DE1027667B - Verfahren zur Herstellung polyoxigenierter Pregnane - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung polyoxigenierter Pregnane Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung polyoxigenierter Pregnane durch Einführung von Sauerstoff in verschiedene Stellungen des Moleküls auf biochemischem Wege.
• Es ist bereits bekannt, mit Hilfe von Mikroorganismen Sauerstoff in bestimmte Stellungen von Steroiden, insbesondere in 11-Stellung, einzuführen (vgl. zum Beispiel USA.-Patentschrift 2 602 769). In der deutschen Patentschrift 962 435 wurde ein Verfahren beschrieben, nach welchem es durch Verwendung bestimmter Pilze gelingt, Steroide in 17-Stellung zu oxigenieren. Gemäß der deutschen Patentanmeldung C 11424 IVb/12 o ist es ferner möglich, auf biochemischem Wege Sauerstoff in 21-Stellung von Steroiden einzuführen. Es ist auch bekannt, daß man mit Hilfe von Kulturen bestimmter Pilze Steroide gleichzeitig in verschiedenen Stellungen, z. B. in 6- und 11-Stellung, oxigenieren kann. Bis jetzt war es jedoch nicht möglich, in einem Arbeitsgang auf biochemischem Wege Sauerstoff in wenigstens zwei der wichtigen Stellungen 11, 17 und 21 einzuführen. Ein solches Verfahren wäre offensichtlich von großer technischer Bedeutung.
• Es wurde nun gefunden, daß man in einfacher Weise polyoxigenierte Steroide der Pregnanreihe herstellen kann, wenn man auf Pregnane, die in wenigstens zwei der Stellungen 11, 17 und 21 nicht oxigeniert sind, in einem Arbeitsgang Enzyme aus aeroben Kulturen von wenigstens zwei der folgenden drei Gruppen a) bis c) angehörenden Pilzstämme einwirken läßt, von denen je einer Sauerstoff in 11-, in 17- bzw. in 21-Stellung einzuführen vermag, wobei den Gruppen a) bis c) die folgenden Pilzstämme zugehören: a) Pilze der Ordnung Mucorales sowie der Gattungen Curvularia, Aspergillus und Streptomyces; b) Pilze der Gattungen Trichothecium, Leptosphaeria, Cucurbitaria, Acrospeira, Lophotrichus, Melanospora und Thielavia; c) Pilze der Gattungen Ophiobolus und Sclerotinia.
• Die Ausgangsstoffe für das neue Verfahren sind Verbindungen der Pregnanreihe, worunter gesättigte und ungesättigte, beliebig konfigurierte Derivate des 10,13-Dimethyl -17 - äthyl - cyclopentano - p olyhydrophenanthrens sowie seiner höheren und niederen Homologen, beispielsweise entsprechende A-Nor-, D-Homo- und 19-Nor-verbindungen. verstanden sind. Doppelbindungen befinden sich z. B. in 1-, 4-, 5-, 6-, 7-, 9-, 11-, 14-, 15- und/oder 16-Stellung. Die Konfiguration der Ausgangsstoffe (ist insbesondere diejenige des Pregnans, 5a-Pregnans, 17a-Pregnans oder entsprechender Racemate, wie sie bei der Totalsynthese erhalten werden. Als solche Ausgangsstoffe verwendet man vor allem in 3- und 20-Stellung und gegebenenfalls in 18-Stellung und/oder in einer der Stellungen 11, 17 und 21 oxigenierte Verbindungen und ihre funktionellen Derivate, also Pregnane, die in den genannten Stellungen eine freie oder funktionell abgewandelte Oxo-oder Oxygruppe aufweisen, wie