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Verfahren zur Herstellung polyoxigenierter Dehydrosteroide Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung polyoxigenierter Dehydrosteroide
durch Dehydrierung und Einführung von Sauerstoff in verschiedene Stellungen auf
biochemischem Wege.
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Es ist bereits bekannt, mit Hilfe von Mikroorganismen Sauerstoff in
bestimmte Stellungen von Steroiden, insbesondere in 11-Stellung, einzuführen (vgl.
z. B. USA.-Patentschrift 2 602 769). In der deutschen Patentschrift 962 435 ist
ein Verfahren beschrieben worden, nach welchem es durch Verwendung bestimmter Pilze
gelingt, Steroide in 17-Stellung zu oxigenieren. Gemäß Patentanmeldung C 11424 IVb/12o
ist es ferner möglich, auf biochemischem Wege Sauerstoff in die 21 -Stellung von
Steroiden einzuführen. Es ist auch bekannt, daB man mit Hilfe von Kulturen bestimmter
Pilze Steroide gleichzeitig in verschiedenen Stellungen, z. B. in 6- und 11-Stellung,
oxigenieren kann. Gemäß Patentanmeldung C 12510 IVb/12o kann ferner in Steroide
die 1(2)- und gegebenenfalls die 4(5)-ständige Doppelbindung auf mikrobiologischem
Wege ohne Seitenkettenabbau oder Ringaufspaltung eingeführt werden. Bis jetzt war
es jedoch nicht möglich, in einem Arbeitsvorgang auf biochemischem Wege Sauerstoff
in wenigstens eine der wichtigen Stellungen 11, 17 und 21 und eine Doppelbindung
in die 1(2)- und/oder 4(5)-Stellung einzuführen. Ein solches Verfahren wäre offensichtlich
von großer technischer Bedeutung.
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Es wurde nun gefunden, daß man in einfacher Weise polyoxigenierte
Dehydrosteroide herstellen kann, wenn man auf in 1(2)- und/oder 4(5)-Stellung gesättigte
Steroide, die in wenigstens einer der Stellungen 11, 17 und 21 nicht oxigeniert
sind, in einem Arbeitsgang Enzyme aus aeroben Kulturen von Calonectria decora, Ophiobolus
heterostrophus, Ophiobolus Miyabeanus, Alternaria passiflorae oder Didymella lycopersici,
die in 1(2)- und/oder 4(5)-Stellung zu dehydrieren vermögen, und Enzyme aus aeroben
Kulturen von wenigstens einer aus einer Gruppe von Pilzen der Gattungen Rhizopus,
Mucor, Aspergillus, Penicillium, Curvularia, Cunninghamella, Spondylocladium oder
Streptomyces oder der Arten Trichothecium roseum, Leptosphaeria maculans, Cucurbitaria
laburni, Acrospeira levis, Lophotrichus hartinii, Melanospora parasitica oder Thielavia
terricola oder der Arten Ophiobolus herpotrichus oder Sclerotinia fructicola, die
Sauerstoff in 11-, 17- oder 21-Stellung einführen, einwirken läßt.
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Die Ausgangsstoffe für das neue Verfahren sind in 1(2)- und/oder 4(5)-Stellung
gesättigte Steroide, z. B. Abkömmlinge des Spirostans, Allospirostans, Furostans,
Allofurostans, Cholans, Allocholans, Androstans, Testans, vorzugsweise Verbindungen
der Pregnanreihe, worunter beliebig konfigurierte Derivate des 10,13-Dimethyl-L7-äthyl-cyclopentanopolyhydrophenanthrens
sowie seiner höheren und niederen Homologen, beispielsweise entsprechende A-Nor-,
D-Homo- und 19-Nor-Verbindungen verstanden sind. Sie können gesättigt sein oder
Doppelbindungen aufweisen, z. B. in 1- oder 4-Stellung, ferner in 5-, 6-, 7-, 8-,
9-, 11-, 14-, 15- und/oder 16-Stellung. Die Konfiguration der Ausgangsstoffe ist
insbesondere diejenige des Pregnans, 5a-Pregnans, 17a-Pregnans oder entsprechender
Racemate, wie sie bei der Totalsynthese erhalten werden. Als solche Ausgangsstoffe
verwendet man vor allem in 1(2)- und/oder 4(5)-Stellung gesättigte, in 3- und 20-Stellung
und gegebenenfalls in 18-Stellung und/oder in einer der Stellungen 11, 17 und 21
oxygenierte Verbindungen und ihre funktionellen Derivate, also Pregnane, die in
den genannten Stellungen eine freie oder funktionell abgewandelte Oxo- oder Oxygruppe
aufweisen, wie z. B. Ester, Äther, Thioäther, Thiol- oder Thionester, Acetale, Mercaptale,
Ketale, Enolderivate, wie Enolester oder Enamine, Hydrazone, Semicarbazone und dergleichen.
