Verfahren zur d 1-Dehydrierung von Steroiden Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues mikrobiologisches Verfahren zur Einführung einer Doppelbindung zwischen den C-Atomen 1 und 2 des Steroidkerns vermittels Mikroorganismen der Gattung Nocardia. Gemäss einer bevorzugten Aus führungsform der Erfindung werden 44-3-Keto- steroide wie J4-Pregnen-3,11,20-trion-17a,21-diol oder J4-Pregnen-3,20-dion-11f,17a,21-triol, in die entsprechenden dl#4-3-Keto-steroide, wie 41,4-Preg- nadien-3,11,
20-trion-17a,21-diol bzw. dl>4-Preg- nadien-3,20-dion-llss,17a,21-triol, umgewandelt. Die letzteren Verbindungen besitzen Cortisonwirksamkeit, unterscheiden sich jedoch von Cortison darin, dass sie von unerwünschten Nebenwirkungen, wie Oedembil- dung, frei sind, da sie keine merkliche Natrium- oder Wasserretentionswirkung besitzen.
Die Herstellung von dl,4-3-Keto-steroiden durch chemische Methoden erwies sich als unbefriedigend wegen dem Umstand, dass bei den zur Anwendung gelangenden chemischen Reaktionen Gemische von verschiedenen Verbindungen entstehen. Die Abtren nung der gewünschten Zwischen- und Endprodukte aus solchen Mischungen ist kostspielig und führt nur zu geringen Ausbeuten an den gewünschten 41.4-3- Keto-steroiden.
Zweck der vorliegenden Erfindung war die Schaf fung eines einstufigen Verfahrens zur Einführung einer dl-Doppelbindung in Steroide, welches Ver fahren selektiv arbeiten und zur Bildung eines ge wünschten Jl-Steroids führen sollte, welches nicht durch unerwünschte Nebenprodukte verunreinigt war. Ferner war Zweck der Erfindung die Schaffung eines Verfahrens, auf Grund dessen J4-3-Keto-pregnene direkt und in hoher Ausbeute in die entsprechenden \il,4-3-Keto-pregnadiene übergeführt werden können.
Es war weiterhin Zweck der Erfindung, die Herstel lung von Al.4-3-Keto-steroiden der Pregnanreihe di- rekt und in hoher Ausbeute aus den entsprechenden 3-Keto-pregnanen und 3-Oxy-pregnanen zu ermög lichen.
Es. wurde nun gefunden, dass die selektive dl-Dehydrierung von Steroiden durchgeführt werden kann auf Grund eines neuen mikrobiologischen De hydrierungsverfahrens, welches dadurch gekennzeich net ist, dass man die Steroide, insbesondere ein C-5 ungesättigtes 3-oxydiertes Steroid, der dehydrieren den Wirkung von Enzymen von Mikroorganismen der Gattung Nocardia aussetzt, vorzugsweise von Mikroorganismen, die den Arten Nocardia black- wellii, Nocardia asteroides,
Nocardia minima, No- cardia globerula, Nocardia leishmanii, Nocardia for- mica, Nocardia convoluta und Nocardia corallina angehören.
Diese Nocardia-Mikroorganismen können bei den bekannten Bezugsquellen bezogen werden, beispielsweise bei der American Type Culture Collec- tion , Washington, D. C., oder sie können nach be kannten Methoden aus natürlichen Vorkommen iso liert werden, beispielsweise aus Erde oder aus kranken Organismen.
Die Dehydrierung kann durchgeführt werden durch Zusammenbringen des Steroids, mit den No- cardia-Mikroorganismen selbst, oder, wenn erwünscht, mit den von Nocardia-Mikroorganismen erzeugten Enzymsystemen, wobei an den C-Atomen 1 und 2 gebundener Wasserstoff selektiv entfernt wird unter Bildung des gewünschten dl-Steroids, welches von unerwünschten Nebenprodukten vollkommen frei ist. Wenn man ein 44-3-Keto-pregnen erfindungsgemäss dehydriert, erhält man direkt und in hoher Ausbeute das entsprechende 41,4-Pregnadien.