z. B. Ester, Äther, Thioäther, Thiol- oder Thionester, Acetale, Mercaptale, Ketale, Enolderivate, wie Enolester oder Enamine, Hydrazone, Semicarbazone u: dgl. Sie können auch weitersubstituiert sein, nämlich z. B. durch freie bzw. funktionell abgewandelte Oxy- oder Oxogruppen, beispielsweise in 1-, 2-, 6-, 7-, 12-, 15-, 16- oder 19-Stellung und insbesondere durch Halogenatome, wie Chlor oder Fluor in 9-Stellung. Spezifische Ausgangsstoffe sind unter anderem Progesteron, 17a-Progesteron, 16a-Oxy-, 17a-Oxy- oder 18-Oxy-progesteron, Cortexon, 11-Ketoprogesteron, 11a- sowie 11 ß-Oxy-progesteron, 9,11- oder 11,12-Dehydro-progesteron, 19-Oxy-progesteron, 9-CWor-oder 9-Fluor-llß-oxy-progesteron, 11ß,18-Dioxy-progesteron, 11 ß-Oxy-18-oxo-progesteron, 9-Chlor- oder 9-Fluor-11 ß-oxy-18-progesteron,11,18-Dioxo-progesteron, 19-Nor-progesteron, 19-Nor-llß-oxy-18-oxo-progesteron, Pregnenolon, die entsprechenden 1-Dehydroverbindungen, z. B. 1-Dehydroprogesteron, 1-Dehydro-17a-oxy-progesteron, 1-Dehydro-11-keto-, -11a- oder -11 ß-oxy-progesteron, oder ihre funktionellen Derivate.
• Die verwendeten Enzyme für die Oxydation in 11-Stellung werden vorzugsweise von aeroben Kulturen von Pilzen der Ordnung Mucorales, z. B. der Gattungen Mucor, Rhizopus oder Cuninghamella, und der Aspergillus, Curvularia oder Streptomyces produziert. Man benutzt besonders aktive Stämme von Rhizopus nigricans, Rhizopus arrhizus, Cuninghamella blakesleeana, Streptomyces fradiae, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Curvularia falcata, Curvularia brachyspora, Curvularia lunata oder Curvularia nallescens. Für die Oxvdation in 17-Stellung eignen sich Enzyme aus aeroben Kulturen von Pilzen der Gattungen Trichothecium (Acrothecium), Leptosphaeria, Cucurbitaria, Acrospeira, Lophotricus, Melanospora und Thielavia, insbesondere aktive Stämme von Trichothecium roseum, Leptosphaeria maculans, Cucurbitaria laburni, Acrospeira levis, Lophotrichus hartinii, Melanospora parasiticä und Thielavia terricola. Die Enzyme für die Oxydation in 21-Stellung werden vorteilhaft mit Hilfe aerober Kulturen von Pilzen der Gattungen Ophiobolus oder Sclerotinia erhalten, insbesondere durch aktive Stämme von Ophiobolus herpotrichus und Sclerotinia fructicola. Dabei kann man mit isolierten oder angereicherten Enzympräparaten, insbesondere aber mit rohen wachsenden Pilzkulturen oder deren Filtraten, arbeiten.
• Die zur Züchtung dieser Pilze verwendeten Kulturlösungen werden zweckmäßig bewegt, d. h. geschüttelt oder gerührt, und enthalten assimilierbaren Kohlenstoff, insbesondere Kohlenhydrate, sowie gegebenenfalls Wuchs. stoffe, beispielsweise Maisquellwasser oder Bierwürze, und anorganische Salze. Es sind somit natürliche, synthetische oder halbsynthetische Nährlösungen brauchbar. Man verwendet zweckmäßig solche Nährlösungen, die allen verwendeten Pilzen optimale Wachstumsbedingungen bieten. Es ist auch möglich, später für den zweiten bzw. dritten Pilz speziell geeignete Nähr- und Wachsstoffe zuzusetzen.