Sie können auch weiter substituiert sein, nämlich z. B. durch freie bzw. funktionell
abgewandelte Oxy-, Oxo- oder Epoxygruppen, beispielsweise in 6-, 7-, 9-, 11-, 12-,
15-, 16- oder 19-Stellung, und insbesondere durch Halogenatome, wie Chlor-oder Fluor
in 9-Stellung, oder durch eine Methylgruppe in 17a- oder 17ß-Stellung. Spezifische
Ausgangsstoffe sind unter anderem Progesteron, 17a-Progesteron, 16a-Oxy-, 17a-Oxy-
oder 18-Oxy-progesteron, Cortexon, 18-Oxy- oder 18-Oxo-cortexon, 11-Keto-progesteron,
11a- sowie 11ß-Oxy-progesteron, 9,11- oder 11,12-Dehydro-progesteron, 19-Oxy-progesteron,
9-Chlor- oder 9-Fluor-llß-oxy-progesteron, 11ß,18-Dioxy-progesteron, 11ß - Oxy -18
- oxo - progesteron 9-Chlor- oder 9 - Fluor-11ß-oxy-18-oxo-progesteron, 11,18-Dioxo-progesteron,
19-Nor-progesteron,
19-Nor-llß-oxy-18-oxo-progesteron, entsprechende statt in 4- in 1-Stellung ungesättigte
Verbindungen, Pregnenolon, d 5-Pregnen-3,20-diole, Pregnan-3,20-dion, Pregnen-3-ol-20-on,
Allopregnan-3,20-dion, Pregnan-3,11, 20-trion, Allopregnan-3,11,20-trion-17a-ol
oder ihre funktionellen Derivate.
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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man mit isoliertem oder
angereichertem Enzympräparaten, insbesondere aber mit rohen wachsenden Pilzkulturen,
mit deren Filtraten oder mit Mycelsuspensionen arbeiten.
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Die zur Züchtung dieser Pilze verwendeten Kulturlösungen werden zweckmäßig
bewegt, d. h. geschüttelt oder gerührt, und enthalten assimilierbaren Kohlenstoff,
insbesondere Kohlenhydrate, sowie gegebenenfalls Wuchsstoffe, beispielsweise Maisquellwasser
oder Bierwürze, und anorganische Salze. Es sind somit natürliche, synthetische oder
halbsynthetische Nährlösungen brauchbar. Man verwendet zweckmäßig solche Nährlösungen,
die allen verwendeten Pilzen optimale Wachstumsbedingungen bieten. Es ist auch möglich,
später für die Pilze speziell geeignete Nähr- und Wuchsstoffe zuzusetzen.
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Das Verfahren wird in einem Arbeitsgang durchgeführt. Es hat sich
aber als vorteilhaft erwiesen, die Dehydrierung und Oxigenierungen an den genannten
Stellungen zeitlich nacheinander vorzunehmen. Das praktisch einfachste Verfahren
ist im folgenden geschildert, ohne daß die Erfindung durch diese Angaben beschränkt
sein soll.
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Man züchtet den für die erste Oxigenierung bzw. die Dehydrierung benötigten
Organismus in Apparaturen und unter ähnlichen Bedingungen, wie sie bei der Antibiotikafabrikation
als sogenannte Tieftankverfahren bekannt sind. Nach Entwicklung der Kulturen gibt
man die genannten Ausgangsstoffe in feiner Dispersion oder Lösung, beispielsweise
in Methanol, Aceton oder Äthylenglykol zu und irrkubiert weiter, bis die maximale
Umsetzung erreicht ist. Dann gibt man, ohne vorher zu filtrieren oder das Umsetzungsprodukt
zu isolieren, zum Reaktionsgemisch eine ausgewachsene Kultur des zweiten Organismus
und nötigenfalls entsprechende Näbrsubstanzen und Wuchsstoffe zu und fährt mit der
Inkubation fort. Gegebenenfalls wird diese Operation mit einem weiteren Mikroorganismus
wiederholt. Der Verlauf der Dehydrierung und der einzelnen Oxigenierungen kann papierchromatographisch
verfolgt werden. Schließlich trennt man vom Mycel ab, extrahiert das Filtrat und/oder
die Mycelmasse und isoliert aus demExtrakt die Reaktionsprodukte in an sich bekannter
Weise, z. B. durch Entmischungsverfahren, Adsorption, Chromatographie, Kristallisation
oder Überführung in funktionelle Derivate, wie Girard-Verbindungen.