Diese neue mikrobiologische Dehydrierungs- methode ist z. B. anwendbar für die dl-Dehydrierung von 3-Keto-steroiden, unabhängig von Substituenten und vom Grad der Ungesättigtheit in den Ringen B, C und D;
doch verwendet man vorzugsweise als Aus gangsmaterialien für dieses Verfahren C-5-unge- sättigte 3-oxydierte Steroide der Pregnanreihe, bei spielsweise 44-3-Keto-pregnene, wie J4-Pregnen-3,20-dion, J4-Pregnen-3,20-dion-17a-01, J4-Pregnen-3,20-dion-21-ol, 44-Pregnen-3,20-dion-21-ol-21-acylat, 14-Pregnen-3,20-dion-21-ol-21-acetat, Al-Pregnen-3,20-dion-17a,21-diol, 44-Pregnen-3,20-dion-17,21-diol-21-acylat, J4-Pregnen-3,
20-dion-17a,21-diol-21-acetat, J4-Pregnen-3,20-dion-17a-ol-21-al, J4-Pregnen-3,11,20-trion, J4-Pregnen-3,11,20-trion-17a-01, J4-Pregnen-3,11,20-trion-21-ol, J4-Pregnen-3,11,20-trion-21-ol-21-acylat, J4-Pregnen-3,11,20-trion-21-ol-21-acetat, J4-Pregnen-3,11,20-trion-17a,21-diol, J4-Pregnen-3,11,20-trion-17,21-diol-21-acylat, d4-Pregnen-3,11,20-trion-17a,21-diol-21-acetat, J4-Pregnen-3,11,20-trion-17a-o1-21-al, J4-Pregnen-3,20-dion-11 ss-ol,
44-Pregnen-3,20-dion-11ss,21-diol, J4-Pregnen-3,20-dion-11,21-diol-21-acylat, J4-Pregnen-3,20-dion-1 lss,21-diol-21-acetat, 44-Pregnen-3,20-dion-1 lss-ol-21-al, J4-Pregnen-3,20-dion-11 ss,17a-diol, J4-Pregnen-3,20-dion-11 ss,17a,21-triol, J4-Pregnen-3,20-dion-11,17,21-triol-21-acylat, J4-Pregnen-3,20-dion-1 lss,17a-diol-21-al, J4-Pregnen-3,
20-dion-11 ss,17a,21-triol-21-acetat; 9-Halogenderivate dieser J4-3-Keto-pregnene, wie 9-Halogen-J4-pregnen-3,20-dion-17,21-diol, 9-Fluor-44-pregnen-3,20-dion-17a,21-diol, 9 Halogen-44-pregnen-3,20-dion-17,21-diol- 21-acylat, 9-Fluor-J4-pregnen-3,20-dion-17a,21-diol- 21-acetat, 9-Halogen-44-pregnen-3,11,20-trion-17,21-diol, 9-Fluor-44-pregnen-3,11,20-trion-17a,21-diol, 9-Halogen-J4-pregnen-3,11,20-trion-17,
21-diol- 21-acylat, 9-Fluor-J4-pregnen-3,11,20-trion-17a,21-diol- 21-acetat, 9-Halogen-A4-pregnen-3,20-dion-11,17,21-triol, 9-Fluor-J4-pregnen-3,20-dion-1 lss,17a,21-triol, 9-Halogen-44-pregnen-3,20-dion-11,17,21-triol- 21-acylat, 9-Fluor-44-pregnen-3,20-dion-1 lss,17a,21-triol- 21-acetat usw.
