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Verfahren zur Herstellung von 11 a-Hydroxy-A-norprogesteron Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 11 x-Hydroxy-A-norprogesteron der Formel
bei dem A-Norprogesteron mit den Enzymen von Aspergillus nidulans in einem wäßrigen
Medium, das Stickstoffaktoren und eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff und
Energie enthält, in Gegenwart von Sauerstoff bebrütet und das gebildete 11cx-Hydroxy-A-norprogesteron
gewonnen wird.
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Es ist allgemein bekannt, daß Mikroorganismen zu vielfältigen Umsetzungen
bei Steroiden befähigt sind, wobei das Kennzeichnende dieser Umsetzungen ihre hohe
Spezifität ist. Stämme von Aspergillus nidulans sind bereits gemäß der deutschen
Auslegeschrift 1002348 zur Hydroxylierung von Steroiden der Pregnanreihe in der
11 -Stellung verwendet worden. Ob und in welcher Weise dieser Organismus aber auf
A-Norprogesteron einwirkt, war bisher noch nicht bekannt. Es war deshalb überraschend,
daß es durch die erfindungsgemäßen Maßnahmen unter Verwendung von Aspergillus nidulans
möglich ist, A-Norprogesteron in guter Ausbeute zum 11 a-Hydroxy-A-norprogesteron
umzuwandeln.
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Die Bedingungen zum Züchten von Mikroorganismen für die Zwecke der
vorliegenden Erfindung sind wie folgt: Die verfahrensgemäß eingesetzte Kultur von
Aspergillus nidulans wird aerob in Berührung mit einem geeigneten Gärungsmedium
gezüchtet. Ein geeignetes Medium besteht im wesentlichen aus einer Quelle für Stickstoffaktoren
und einer Quelle für Kohlenstoff und Energie. Die letztere kann ein Kohlenhydrat
(wie Rohrzucker, Melasse, Glucose, Maltose, Stärke oder Dextrin), eine höhere Fettsäure
und/oder das A-Norprogesteron selbst sein. Neben dem A-Norprogesteron enthält jedoch
das Medium vorzugsweise eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff und Energie.
Die Quellen für Stickstoffaktoren können organischen Ursprungs (wie Sojabohnenmehl,
Maisquellflüssigkeit, Fleischextrakt und/oder Destillationsrückstände) oder synthetischen
Ursprungs sein (die aus einfachen synthetisierbaren organischen und anorganischen
Verbindungen, wie Ammoniumsalzen, Alkalinitraten, Aminosäuren und Harnstoff bestehen
können).
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Während der Gärung sollte für eine angemessene Zuführung von steriler
Luft gesorgt werden, indem eine große Oberfläche des Mediums der Luft ausgesetzt
wird oder indem eine untergetauchte belüftete Kultur verwendet wird. Das A-Norprogesteron
kann der Kultur während der Bebrütungszeit oder dem Medium vor dem Sterilisieren
oder Animpfen zugesetzt werden.
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lla-Hydroxy-A-norprogesteron ist eine physiologisch wirksame Verbindung,
die antiöstrogene Wirksamkeit besitzt und daher zur Behandlung von Störungen des
Menstrualcyclus verwendet werden kann, wobei diese Verbindung für diesen Zweck systemisch
(z. B. subkutan) verabreicht werden und in gebräuchlichen injizierbaren flüssigen
Trägern verwendet werden kann. 11 ca-Hydroxy-A-norprogesteron ist ferner als Zwischenprodukt
zur Herstellung von 9x-Halogen-1 lß-hydroxy-A-norprogesteron brauchbar.
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Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung des erfindungsgemäßen
Verfahrens.
Beispiel 11 a-Hydroxy-A-norprogesteron (a) Gärung Zunächst
wird ein Medium der folgenden Zusammensetzung hergestellt: Maisquellflüssigkeit
............. 36 g Brauner Zucker ................ 10 g NaN03 ........................