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Die Pilzkulturen bzw. Enzyme können in beliebiger Reihenfolge zugegeben
werden. Im übrigen läßt sich durch Vorversuche leicht feststellen, welche Reihenfolge
gegebenenfalls Vorteile bietet.
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Nach dem Verfahren gelangt man zu wertvollen Heilmitteln der Steorid-,
insbesondere der Pregnanreihe, die sich, verglichen mit den in 1(2)-Stellung gesättigten
therapeutisch wirksamen Verbindungen, durch eine gesteigerte Wirksamkeit auszeichnen.
Von den Verfahrensprodukten sind insbesondere zu nennen das d1,4-3,11,20-Trioxo-17a,21-dioxypregnadien,
4l>4-3,20-Dioxo-11ß,17a, 21-trioxy-pregnadien, 41,4-3,11,20-Trioxo-21-oxy-pregnadien,
d 1,4 - 3,20 - Dioxo -11ß,21 - dioxy - pregnadien, dl,4-3,20-Dioxo-17a,21-dioxy-pregnadien,
dh4-3,20-Dioxo-21-oxy-pregnadien, 41,4-3,18,20-Trioxo-llß,-21-dioxy-pregnadien,
dh4-3,11,18,20-Tetraoxo-21-oxy-pregnadien, dI,4-3,20-Dioxo-11ß,18,21-trioxy-pregnadien,
d I,4 - 3,18,20 - Trioxo - 11ß,17a,21 - trioxy - pregnadien, d1,4 - 3,11,18,20 -
Tetraoxo - 17a,21 - dioxy - pregnadien, , d1,4 - 3,20 - Dioxo -11ß,17a,18,21 - tetraoxy
- pregnadien, 4l>4-3,20-Dioxo-18,21-dioxy-pregnadien, d1,4-3,18,-20-Trioxo-21-oxy-pregnadien,
dI,4-3,20-Dioxo-17a,18,-21-trioxy-pregnadien, dl>4-3,18,20-Trioxo-17a,21-dioxypregnadien,
die entsprechenden 21-Oxo- sowie 21-Desoxyverbindungen, ferner entsprechende funktionelle
Derivate, wie Ester, Äther, Halogenderivate, z. B. 9a-Halogen-, insbesondere die
Fluor- oder Chlorverbindungen. Sofern die Verfahrensprodukte nicht die Konfiguration
und die Substituenten von therapeutisch verwendbaren Steroiden aufweisen, können
sie als Zwischenprodukte zu deren Herstellung z. B. der obengenannten Verbindungen
dienen.
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Die verfahrensgemäß erhältlichen Umsetzungsprodukte lassen sich in
an sich bekannter Weise in ihre funktionellen Derivate, wie Sauerstoff-, Schwefel-
oder Stickstoffderivate, beispielsweise Ester, Äther, Enolester, Enoläther, Ketale,
Thioäther und Thioketale, ferner Hydrazone, Oxime und Enamine überführen. In diesen
Verbindungen können die Oxy- und/oder Oxogruppen vollständig oder teilweise funktionell
abgewandelt sein.
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In den Estern und Enolestern sind die Säurereste solche beliebiger
organischer und anorganischer Säuren, wie aliphatischer, alicyclischer, araliphatischer,
aromatischer öder heterocychscher Carbon-, Thioncarbon-, Thiolcarbon- oder Sulfonsäuren,
vorzugsweise der Ameisensäure, Essigsäure, Chloressigsäuren, Trifluoressigsäure,
Propionsäure, Buttersäuren, Valeriansäuren, Trimethylessigsäure, Diäthylessigsäure,
Capronsäuren, Oenanthsäuren, Caprylsäuren, Palmitinsäuren, Crotonsäure, Undecansäure,
Undecylensäure, Oxalsäure, Bernsteinsäure; Pimelinsäure, Maleinsäure, Milchsäure,
Carbaminsäuren, Alkoxycarbonsäuren, ß-Cyclopentylpropionsäure, Hexahydrobenzoesäure,
Benzoesäure, Phenylessigsäure, Cyclohexylessigsäure, Phenylpropionsäuren, Trimethylga,llussäure,
Phthalsäure, Furan-2-carbonsäure, Isonicotinsäure, Methansulfonsäure, Toluolsulfonsäure,
Schwefelsäuren, Halogenwasserstoffsäuren oder Phosphorsäuren.