Anstelle der J4-3-Keto-pregnene können als Aus gangsmaterialien andere C-5-ungesättigte 3-oxydierte Steroide verwendet werden, beispielsweise J5-3-Oxy- pregnene, wie d5-Pregnen-20-on-3-ol, J5-Pregnen-20-on-3,17a-diol, J5-Pregnen-20-on-3,21-diol, 45-Pregnen-20-on-3,21-diol-21-acylat, J5-Pregnen-20-on-3,21-diol-21-acetat, 45-Pregnen-20-on-3,17a,21-triol, J5-Pregnen-20-on-3,17,21-triol-21-acylat, J5-Pregnen-20-on-3,17a,
21-triol-21-acetat, J5-Pregnen-11,20-dion-3-ol, J5-Pregnen-11,20-dion-3,17a-diol, J5-Pregnen-11,20-dion-3,21-diol, J5-Pregnen-11,20-dion-3,21-diol-21-acylat, d5-Pregnen-11,20-dion-3,21-diol-21-acetat, 45-Pregnen-11,20-dion-3,17a,21-triol, J5-Pregnen-11,20-dion-3,17,21-triol-21-acylat, J5-Pregnen-11,20-dion-3,17a,21-triol-21-acetat, 45-Pregnen-20-on-3,11 ss-diol, J5-Pregnen-20-on-3,11 /3,21-triol,
J5-Pregnen-20-on-3,11,21-triol-21-acylat, J5-Pregnen-20-on-3,11 ss,21-triol-21-acetat, 45-Pregnen-20-on-3,1 l ss,17a-triol, J5-Pregnen-20-on-3,11 ss,17a,21-tetrol, J5-Pregnen-20-on-3,11,17,21-tetrol-21-acylat, 45-Pregnen-20-on-3,1 1f,17a,21-tetrol-21-acetat;
9-Halogenderivate dieser J5-3-Oxy-pregnene, wie 9-Halogen-J5-pregnen-20-on-3,17,21-triol, 9-Fluor-J5-pregnen-20-on-3,17a,21-triol, 9-Halogen-45-pregnen-20-on-3,17,21-triol- 21-acylat, 9-Fluor-J5-pregnen-20-on-3,17a,21-triol- 21-acetat, 9-Halogen-J5-pregnen-11,20-dion-3,17,21-triol, 9-Fluor-d5-pregnen-11 ss,20-dion-3,17a,21-triol, 9-Halogen-J5-pregnen-11,20-dion-3,17,21-triol- 21-acylat,
9-Fluor-d5-pregnen-11ss,20-dion-3,17a,21-triol- 21-acetat, 9-Halogen-J5-pregnen-20-on-3,11,17,21-tetrol, 9-Fluor-J5-pregnen-20-on-3,11 ss,17a,21-tetrol, 9-Halogen-45-pregnen-20-on-3,11,17,21-tetrol- 21-acylat, 9-Fluor-d5-pregnen-20-on-3,11 ss,17a,21-tetrol- 21-acetat;
und J5-3-(niedrige Alkanoyloxy)-pregnene, wie J5-Pregnen-20-on-3-ol-3-(niedriges Alkanoat), J5-Pregnen-20-on-3-ol-3-acetat, J5-Pregnen-20-on-3,17-diol-3- (niedriges Alkanoat), J5-Pregnen-20-on-3,17a-diol-3-acetat, J5-Pregnen-20-on-3,21-diol-3- (niedriges Alkanoat), J5-Pregnen-20-on-3,21-diol-3-acetat, J5-Pregnen-20-on-3,21-diol-3,
21-bis- (niedriges Alkanoat), J5-Pregnen-20-on-3,21-diol-3,21-diacetat, J5-Pregnen-20-on-3,17,21-triol-3- (niedriges Alkanoat), d5-Pregnen-20-on-3,17a,21-triol-3-acetat, J5-Pregnen-20-on-3,17,21-triol-3,21-bis- (niedriges Alkanoat), J5-Pregnen-20-on-3,17a,21-triol-3,21-diacetat, J5-Pregnen-11,20-dion-3-ol-3- (niedriges Alkanoat), J5-Pregnen-11,