• Das Verfahren wird in einem Arbeitsgang durchgeführt. Es hat sich aber als vorteilhaft erwiesen, die Oxigenierungen an den genannten Stellungen zeitlich nacheinander vorzunehmen. Das praktisch einfachste Verfahren ist im folgenden geschildert, ohne daß die Erfindung durch diese Angaben beschränkt sein soll: Man züchtet den für die erste Oxigenierang benötigten Organismus in Apparaturen und unter ähnlichen Bedingungen, wie sie bei der Antibiotikafabrikation als sogenannte Tieftankverfahren bekannt sind. Nach Entwicklung der Kulturen gibt man die genannten Ausgangsstoffe in feiner Dispersion oder Lösung, beispielsweise in Methanol, Aceton oder Äthylenglykol zu und inkubiert weiter, bis die maximale Oxigenierung erreicht ist. Dann gibt man, ohne vorher zu filtrieren oder das Oxydationsprodukt zu isolieren, zum Reaktionsgemisch eine ausgewachsene Kultur des zweiten Organismus und nötigenfalls entsprechende Nährsubstanzen und Wachsstoffe zu und fährt mit der Inkubation fort. Gegebenenfalls wird diese Operation mit einem dritten Mikroorganismus wiederholt. Der Verlauf der einzelnen Oxigenierungen kann papierchromatographisch verfolgt werden. Schließlich trennt man vom Mycel ab, extrahiert das Filtrat und/oder die Mycelmasse und isoliert aus dem Extrakt die Reaktionsprodukte in an sich bekannter Weise, z. B. durch Entmischungsverfahxen, Adsorption,- Chromatographie, ' Kristallisation, Überführung in funktionelle Derivate, wie Girardverbindungen u. dgl.
• Die Pilzkulturen bzw. Enzyme können in beliebiger Reihenfolge zugegeben werden. Im übrigen läßt sich durch Vorversuche leicht feststellen, welche Reihenfolge gegebenenfalls Vorteile bietet.
• Der Vorzug des .vorliegenden Verfahrens ist darin zu erblicken, daß die bisher nicht durchgeführte - und auch nicht für ohne weiteres möglich gehaltene - gleichzeitige bzw. sukzessive Oxigenierung von zwei oder drei der wichtigen Stellungen 11, 17 und 21 durch verschiedene Organismen in einem Arbeitsgang gelungen ist. Das Verfahren ist insofern besonders einfach, als man die in erster Stufe erhaltenen Oxigenierungsprodukte nicht von der Pilzkultur bzw. deren enzymhaltigen Nährlösungen abtrennen maß, sondern die zweite bzw. dritte Oxydationsstufe direkt im gleichen Medium ausführen kann. Mit der Ersparung der Abtrennung ist ohne weiteres auch eine Erhöhung der Ausbeute unter sonst gleichen Bedingungen verbunden.
• Die Verfahrensprodukte können als Heilmittel Verwendung finden oder als Zwischenprodukte zu ihrer Herstellung dienen. Von größtem praktischem Interesse sind z. B. Cortison, Hydrocortison, Reichsteins Substanz S; 1-Dehydro-cortison, 1-Dehydro-hydrocortison, Aldosteron und Corticosteron.
• Das erfindungsgemäße Verfahren wird in den folgenden Beispielen erläutert.
• Beispiel 1 In einem Erlenmeyerkolben von 500 cm3 Fassangsvermögen werden 50 cm3 Bierwürze sterilisiert und mit Ophiobolus herpotrichus beimpft. Die Kultur wird bei 27° C geschüttelt. Nach 3 Tagen hat sie sich gut entwickelt, und man gibt dazu unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 15 mg Progesteron in 0,75 cm3 Aceton. Zur gleichen Zeit werden in einem zweiten Erlenmeyerkolben 50 cm3 Bierwürze sterilisiert und mit einem Stamm Curvularia brachyspora beimpft. Beide Kulturen werden nun in gleicher Weise bei 27°C geschüttelt. Nach 3 Tagen wird die ausgewachsene Curvulariakultur unter sterilen Bedingungen zur Ophioboluskultur gegeben. Die vereinigten Kulturen werden weitergeschüttelt. Nach 3 Tagen trennt man das Mycel ab und schüttelt das Kulturfiltrat dreimal mit j e 30 cm3 Essigester aus. Die Extrakte werden mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Die papierchromatische Untersuchung des Rückstandes zeigt die Anwesenheit von llß,21-Dioxy-progesteron (Corticosteron).