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Wenn erwünscht, lassen sich in erhaltenen Verbindungen funktionell
abgewandelte Oxy- oder Oxogruppen in freie Gruppen überführen. Auf diese Weise können
insbesondere in polysubstituierten Derivaten die funktionell abgewandelten Gruppen
auch teilweise in Freiheit gesetzt werden. Dies erfolgt z. B. durch chemische oder
enzymatische Hydrolyse, beispielsweise unter Verwendung saurer oder basischer Mittel,
durch Umesterung oder Umacetalisierung. Aus den auf diese Weise oder auch direkt
erhaltenen, nur partiell abgewandelten, wie veresterten bzw. verätherten Derivaten
lassen sich durch anschließende funktionelle Abwandlung, z. B. Veresterung oder
Verätherung, polysubstituierte Derivate, insbesondere auch gemischte Ester oder
Äther bzw. Ester-Äther, herstellen.
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"Erhaltene 9,11ß-Oxido-Verbindungen lassen sich durch Umsetzung mit
Halogenwasserstoffsäuren, insbesondere Fluor- und Chlorwasserstoffsäure, in die
entsprechenden 9,11-Halogenhydrine überführen.
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Die Verfahrensprodukte können als Heilmittel oder als Zwischenprodukte
zu deren Herstellung Verwendung finden.
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Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher beschrieben.
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Beispiel 1 In einem Schüttelgefäß von 161 Fassungsvermögen werden
3,61 Bierwürze sterilisiert und mit 400 cm3 einer 2 Tage alten, auf Bierwürze gewachsenen
Schüttelkultur von Ophiobolus herpotrichus beimpft. Es wird 2 Tage bei 27°C geschüttelt,
wobei sich die Kultur gut entwickelt. Dann gibt man eine Lösung von 1,0 g Progesteron
in: 25 cm3 Aceton unter sterilen Bedingungen zu. Gleich-.
zeitig
beimpft man in einem zweiten Schüttelgefäß 3,61 sterile Bierwürze mit 400 cm3 einer
2 Tage alten, ebenfalls auf Bierwürze gezüchteten Schüttelkultur von Calonectria
decora. Die beiden Gefäße werden bei 27°C 3 Tage geschüttelt. Die nun ausgewachsene
Calonectriakultur wird unter sterilen Bedingungen in das 16-1-Gefäß transferiert,
welches nun weitere 2 Tage bei 27°C geschüttelt wird. Dann wird das Mycel abgetrennt
und das Kulturfiltrat viermal mit je 21 Essigester ausgeschüttelt. Die Extrakte
werden dreimal mit je 300 CM3 Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft.
Man löst den erhaltenen Rückstand (1,4 g) in 160 CM3 Methanol, gibt 40 CM3 Wasser
zu und schüttelt dreimal mit je 50 CM3 Pentan aus. Die Pentanextrakte enthalten
nur ölige Verunreinigungen, während die Steroide in der methanolischen Lösung bleiben.
