 24 und 48 Stunden sowie nach 7 Tagen wird je eine
Kultur filtriert und, wie im Beispiel 1 beschrieben, extrahiert. Die drei Extraktionsrückstände 1 bis 3
werden papierchromatographisch untersucht. Die Extrakte 1 und 2 enthalten das Androstan-3,17-dion,
während im Extrakt 3 das 1,4~Androstadien-3,17-dion
vorhanden ist.
Ersetzt man im vorstehenden Beispiel das Allopregnan-3, 20-dion durch eine entsprechende 3/3-Acetoxy-allopregnan-20-on-lösung,
so findet man in den Extrakten ebenfalls nach 24- bzw. 48 stündiger Bebrütung
das Androstan-3, 17-dion und nach 7tägiger Bebrütung das 1, 4-Androstadien-3, 17-dion. Ersetzt
man im vorstehenden Beispiel das Allopregnan-3, 20-dion durch das Androstan-3, 17-dion, so findet
man in den Extrakten nach 24- bzw. 48 stündiger Bebrütung nur unverändertes Ausgangsmaterial und
nach 7tägiger Bebrütung das 1,4-Androstadien-3, 17-dion.
4 1 einer sogenannten Czapek-Dox-Nährlösung (Zusammensetzung:
2 g NaNO3, ι g K2HB4, 0,5 g KCl,
o,5g MgSO4, 0,02 g FeSO4, 50 g Glucose in 1 1
Wasser) werden gleichmäßig in zwei Schüttelgefäße verteilt, sterilisiert und mit einer Kultur des Pilzes
Rhizopus suinus beimpft. Nach 2tägigem Schütteln bei 260 hat sich der Pilz gut entwickelt, und man gibt
unter sterilen Bedingungen in jedes Gefäß eine Lösung aus 500 mg 11-Desoxycorticosteron in 15 cm3
Aceton. Man schüttelt noch weitere 4 Tage bei der vorstehend beschriebenen Temperatur und filtriert
dann vom Myzel ab. Das Kulturfiltrat wird wie beschrieben ausgeschüttelt und der Extrakt gewaschen,
getrocknet und eingedampft. Der Rückstand (1 g) wird im Gegenstromverfahren aufgetrennt. Dazu löst
man ihn in 50 cm3 absolutem Äthanol und 150 cm3
Wasser und zieht mit 200 cm3 Benzol aus. Die untere Schicht wird abgetrennt und durchläuft vier weitere
Scheidetrichter, die mit je 200 cm3 mit 25°/0igem
Äthanol gesättigtem Benzol beschickt sind. Diese Prozedur wird viermal mit je 200 cm3 mit Benzol
gesättigtem 25°/0igem Äthanol wiederholt, so daß schließlich fünf Benzol- und fünf wäßrige Alkohollösungen
vorliegen. Sie werden im Vakuum eingedampft. Die papierchromatographische Untersuchung
zeigt, daß in den wäßrig-alkoholischen Lösungen nur wenig hochpolare Nebenprodukte vorhanden
sind, während die ersten drei Benzollösungen. 650 mg einer Verbindung enthalten, die etwas höherpolar
als das Ausgangsmaterial ist und kein Reduktionsvermögen besitzt. Durch Umkristallisieren aus
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Acetonpetroläther erhält man das Testolacton in
Nadeln vom F. = 203 bis 2o6°; [a]a '= +40°
(c = 1065 in Chloroform) Absorptionsbanden im Infrarot bei 5,81, 5,98 und 7,17 μ (Nujol = besonders
gereinigtes Päraffmöl).
Mikroanalyse für C1^H26O3:
Mikroanalyse für C1^H26O3:
berechnet ............. .'V C 75,46%, H 8,67%;
gefunden C 75,26%, H 8,80%.
Vier Erlenmeyer kolben von je 200 cm3 Fassungsvermögen,
die je 50 cm3 der im Beispiel 1 beschriebenen
sterilen Nährlösung enthalten, werden mit Fusarium solani beimpft und 48 Stunden bei 260
mechanisch geschüttelt. Dann trennt man das Myzel der vier Kulturen einzeln ab und wäscht es mit Wasser.
Die Myzele von zwei Kulturen werden direkt in zwei Erlenmeyerkolben in je 50 cm3 destilliertem Wasser
suspendiert, während die andern zwei Myzele einzeln zuerst in einem Homogenisator mit 50 cm3 destilliertem
Wasser zerkleinert und erst dann in je einen Erlenmeyerkolben übergeführt werden. Zu den zwei
Myzelaufschlämmungen und den zwei Mycelhomogenaten gibt man je eine Lösung von 10 mg Progesteron
in 0,5 cm3 Aceton und läßt die mit Watte verschlossenen Erlenmeyerkolben bei - 260 mechanisch
schütteln. Nach 36 Stunden werden eine Myzelaufschlämmung und ein Mycelhomogenat filtriert
und, wie im Beispiel 1 beschrieben, extrahiert. Die papierchromatographische Untersuchung zeigt, daß
die Extraktionsrückstände neben wenig Progesteron zur Hauptsache 1,4-Androstadien-3, 17-dion enthalten.
Nach 7 Tagen werden die zweite Myzelsuspension und das zweite Myzelhomogenat in gleicher
Weise aufgearbeitet und untersucht. In den so erhaltenen Extrakten ist einzig 1, 2-Dehydrotestolacton
vorhanden.
Wird im Beispiel 6 an Stelle der Kultur von Rhizopus suinus eine solche von Venturia chlorospora
oder Venturia liniceräe Verwendet und wird im
übrigen 1 i-Desöxycorticosterdn in gleicher Weise inkubiert,
so erhält man nach analoger Aufarbeitung Testolacton vom F. = 203 bis 206°.
Claims (3)
- PATENTANSPKCCIIli: :ι. Verfahren zur Herstellung von oxydierten Steroiden durch Bebrütung der zu oxydierenden Steroide mit einer Kultur eines niederen Pilzes . oder den daraus erhältlichen Enzymen und Abtrennung der Oxydationsprodukte, dadurch gekennzeichnet, daß man Androstane oder Pregnane, die in 3- und 17- bzw. in 20-Stellung eine freie oder geschützte Oxy- oder Oxogruppe enthalten, mit Kulturen von Fusarium solani, Fusarium caucasicum, Rhizopus suinus, Venturia chlorospora oder Venturia liniceräe biologisch oxydiert.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen der Pregnan- oder Androstanreihe mit einer 4(5)- oder 5(6)-ständigen Doppelbindung, insbesondere Progesteron, 5-Pregnen-3/3-ol-2O-on, 11-Desoxycorticosteron, 4'-Androsten-3, 17-dion, 5-Androsten-3^-ol-17-on, ferner den bei der Chromsäureoxydation des Cholesterylacetatdibromids gebildeten, entbromierten, hydrolysierten und anschließend nach der Methode von Oppenauer. dehydrierten Neutralteil sowie Allopregnan-3, 2.0-dion oder 3/?-Acetoxy-allopregnan-2O-oii als Ausgangsstoffe verwendet.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultur des Pilzes bzw. darin enthaltene Enzyme 1 bis 2 Tage oder 6 bis 15 Tage auf das Ausgangssteroid einwirken läßt. ■In Betracht gezogene Druckschriften:
USA.-Patentschrift Nr. 2602769;
Experientia, Bd. 8, 1952, S. 422;
Research (London), Bd. 6, 1953, S. 309.© 609 577/488 7. 56
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