• Ersetzt man bei obigem Verfahren das Progesteron durch 18-Oxo-progesteron, so wird Aldosteron erhalten., Beispiel 2 Wie im Beispiel 1 beschrieben, wird zu einer Kultur von Ophiobolus herpotrichus in 50 cm3 Bierwürze eine Lösung von 15 mg Progesteron in 0,75 cm3 Aceton gegeben. Zu gleicher Zeit werden in einem zweiten Erlenmeyerkolben 50 cm3 sterilisierte Bierwürze mit Trichothecium roseum beimpft. Beide Kulturen werden nun bei 27° C geschüttelt. Nach 3 Tagen werden sie unter Vermeidung von Infektionen vereinigt, und das Gemisch wird weitere 3 Tage bei der gleichen Temperatur geschüttelt. Dann trennt man das Mycel ab und extrahiert das Kulturfiltrat, wie im Beispiel 1 beschrieben. Der Extraktionsrückstand enthält gemäß papierchromatographischer Auswertung 17a,21-Dioxy-progesteron (Reichsteins Substanz S).
• Beispiel 3 Ersetzt man im Beispiel2 das Progesteron durch 11-Keto-progesteron und inkubiert man in der beschriebenen Weise mit Kulturen von Ophiobolus herpotrichus und Trichothecium roseum, so können im Extraktionsrückstand erhebliche Mengen 11-Keto-17a,21-dioxyprogesteron (Cortison) nachgewiesen werden.
• Beispiel 4 Ersetzt man im Beispiel 2 das Progesteron durch 11ß-Oxy-progesteron und- inkubiert man auf gleiche Weise mit Kulturen von Ophiobolus herpotrichus und Trichothecium roseum, so können im Extraktionsrückstand erhebliche Mengen 11ß,17a,21-Trioxy-progesteron (Hydrocortison) nachgewiesen werden.
• Beispiel 5 Wie im Beispiel 1 beschrieben, gibt man zu einer Kultur von Ophiobolus herpotrichus in 50 cm3 Bierwürze unter, sterilen Bedingungen eine Lösung von 15 mg Progesteron: in 0,75 cm3 Aceton. Zu gleicher Zeit werden in einem zweiten Erlenmeyerkolben 50 cm3 sterile Bierwürze mit Trichothecium roseum beimpft. Beide Kulturen werden bei 27° C geschüttelt und nach 3 Tagen vereinigt. Gleichzeitig beimpft man in einem dritten Erlenmeyerkolben 50 cm3 sterile Bierwürze mit -Rhizopus nigricans. Diese Kultur und das genannte Kulturgemisch werden 3 Tage bei 27° C geschüttelt, wobei sich die Rhizopuskultur gut entwickelt. Sie wird dann unter sterilen Bedingungen mit dem Kulturgemisch vereinigt. Man läßt weitere 3 Tage bei 27°'C schütteln und trennt dann das Mycel ab. Das Kulturfiltrat wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, extrahiert. Die papierchromatographische Untersuchung des Extraktionsrückstandes zeigt die Anwesenheit erheblicher Mengen von 1l a,17a,21-Trioxy-progesteron. Beispiel 6 Man verfährt in gleicher Weise, wie im Beispie15 beschrieben, mit der einzigen Ausnahme, daß man an Stelle der Kultur von Rhizopus nigricans eine solche von Cunninghamella blakesleena in 50 cm3 Bierwürze zum