20-dion-3-ol-3-acetat, J5-Pregnen-11,20-dion-3,17-diol-3- (niedriges Alkanoat), Ji,-Pregnen-11,20-dion-3,17a-diol-3-acetat, J5-Pregnen-11,20-dion-3,21-diol-3- (niedriges Alkanoat), A5-Pregnen-1 1,20-dion-3,21-diol-3-acetat, J5-Pregnen-11,20-dion-3,21-diol-3,21-bis- (niedriges Alkanoat), 13-Pregnen-11,20-dion-3,21-diol-3,21-diacetat, -15-Pregnen-11,20-dion-3,17,
21-triol-3- (niedriges Alkanoat), J--,-Pregnen-11,20-dion-3,17a,21-triol-3-acetat, J-I-Pregnen-11,20-dion-3,17,21-triol-3,21- bis(niedriges Alkanoat), J5-Pregnen-11,20-dion-3,17a,21-triol-3,21- diacetat, J--,-Pregnen-20-on-3,11-diol-3- (niedriges Alkanoat), J5-Pregnen-20-on-3,11 ss-diol-3-acetat, J ,
3-Pregnen-20-on-3 ,11,17-triol-3- (niedriges Alkanoat), J5-Pregnen-20-on-3,11 ss,17a-triol-3-acetat, J5-Pregnen-20-on-3,11,21-triol-3- (niedriges Alkanoat), J5-Pregnen-20-on-3,11 ss, 21-triol-3-acetat, J5-Pregnen-20-on-3,11,21-triol-3,21- bis(niedriges Alkanoat), _ 1 I-Pregnen-20-on-3,11 ss,21-triol-3,21-diacetat,
J5-Pregnen-20-on-3,11 a,17,21-tetrol-3- (niedriges Alkanoat), J:,-Pregnen-20-on-3,11 ss,17a,21-tetrol-3-acetat, J5-Pregnen-20-on-3,11,17,21-tetrol-3,21- bis(niedriges Alkanoat), J5-Pregnen-20-on-3,11 ss,17a,21-tetrol-3,21- diacetat;
9-Halogenderivate dieser J3-3-(niedriges Alkanoyl- oxy)-Pregnene, wie 9-Halogen-J5-pregnen-20-on-3,17,21-triol-3- (niedriges Alkanoat), 9-Fluor-45-pregnen-20-on-3,17a,21-triol-3-acetat, 9-Halogen-_5-pregnen-11,20-dion-3,17,21- triol-3-(niedriges Alkanoat), 9-Fluor-ds-pregnen-11,20-dion-3,17a,21-triol- 3-acetat, 9-Halogen-J5-pregnen-11,20-dion-3,17,
21-triol- 3,21-bis(niedriges Alkanoat), 9-Fluor-:ds-pregnen-11,20-dion-3,17a,21-triol- 3,21-diacetat, 9-Halogen-J s-pregnen-20-on-3,11,17,21-tetrol- 3-(niedriges Alkanoat), 9-Fluor-J5-pregnen-20-on-3,11 ss,17a,21-tetrol- 3-acetat, 9-Halogen-d5-pregnen-20-on-3,11,17,21-tetrol- 3,21-bis(niedriges Alkanoat), 9-Fluor-d5-pregnen-20-on-3,
11 ss,17a,21-tetrol- 3,21-diacetat usw.
Diese als Ausgangsmaterialien dienenden 3-oxydier- ten J5-Pregnene werden durch die Dehydrierungs- wirkung dieser Nocardia-Mikroorganismen direkt in die entsprechenden J1,4-3-Keto-pregnadiene umge- wandelt, welche Umwandlung vermutlich über die intermediäre Bildung der 44-3-Keto-Verbindung ver läuft.
Der bei den vorstehend genannten Ausgangs materialien vorzugsweise verwendete Estersubstituent in 3- und/oder 21-Stellung ist gewöhnlich das Acetat, doch können auch andere Ester von niedrigen Koh- lenwasserstoff-Carbonsäuren anstelle des Acetates verwendet werden, beispielsweise das Propionat, Butyrat, tertiäre Butylacetat, Benzoat usw.