6 g KH2P0........................ 1,5 g MgS04 - 7 H20 ................. 0,5
g ZnS04 (1°/oige wäßrige Lösung) . . 0,1 ccm CaC0......................... 5 g Schweineschmalz
............... 2 g Destilliertes Wasser ............. auf 1 1 Anteile
von je 50 ccm des Mediums werden in je fünf Erlenmeyerkolben mit einem Fassungsvermögen
von 250 ccm gebracht, worauf die Kolben mit Watte verstopft werden und der Inhalt
durch 40minütiges Erhitzen in einem Autoklav auf eine Temperatur von 120°C sterilisiert
wird: Nach dem Abkühlen wird jeder Kolben mit einer Öse voll eines wachsenden Weizenkornmediums
angeimpft, das Aspergillus nidulans enthält (A. T. C. C. 11267) und nach dem unten
angegebenen Verfahren hergestellt worden ist. Die Kolben werden 20 Stunden auf einer
Drehschüttelvorrichtung (280 Umdrehungen je Minute, Halbmesser etwa 5 cm) in einem
auf 25°C gehaltenen Raum mechanisch geschüttelt, worauf Übertragungen von 10 Volumprozent
auf 37 Erlenmeyerkolben mit einem Fassungsvermögen von 250 ccm (nach dem oben angegebenen
Verfahren sterilisiert) vorgenommen werden, von denen jeder 50 ccm des folgenden
Mediums enthält: Maisquellflüssigkeit ......:......... 6 g NH4H1P04 .......................
3 g CaC03 ........................... 2,5 g Sojabohnenöl ......................
2,2 g Destilliertes" Wasser ................ auf 1 1 30 Minuten unter einem
Druck von 1,05 Atm. mit Wasserdampf sterilisiert und mit Natriumhydroxydlösung auf
einen pH-Wert von 7,0 neutralisiert. Unmittelbar nach dem Animpfen werden jedem
dieser Kolben 0,25 ccm einer Lösung von A-Norprogesteron in N;N-Dimethylformamid
in einer Konzentration von 20 mg/ccm zugesetzt. Diese Kolben werden dann unter den
gleichen Bedingungen, die bereits bei der ersten Reihe der Kolben verwendet worden
sind, 24 Stunden bebrütet, worauf der Inhalt der Kolben vereinigt und durch ein
Seitz-Klärfilter unter Saugen abfiltriert wird.
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Die verwendete Impfkultur ist aus Stammkulturen von Aspergillus nidulans
(A. T. C. C. 11267) durch Züchten für eine Zeit zwischen einer Woche und 3 Monaten
in einem Medium mit der folgenden Zusammensetzung gewonnen worden: Weizen 10 g,
destilliertes Wasser 15 ccm. Für das Verfahren zur Gewinnung dieser Impfkultur wird
im Rahmen der vorliegenden Erfindung Schutz nicht begehrt. (b) Abtrennung von 11
ca-Hydroxy-A-norprogesteron Das in Stufe (a) erhaltene wäßrige Filtrat (l972 ccm)
wird viermal mit Anteilen von 250 ccm Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformauszüge
werden mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne
eingedampft, wobei etwa 197 mg eines Rückstands zurückbleiben. Der Rückstand wird
in Benzol gelöst und auf 7 g mit Säure gewaschener Tonerde chromatographiert. Beim
Auswaschen der Säule mit Benzol werden zunächst etwa 11 mg 6ß-Hydroxy-A-norprogesteron
mit einem Schmelzpunkt von etwa 217 bis 219°C erhalten. Beim weiteren Auswaschen
mit 50- bis 100°/oigem Chloroform-Benzol wird 1la-Hydroxy-A-norprogesteron erhalten.
Beim Umkristallisieren aus Äthylacetat-Hexan werden etwa 55 mg des Produkts mit
den folgenden Eigenschaften erhalten: Schmelzpunkt etwa 183 bis 184°C; [a]D = -f-93°
(Chloroform); ,1m xanol = 233 mp. (log a = 4;16); -Imäx°` = 2,90 #t, 2,97 5,88 fix,
6,05 #t, 6,18 p,.
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Zusammensetzung: C2aH2303 Berechnet . . . C 75,9 1, H 8,92;
gefunden ... C 75,8 1, H 8,92.