Kulturgemisch von Ophiobolus herpotrichus und Trichothecium roseum zugibt. Nach analoger Inkubation und Extraktion gewinnt man einen Extraktionsrückstand, der 11ß,17a,21-Trioxy-progesteron (Hydrocortison) und 11-Keto-17a,21-Dioxy-progesteron (Cortison) enthält. Beispiel 7 Variiert man im Beispiel 6 die Reihenfolge der Zugabe der genannten Kulturen, indem man das Progesteron zuerst mit einer Kultur von Cunninghamella blakesleena inkubiert und dann zuerst in der beschriebenen Weise eine Kultur von Ophiobolus herpotrichus und später eine solche von Trichothecium roseum zugibt, so enthält der in der üblichen Weise erhaltene Extraktionsrückstand ebenfalls 11ß,17a,21-Trioxy-progesteron (Hydrocortison) und 11-Keto-17a,21-dioxy-progesteron (Cortison). Beispiel 8 50 cm3 sterile Bierwürze werden mit Cunninghamella blakesleena beimpft. Die Kultur wird 2 Tage bei 27° C geschüttelt und dann unter sterilen Bedingungen mit einer Lösung von 15 mg 11-Desoxy-corticosteron (Cortexon) in 0,75 ml Aceton versetzt. Gleichzeitig beimpft man in einem zweiten Erlenmeyerkolben 50 cm3 sterile Bierwürze mit Trichothecium roseum. Beide Kulturen werden weitere 2 Tage bei der gleichen Temperatur geschüttelt und dann unter sterilen Bedingungen vereinigt. Man schüttelt das Gemisch weiter und trennt das Mycel nach 2 Tagen ab. Die Extraktion des Kulturfiltrates geschieht in gleicher Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben. Der Extraktionsrückstand enthält größere Mengen 11ß,17a,21-Trioxy-progesteron (Hydrocortison) neben 11-Keto-17a,21-dioxy-progesteron (Cortison). Beispiel 9 50 cm3 sterile Bierwürze werden in einem Erlenmeyerkolben mit Curvularia lunata beimpft und 2 Tage bei 27° C geschüttelt. Dann gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 15 mg Cortexon (11-Desoxycorticosteron) in 0,5 cm3 Aceton zu. Gleichzeitig beimpft man in einem zweiten Erlenmeyerkolben 50 cm3 sterile Bierwürze mit Leptosphaeria maculaus. Beide Kulturen werden 24 Stunden bei der gleichen Temperatur geschüttelt und dann unter sterilen Bedingungen vereinigt. Man läßt das Gemisch weitere 2 Tage schütteln und trennt dann das Mycel ab. Das Kulturfiltrat wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, mit Essigester extrahiert. Der Extraktionsrückstand enthält neben Cortison größere Mengen Hydrocortison.
• Beispiel 10 Gibt man im obigen Beispiel an Stelle der Lösung von Cortexon eine solche von 15 mg 1-Dehydro-cortexon in 0,5 cm3 Aceton zu und inkubiert man in gleicher Weise mit Kulturen von Curvularia lunata und Leptosphaeria maculaus, so enthält der Extraktionsrückstand neben 1-Dehydro-cortison größere Mengen 1-Dehydro-hydrocortison.