Anstelle dieser C-5-ungesättigten 3-oxydierten Pregnene kön nen als Ausgangsmaterialien auch 3-Keto-pregnane, 3-Oxy-pregnane oder 3-Oxy-allopregnane verwendet werden, welche durch die Nocardia-Mikroorganismen ebenfalls selektiv dehydriert werden unter Bildung von dl- und J4-Doppelbindungen (und, im Falle der 3-Oxy-pregnane, unter Oxydation der Oxygruppe in 3-Stellung zur Ketogruppe),
wobei die entsprechenden J1.4-3-Keto-pregnadiene gebildet werden. Die 3-Keto- pregnane und 3-Oxy-pregnane, welche als Ausgangs stoffe für diese mikrobiologische Dehydrierungs- methode unter Verwendung von Nocardia-Mikro- organismen gewöhnlich verwendet werden, umfassen:
Pregnan-3,20-dion, Pregnan-3,20-dion-17a-01, Pregnan-3,20-dion-21-ol, Pregnan-3,20-dion-17a,21-diol, Pregnan-3,11,20-trion, Pregnan-3,11,20-trion-17a-01, Pregnan-3,11,20-trion-21-ol, Pregnan-3,11,20-trion-17a,21-diol, Pregnan-3,20-dion-11 ss-ol, Pregnan-3,20-dion-l lss,17a-diol, Pregnan-3,20-dion-11ss,21-diol, Pregnan-3,20-dion-11 ss,17a,21-triol,
Pregnan-20-on-3-ol, Pregnan-20-on-3,17a-diol, Pregnan-20-on-3,21-diol, Pregnan-20-on-3,17a,21-triol, Pregnan-11,20-dion-3-ol, Pregnan-11,20-dion-3,17a-diol, Pregnan-11,20-dion-3,21-diol, Pregnan-11,20-dion-3,17a,21-triol, Pregnan-20-on-3,1 lss-diol, Pregnan-20-on-3,1 1ss,17a-triol, Pregnan-20-on-3,11 ss,21-triol, Pregnan-20-on-3,
1 lss,17a,21-tetrol sowie die 3- und/oder 21-Ester von jenen der auf gezählten Ausgangsstoffe, welche in 3- und/oder 21-Stellung Oxygruppen aufweisen, mit niedrigen Kohlenwasserstoff-Carbonsäuren, wie Essigsäure, Propionsäure, tertiärer Butylessigsäure, Benzoesäure <B>USW.</B>
Die Durchführung des erfindungsgemässen Ver fahrens kann so geschehen, dass man die Steroide als Feststoff oder in Form einer Lösung in einem Lö sungsmittel, beispielsweise einem Dialkylketon, wie Aceton, einem Dialkyl-formamid, wie Dimethyl- formamid usw., unter sterilen Bedingungen einer Kul tur der Mikroorganismen in einem Nährmedium zu- setzt und das entstehende Gemisch rührt, wobei gleichzeitig ein Wachstum der Mikroorganismen und die Dehydrierung der Steroide erfolgen.
Das Steroid kann im Moment zugesetzt werden, wo das Nähr medium mit der Kultur der Nocardia-Mikroorga- nismen geimpft wird, oder sie kann auch einer bereits angelegten Kultur zugefügt werden. Anstatt dass man die Steroide der Kultur im Nährmedium zugibt, kann man auch das Zellmaterial einer entwickelten Kultur von der Brühe abfiltrieren, mit destilliertem Wasser waschen und in einer gepufferten Lösung suspen dieren, welche z.
B. ein 3-oxydiertes Steroid enthält, worauf das entstehende Gemisch gerührt wird zur Bewirkung der Dehydrierung des Steroids unter Bil dung des entsprechenden 3-oxydierten Jl-Steroids. Das letztere kann aus diesem Medium leichter ge wonnen werden als aus dem Gemisch, welches erhal ten wird, wenn das Steroid im ursprünglichen Nähr medium mit den Mikroorganismen bebrütet wird, und es werden mit diesem Medium auch höhere Aus beuten an Jl-Steroiden erzielt,
wenn als Ausgangs stoffe 3-Oxy-pregnane verwendet werden. Anderseits kann das 3-oxydierte Steroid mit aus Kulturen von Nocardia-Mikroorganismen hergestellten Dehydrie- rungs-Enzympräparaten zusammengebracht werden, wobei ebenfalls das entsprechende 3-oxydierte 11-Steroid erhalten wird.
Bei den bei der Durchführung dieses mikrobiolo gischen Dehydrierungsverfahrens verwendeten Nähr medien handelt es sich um solche, wie sie gewöhnlich verwendet werden zum Züchten von Nocardia-Mikro- organismen. Die üblichen Nährmedien enthalten eine Stickstoff- und Kohlenstoffquelle, anorganische Salze und, wenn nötig, Wachstumsfaktoren. Der Kohlen stoff kann eingeführt werden in Form von Verbin dungen wie Acetaten oder Lactaten, was im Falle von gewissen Arten, wie Nocardia blackwellii usw., zu stärkerem Wachstum und höheren Ausbeuten führt.
Der Stickstoff kann zugeführt werden in Form eines Ammoniumsalzes, von Aminosäuren oder von Proteinen, wie Sojabohnen, Haferflocken, Hefe, Hefe extrakten, tryptisch digeriertem Casein, Fleisch extrakt, Blutmehl, Protein-, Fleisch- und Knochen grieben, Lachsmehl, Fischmehl, Fischabsüden usw.