Diese wird im Vakuum bei 30'C
eingedampft und im Hochvakuum getrocknet. Man
chromatographiert den Rückstand an 30 g Kieselsäuregel nach der Durchlaufmethode,
wobei man zuerst mit Chloroform, dann mit Chloroform-Aceton-Gemischen steigenden
Acetongehaltes und schließlich mit Aceton eluiert. Die einzelnen Fraktionen (je
100 cm3) werden papierchromatographisch untersucht. Die mit Chloroform eluierten
Anteile enthalten neben Verunreinigungen etwas Ausgangsmaterial und die Chloroform-Aceton-(97,5:2,5)-Gemische
etwas 4-Pregnen-21-ol-3,20-dion (Cortexon, 11-Desoxy-corticosteron). Die Hauptmenge
der Substanz befindet sich in den Chloroform-Aceton-(95: 5)-Fraktionen und besteht
zur Hauptsache aus 1,4-Pregnadien-21-ol-3,20-dion, welches aus einem Aceton-Petroläthergemisch
kristallisiert erhalten wird, F. = 185 bis 193°C; [a]D = +120°C (CHC13). UV-Absorptionsspektrum
(in Äthanol) : A"max 244 m#t (e = 14100). Beispiel 2 In einem Erlenmeyerkolben
von 500 cm3 Fassungsvermögen werden 50 cm3 Bierwürze sterilisiert undmit Ophiobolus
herpotrichus beimpft. Die Kultur wird bei 27°C geschüttelt. Nach 3 Tagen hat sie
sich gut entwickelt, und man gibt dazu unter sterilen Bedingungen eine Lösung von
15 mg Progesteron in 0,75 CM3 Aceton. Zur gleichen Zeit werden in einem zweiten
Erlenmeyerkolben 50 cm3 Bierwürze sterilisiert und mit einem Stamm Curvularia brachyspora
beimpft. Beide Kulturen werden nun in gleicher Weise bei 27°C geschüttelt. Nach
3 Tagen wird die ausgewachsene Curvulariakultur unter sterilen Bedingungen zur Ophioboluskultur
gegeben. Die vereinigten Kulturen werden weitergeschüttelt. Gleichzeitig werden
in einem dritten Erlenmeyerkolben 50 CM3 sterile Bierwürze mit Calonectria decora
beimpft und bei 27'C geschüttelt. Nach 3 Tagen wird diese Calonectriakultur unter
sterilen Bedingungen zum Gemisch der beiden anderen Kulturen gegeben, worauf weiter
bei 27°C geschüttelt wird. Nach 3 Tagen trennt man das Mycel ab und schüttelt das
Kulturfiltrat dreimal mit j e 30 CM3 Essigester aus. Die Extrakte werden mit Wasser
gewaschen, getrocknet und eingedampft. Die papierchromatographisehe Untersuchung
des Rückstandes zeigt die Anwesenheit von 1,4-Pregnadien-11ß,21-diol-3,20-dion (1-Dehydro-llß,21-dioxy-progesteron,
1-Dehydro-corticosteron); F. = 216 bis 220°C.
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Ersetzt man beim obigen Verfahren das Progesteron durch 18-Oxo-progesteron,
so wird 1-Dehydro-aldosteron erhalten.
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Beispiel 3 Wie im Beispiel2 beschrieben, wird zu einer Kultur von
Ophiobolus herpotrichus in 50 CM3 Bierwürze eine Lösung von 15 mg Progesteron in
0,75 cm3 Aceton ;egeben. Zu gleicher Zeit werden in einem zweiten Erlenmeyerkolben
50 cm3 sterilisierte Bierwürze mit Trichothecium roseum beimpft. Beide Kulturen
werden nun bei 27° C geschüttelt. Nach 3 Tagen werden sie unter Vermeidung von Infektionen
vereinigt, und das Gemisch wird weitere 3 Tage bei der gleichen Temperatur geschüttelt.
Gleichzeitig werden in einem dritten Erlenmeyerkolben 50 cm3 sterile Bierwürze mit
Calonectria decora beimpft und bei 27° C geschüttelt. Nach 3 Tagen wird diese Calonectriakultur
unter sterilen Bedingungen zum Gemisch der beiden anderen Kulturen gegeben, worauf
weiter bei 27° C geschüttelt wird. Nach 3 Tagen trennt man das Mycel ab und extrahiert
das Kulturfiltrat wie im Beispiel 1 beschrieben. Der Extraktionsrückstand enthält
gemäß papierchromatographischer Auswertung 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion
(1-Dehydro-17a,21-dioxy-progesteron) ; F. = 229 bis 233° C. ., Beispiel 4 Ersetzt
man im Beispiel 3 das Progesteron durch 11-Keto-progesteron und inkubiert man in
der beschriebenen Weise mit Kulturen von Ophiobolus herpotrichus, Trichothecium
roseum und Calonectria decora, so können im Extraktionsrückstand erhebliche Mengen
1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion (1-Dehydro-11-keto-17a, 21-dioxy-progesteron,
1-Dehydro-cortison) nachgewiesen werden; F. = 231 bis 234° C. Beispiel 5 Ersetzt
man im Beispiel 3 das Progesteron durch 11 ß-Oxy-progesteron und inkubiert man auf
gleiche Weise mit Kulturen von Ophiobolus herpotrichus, Trichothecium roseum und
Calonectria decora, so können im Extraktionsrückstand erhebliche Mengen 1,4-Pregnadien-17a,11ß,21-triol-3,20-dion
(1-Dehydro-11ß,17a,21-trioxy-progesteron, 1-Dehydro-hydrocortison) nachgewiesen
werden; F. = 238 bis 241° C.