• Beispiel 11 In einem Schüttelgefäß von 181 Fassungsvermögen werden 3,61 Bierwürze sterilisiert und mit 400 cm3 einer 2 Tage alten, auf Bierwürze gewachsenen Schüttelkultur von Ophiobolus herpotrichus beimpft. Es wird 2 Tage lang bei 27° C geschüttelt, wobei sich die Kultur gut entwickelt. Dann gibt man eine Lösung von 1,0 g Progesteron in 25 cm3 Aceton unter sterilen Bedingungen zu. Gleichzeitig beimpft man in einem zweiten Schüttelgefäß 3,61 sterile Bierwürze mit 400 cm3 einer 3 Tage alten, ebenfalls auf Bierwürze gezüchteten Schüttelkultur von Trichothecium roseum. Die beiden Gefäße werden bei 27° C 3 Tage geschüttelt. Die nun ausgewachsene Trichotheciumkultur wird unter sterilen Bedingungen in das 18-1-Gefäß übergeführt, und zur gleichen Zeit beimpft man in einem weiteren Schüttelgefäß 3,61 sterile Bierwürze mit 400 cm3 einer 24 Stunden alten, auf Bierwürze gewachsenen Schüttelkultur von Cunninghamella blakesleena. Man läßt dieses Schüttelgefäß sowie dasjenige, das das soeben beschriebene Kulturgemisch enthält, 3 Tage bei 27° C schütteln und vereinigt deren Inhalt dann unter sterilen Bedingungen, worauf nochmals 2 Tage bei der angegebenen Temperatur geschüttelt wird. Dann wird das Mycel abgetrennt. Man schüttelt das Kulturfiltrat viermal mit j e 31 Essigester aus. Die Extrakte werden dreimal mit j e 500 cm3 Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Man löst den erhaltenen Rückstand (1,1 g) in 160 cm3 Methanol, gibt 40 cm3 Wasser zu und schüttelt dreimal mit je 50 cm3 Pentan aus. Die Petanextrakte enthalten nur ölige Verunreinigungen, während die Steroide in der methanolischen Lösung bleiben. Diese wird im Vakuum bei 30° C eingedampft und im Hochvakuum getrocknet. Man chromatographiert den Rückstand an 30 g Kieselsäure nach der Durchlaufmethode, wobei man zuerst mit Methylenchlorid, dann mit Chloroform und mit Chloroform-Aceton-Gemischen und schließlich mit Aceton eluiert. Die einzelnen Fraktionen (150 cm3) werden papierchromatographisch untersucht. Die mit Methylenchlorid und mit Chloroform eluierten Fraktionen enthalten Verunreinigungen, etwas Ausgangsmaterial und 11-Desoxycorticosteron, während in den Gemischen von Chloroform und Aceton (9:1 und 8:2) 11-Keto-17a,21-dioxyprogesteron (Cortison) anwesend ist. Die betreffenden Fraktionen werden eingedampft, und man erhält das Cortison nach Umkristallisieren aus einem Aceton-Isopropyläther-Gemisch in Kristallen vom F. = 208 bis 216° C. Die Chloroform-Aceton-(1: 1)-Fraktionen enthalten 11ß,17a,21-Trioxy-progesteron (Hydrocortison), das aus Äther kristallisiert; F. = 204 bis 210° C.
• Beispiel 12 Ersetzt man im Beispiel 2 das Progesteron durch 1-Dehydro-11-keto-progesteron und inkubiert man auf gleiche Weise mit Kulturen von Ophiobolus herpotrichus und Trichothecium roseum, so können im Extraktionsrückstand erhebliche Mengen 1-Dehydro-cortison nachgewiesen werden.