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Beispiel 6 Wie im Beispie12 beschrieben, gibt man zu einer Kultur
von Ophiobolus herpotrichus in 50 cm3 Bierwürze unter sterilen Bedingungen eine
Lösung von 15 mg Progesteron in 0,75 CM3 Aceton. Zu gleicher Zeit werden in einem
zweiten Erlenmeyerkolben 50 cm3 sterile Bierwürze mit Leptosphaeria maculans beimpft.
Beide Kulturen werden bei 27° C geschüttelt und nach 3 Tagen vereinigt. Gleichzeitig
beimpft man in einem dritten Erlenmeyerkolben 50 CM3 sterile Bierwürze mit Curvularia
lunata. Diese Kultur und das genannte Kulturgemisch werden 3 Tage lang bei 27° C
geschüttelt, wobei sich die Curvulariakultur gut entwickelt. Sie wird dann unter
sterilen Bedingungen mit dem Kulturgemisch vereinigt. Man läßt weitere 3 Tage bei
27° C schütteln. Gleichzeitig werden in einem vierten Erlenmeyerkolben 50 cm3 sterile
Bierwürze mit Alternaria passiflorae beimpft und bei 27° C geschüttelt. Nach 3 Tagen
wird diese Alternariakultur unter sterilen Bedingungen zum Gemisch der drei anderen
Kulturen gegeben, worauf weiter bei 27° C geschüttelt wird. Dann trennt man das
Mycel ab und extrahiert das Kulturfiltrat, wie im Beispiel 1 . beschrieben. Die
papierchromatographische Untersuchung des Extraktionsrückstandes zeigt die Anwesenheit
erheblicher Mengen von 1,4-Pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion (1-Dehydro-hydrocortison)
; F. = 238 bis 241'C, neben 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion (1-Dehydrocortison)
; F. = 231 bis 234° C.
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Beispiel 7 Variiert man im Beispiel 6 die Reihenfolge der Zugabe der
genannten Kulturen, indem man das Progesteron zuerst mit einer Kultur von Curvularia
lunata inkubiert,
darauf zuerst in der beschriebenen Weise eine
Kultur von Opbiobolus herpotrichus, dann eine solche von Alternaria passiflorae
und zuletzt eine solche von Leptosphaeria maculans zugibt, so enthält der in der
üblichen Weise erhaltene Extraktionsrückstand ebenfalls 1,4-Pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion
(1-Dehydro-hydrocortison); F.=238 bis 241°C, und 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion
(1-Dehydro-cortison); F. = 231 bis 234° C. Beispiel 8 50 cm3 sterile Bierwürze werden
mit Cunninghamella Blakesleena beimpft. Die Kultur wird 2 Tage bei 27° C geschüttelt
und dann unter sterilen Bedingungen mit einer Lösung von 15 mg 11-Desoxy-corticosteron
(Cortexon) in 0,75 ml Aceton versetzt. Gleichzeitig beimpft man in einem zweiten
Erlenmeyerkolben 50 cm3 sterile Bierwürze mit Trichothecium roseum. Beide Kulturen
werden weitere 2 Tage bei der gleichen Temperatur geschüttelt und dann unter sterilen
Bedingungen vereinigt und weitergeschüttelt. Gleichzeitig werden in einem dritten
Erlenmeyerkolben 50 cm3 sterile Bierwürze mit Calonectria decora beimpft und bei
27° C geschüttelt. Nach 3 Tagen wird diese Calonectriakultur unter sterilen Bedingungen
zum Gemisch der beiden anderen Kulturen gegeben, worauf weiter bei 27° C geschüttelt
wird. Nach 2 Tagen trennt man das Mycel ab. Die Extraktion des Kulturfiltrates geschieht
in gleicher Weise, wie im Beispiel 2 beschrieben. Der Extraktionsrückstand enthält
1,4-Pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion (1-Dehydrohydrocortison); F. = 238 bis
241° C, neben 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,10,20-trion (1-Dehydro-cortison); F.
= 231 bis 234° C.