• Beispiel 13 Ersetzt man im Beispiel 2 das Progesteron durch 1-Dehydro-11 ß-oxy-progesteron und inkubiert man auf gleiche Weise mit Kulturen von Ophiobolus herpotrichus und Trichothecium roseum, so können im Extraktionsrückstand erhebliche Mengen 1-Dehydro-hydrocortison nachgewiesen werden. -Beispiel 14 Ersetzt man im Beispiel 6 das Progesteron durch 1-Dehydro-progesteron und inkubiert man auf gleiche Weise mit Kulturen von Ophiobolus herpotrichus, Trichothecium roseum und Cunningharnella blakesleena, so- können im Extraktionsrückstand erhebliche Mengen 1-Dehydrohydrocortison neben 1-Dehydro-cortison nachgewiesen werden. Beispiel 15 Je 50 cm3 sterile Bierwürze in zwei Erlenmeyerkolben von 500 cm3 Fassungsvermögen werden mit Ophiobolus herpotrichus bzw: Curvularia lunata beimpft und 3 Tage bei 27° C geschüttelt. Die beiden Kulturen werden dann unter sterilen Bedingungen vereinigt und mit einer Lösung von 15 mg Progesteron in 0,75 em3 Aceton versetzt. Man schüttelt das Gemisch weiter bei 27° C. Nach 3 Tagen trennt man die Mycelien ab und extrahiert das Kulturfiltrat, wie irn Beispiel 1 beschrieben. Die papierchromatographische Prüfung des Extraktionsrückstandes zeigt, daß er 11ß,21-dioxy-progesteron (Corticosteron) enthält. Beispiel 16 Drei Portionen von je 50 cm3 Bierwürze, je in einem Erlenmeyerkolben von 500 cm3 Fassungsvermögen, werden sterilisiert. Die erste wird mit Ophiobolus herpotrichus, die zweite mit Trichothecium roseum und die dritte mit Cunninghamella blakesleena beimpft. Die Kulturen werden bei 27° C geschüttelt. Nach 3 Tagen haben sie sich gut entwickelt und werden dann unter sterilen Bedingungen vereinigt. Zu dem Gemisch gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 15 mg Progesteron in 0,75 cm" Aceton und schüttelt weiter bei 27° C. Nach 3 Tagen trennt man die Mycelien ab und extrahiert das Kulturfiltrat, wie im Beispiel 1 beschrieben. Die chromatographische Prüfung des Extraktionsrückstandes zeigt, daß er 11ß,17a,21-trioxy-progesteron (Hydrocortison) und 11-Keto-17a,21-dioxy-progesteron (Cortison) enthält.

Claims (5)

1. PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Herstellung polyoxigenierter Pregnane durch biologische Oxydation mit selektiv wirkenden Pilzkulturen unter submersen und aeroben Bedingungen oder den durch diese erzeugten oxydierend wirkenden Enzymen, dadurch gekennzeichnet, daß man auf Pregnane, die in wenigstens zwei der Stellungen 11, 17 und 21 nicht oxigeniert sind, in einem Arbeitsgang Enzyme aus aeroben Kulturen von wenigstens zwei der folgenden drei Gruppen a) bis c) angehörenden Pilzstämmen einwirken läßt, von denen je einer Sauerstoff in 11-, in 17- bzw. in 21-Stellung einzuführen vermag, wobei den Gruppen a) bis c) die folgenden Pilzstämme zugehören: a) Pilze der Ordnung Mucorales sowie der Gattungen Curvularia; Aspergillus und Streptomyces; b) Pilze der Gattungen Trichothecium, Leptosphaeria, Cucurbitaria, Acrospeira, Lophotrichus, Melanospora und Thielavia; c) Pilze der Gattungen Ophiobolus und Selerotinia.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Oxigenierung in 17-Stellung Enzyme aus aeroben Kulturen aktiver Stämme von Trichothecium roseum, Leptosphaeria maculans, Cucurbitaria laburni, Acrospeira levis, Lophotrichus hartinii, Melanospora parasitica oder Thielavia terricola verwendet.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Oxigenierung in 21-Stellung Enzyme aus aeroben Kulturen der Gattungen Ophiobolus oder Sclerotinia, insbesondere Ophiobolus herpotrichus oder Sclerotinia fructicola, verwendet.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die entsprechenden Enzyme nacheinander einwirken läßt.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Progesteron, 11-Keto-progesteron, 11 a-Oxy-progesteron, 11-Desoxycorticosteron, d1,4 Pregnadienverbindungen, insbesondere d4,4-3,20-Dioxo-pregnadien, d1,4-3,11,20-Trioxopregnadien oder di,4-3,20-Dioxo-llß-oxy-pregnadien als Ausgangsstoffe verwendet.