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Beispiel 9 In einem Schüttelgefäß von 181 Fassungsvermögen werden
3,61 Bierwürze sterilisiert und mit 400 cm3 einer 2 Tage alten, auf Bierwürze gewachsenen
Schüttelkultur von Ophiobolus herpotrichus beimpft. Es wird 2 Tage bei 27° C geschüttelt,
wobei sich die Kultur gut entwickelt. Dann gibt man eine Lösung von 1,0 g Progesteron
in 25 cm3 Aceton unter sterilen Bedingungen zu. Gleichzeitig beimpft man in einem
zweiten Schüttelgefäß 3,61 sterile Bierwürze mit 400 cm3 einer 3 Tage alten, ebenfalls
auf Bierwürze gezüchteten Schüttelkultur von Trichothecium roseum. Die beiden Gefäße
werden bei 27°C 3 Tage geschüttelt. Die nun ausgewachsene Trichotheciumkultur wird
unter sterilen Bedingungen in das 18-1-Gefäß transferiert, und zur gleichen Zeit
beimpft man in einem weiteren Schüttelgefäß 3,61 sterile Bierwürze mit 400 cm3 einer
24 Stunden alten, auf Bierwürze gewachsenen Schüttelkultur von Calonectria decora.
Man läßt dieses Schüttelgefäß sowie dasjenige, das das soeben beschriebene Kulturgemisch
enthält, 3 Tage bei 27°C schütteln und vereinigt deren Inhalt dann unter sterilen
; Bedingungen. Gleichzeitig werden 31 sterile Bierwürze mit 400 cm3 einer 36 Stunden
alten, auf Bierwürze gewachsenen Schüttelkultur von Curvularia lunata beimpft. Diese
Kultur sowie das Kulturgemisch im 18-1-Gefäß werden 2 Tage bei 27°C geschüttelt,
worauf man deren Inhalt unter sterilen Bedingungen vereinigt. Man schüttelt nochmals
2 Tage bei der angegebenen Temperatur und trennt dann das Mycel ab. Das Kulturfiltrat
schüttelt man viermal mit je 31 Essigester aus. Die Extrakte werden dreimal mit
je 500 cm3 Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Man löst den erhaltenen
Rückstand (1,1 g) in 160 cm3 Methanol, gibt 40 cm3 Wasser zu und schüttelt dreimal
mit je 50 cm3 Pentan aus. Die Pentanextrakte enthalten nur ölige Verunreinigungen,
während die Steroide in der methanolischen Lösung bleiben. Diese wird im Vakuum
bei 30°C eingedampft und im Hochvakuum getrocknet. Man chromatographiert den Rückstand
an 30 g Kieselsäuregel nach der Durchlaufmethode, wobei man zuerst mit Methylenchlorid,
dann mit Chloroform und mit Chloroform-Aceton-Gemischen und schließlich mit Aceton
eluiert. Die einzelnen Fraktionen (150 cm3) werden papierchromatographisch untersucht.
Die mit Methylenchlorid und mit Chloroform eluierten Fraktionen enthalten Verunreinigungen,
etwas Ausgangsmaterial und 11-Desoxycorticosteron, während in den Gemischen von
Chloroform und Aceton (9: 1 und 8:2) 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion
(1-Dehydrocortison) anwesend ist. Die betreffenden Fraktionen werden eingedampft,
und man erhält das 1-Dehydrocortison nach Umkristallisieren aus einem Aceton-Isopropyläther-Gemisch
mit Kristallen vom F. = 230 bis 233°C. Die Chloroform-Aceton-(1: 1)-Fraktionen enthalten
1,4-Pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion (1-Dehydro-hydrocortison), das aus Aceton-Petroläther
kristallisiert; F. = 238 bis 240°C.
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Beispiel 10 Verwendet man im Beispiel 9 an Stelle der Kultur von Calonectria
decora eine in gleicher Weise gezüchtete Kultur von Didymella lycopersici und geht
man im übrigen, wie im Beispiel 9 beschrieben, vor, so erhält man ebenfalls das
1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,10,20-trion (1-Dehydro-cortison) ; F. = 230 bis 233°C,
sowie das 1,4-Pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion (1-Dehydro-hydrocortison) ;
F. = 238 bis 240°C. Beispiel 11 Je 3,61 sterilisierte Bierwürze werden mit Ophiobolus
herpotrichus, Trichothecium roseum, Didymella lycopersici und Curvularia lunata
beimpft und bei 27°C geschüttelt. Nach 3 Tagen werden die Kulturen vereinigt, und
man gibt zum Gemisch eine Lösung von 1;O g Progesteron in 25 cm3 Aceton und läßt
weiter bei 27'C schütteln. Nach 4 Tagen wird das Mycel abgetrennt. Wie im Beispiel
9 beschrieben, extrahiert man das Kulturfiltrat und cbromatographiert den Extraktionsrückstand
an Kieselsäuregel. Man erhält wiederum 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion
vom F. = 230 bis 233°C und 1,4-Pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion vom F. = 238
bis 240°C.
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Beispiel 12 Je 3,61 sterilisierte Bierwürze werden mit Ophiobolus
herpotriehus, Trichothecium roseum, Didymella lycopersici und Curvularia lunata
beimpft und bei 27°C geschüttelt. Nach 3 Tagen vereinigt man die vier Kulturen,
trennt das Mycel ab und suspendiert dieses in 51 Wasser. Man gibt eine Lösung von
1,0 g Progesteron in 25 cm" Aceton zu und schüttelt bei 27°C. Nach 4 Tagen wird
die Suspension abfiltriert. Wie im Beispiel 9 beschrieben; wird das Filtrat extrahiert
und der Extraktionsrückstand chromatographiert. Man erhält 1,4-Pregnadien-17a;21-diol-3,11,20-trion
vom F. = 230 bis 233°C und 1,4-Pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion vom F. = 238
bis 240°C: Beispiel 13 120 em3 sterilisierte Bierwürze werden mit Trichothecium
roseum beimpft und 3 Tage bei 27°C geschüttelt. Dann gibt man eine Lösung von 40
mg 4-Pregnen-9,11ß-Oxido-21-acetoxy-3,20-dion in 1,5 em3 Aceton zu: Zu gleicher
Zeit werden 120 cm3 sterile Bierwürze mit Didymella lycopersici beimpft. Beide Kulturen
läßt man bei
27°C schütteln. Nach 3 Tagen werden sie vereinigt und
weitere 3 Tage bei 27°C geschüttelt. Dann trennt man das Mycel ab und schüttelt
das Kulturfiltrat dreimal mit je 50 cm3 Essigester aus. Die vereinigten Extrakte
werden mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Extraktionsrückstand
(42 mg) besteht gemäß papierchromatographischer Untersuchung zur Hauptsache aus
1,4-Pregnadien-9,llß-oxido-17a-21-diol-3,20-dion. Dieses wird mittels präparativer
Papierchromatographie (System Propylenglykol-Toluol) gereinigt und mit 4 cm3 Pyridin-Essigsäureanhydrid-Gemisch
in üblicher Weise acetyliert. Das so erhaltene Rohprodukt löst man in 5 cm3 Dioxan,
vermischt mit 1,25 cm' 2,5 n-Fluorwasserstoffsäure in Chloroform und läßt 1 Stunde
bei Raumtemperatur stehen. Dann gibt man Wasser zu und extrahiert mit Chloroform-Äther
(1: 3). Nach dem Waschen mit Wasser, Trocknen und Verdampfen der Lösungsmittel
im Vakuum erhält man das 1,4-Pregnadien-9a-fluoro-11ß,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat.
Es wird aus einem Aceton-Petroläther-Gemisch umkristallisiert. F. = 235 bis 237°C.
Beispiel 14 120 cm3 sterilisierte Bierwürze werden mit Trichothecium roseum beimpft
und 3 Tage bei 27°C geschüttelt. Dann gibt man eine Lösung von 40 mg 4-Pregnen-9afluor-11ß,21-diol-3,20-dion-21-acetat
in 1,5 cm3 Aceton zu. Zu gleicher Zeit werden 120 cm3 sterile Bierwürze mit Didymella
lycopersici beimpft. Beide Kulturen läßt man bei 27°C schütteln. Nach 3 Tagen werden
sie vereinigt und weitere 3 Tage bei 27°C geschüttelt. Dann trennt man das Mycel
ab und schüttelt das Kulturfiltrat dreimal mit je 50 cm3 Essigester aus. Die vereinigten
Extrakte werden mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der
Extraktionsrückstand (42 mg) besteht gemäß papierchromatographischer Untersuchung
zur Hauptsache aus 1,4-Pregnadien-9a-fluoro-11ß,17a,21-triol-3,20-dion. Dieses wird
mittels eines präparativen Papierchromatogramms im System Propylenglykol-Toluol
gereinigt. Das so erhaltene Rohprodukt wird im Hochvakuum bei 40°C getrocknet, in
2 cm3 Pyridin aufgenommen und mit 2 cm3 Essigsäureanhydrid versetzt. Nach 16stündigem
Stehen wird auf Eis gegossen. Das ausgefallene kristalline Produkt wird abfiltriert,
mit Wasser gewaschen, getrocknet und aus einem Aceton-Petroläther-Gemisch umkristallisiert.
Das so erhaltene 1,4-Pregnadien-9a-fluoro-1lß,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat schmilzt
bei 235 bis 237°C.