Wenn nötig, können die Nocardia-Mikroorganismen gezüchtet werden unter Verwendung von Proteinen (oder Aminosäuren) ohne Anwesenheit irgendeines Kohlehydrates im Medium, in welchem Falle die Proteine oder Aminosäuren von den Mikroorga nismen als Quelle sowohl für den Kohlenstoff wie auch für den Stickstoff benützt werden.
Während, wie oben erwähnt, die Dehydrierung der Steroide durchgeführt werden kann unter Ver wendung von Dehydrierungs-Enzympräparaten aus der Zucht von Nocardia-Mikroorganismen oder durch Zusammenbringen der Steroide mit einer Suspension einer angelegten Kultur in destilliertem Wasser, ver fährt man vorzugsweise so, dass man die z. B. in 3-Stellung oxydierten Steroide zu einem Nährmedium zugibt, welches eine 24 Stunden alte Zucht von No- cardia-Mikroorganismen enthält.
Die Menge an Steroid, welche dem Medium zugesetzt werden kann, ist variabel und hängt ab von dem besonderen zu dehydrierenden Substrat, wobei man aber vorzugs weise Konzentrationen der in 3-Stellung oxydierten Steroide von etwa 0,005 bis 0,2 % anwendet; es können indessen, wenn erwünscht, auch höhere oder niedrigere Konzentrationen verwendet werden.
Die das zugesetzte, in 3-Stellung oxydierte Steroid ent haltende Kultur wird dann, vorzugsweise unter Rüh ren und unter Luftzutritt, während einer Zeitdauer von gewöhnlich etwa zwischen 10 und 50 Stunden weiter bebrütet, wobei aber auch für die Dehydrie- rung von speziellen 3-Keto-steroid-Substraten kürzere oder längere Fermentationszeiten vorteilhaft sein kön nen.
Angesichts der Tatsache, dass lange Fermenta- tionszeiten eine Zerstörung eines Teils des produ zierten J'-3-Keto-steroids herbeiführen können, wen det man gewöhnlich vorzugsweise eine Fermentations- zeit von etwa 10-24 Stunden an, welche, wie sich gezeigt hat, je nach dem Steroid-Substrat zu maxima len Ausbeuten am -11-dehydrierten Steroidprodukt führt.
Nach Beendigung des Dehydrierungsprozesses kann das Produkt aus der Fermentierungsbrühe leicht gewonnen werden durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, beispiels weise einem chlorierten Kohlenwasserstoff, wie Chloroform, einem Keton, wie Methylisobutylketon, einem Alkylalkanoat, wie Athylacetat usw.
Der Aus zug des gebildeten Jl-dehydrierten Steroids, welcher auch noch etwas unverändertes Ausgangsmaterial enthalten kann, wird in geeigneter Weise gereinigt durch Chromatographieren auf Silicagel, aktivierter Tonerde usw., oder, wenn erwünscht, mittels abstei gender Papierchromatographie. Nach der Trennung des dehydrierten Produktes von nicht zur Reaktion gelangtem Ausgangsmaterial kann das Produkt wenn nötig weiter gereinigt werden durch Umkristallisieren aus einem Lösungsmittel, wie Äthylacetat, Äthyl- acetat-Petroläther usw.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren können unter Verwendung der früher erwähnten C-5-unge- sättigten, in 3-Stellung oxydierten Steroide, 3-Keto- pregnane und 3-Oxy-pregnane beispielsweise die fol genden Stoffe erhalten werden:
J1,4-3-Keto-pregnadiene, wie J1.4-Pregnadien-3,20-dion, Jl,4_pregnadien-3,20-dion-17a-ol, J1.4-Pregnadien-3,20-dion-21-ol, Jl,4_pregnadien-3,20-dion-17a,21-diol, J1,4_pregnadien-3,20-dion-17a-ol-21-al, _l1,4_pregnadien-3,11,20-trion, J1.4-Pregnadien-3,11,20-trion-17a-ol, J 1,4-Pregnadien-3,11,20-trion-21-ol, Jl,4-pregnadien-3,11,20-trion-17a,21-diol, J1.4-pregnadien-3,11,20-trion-17a-ol-21-al, J1.4-pregnadien-3,
20-dion-11 ss-ol, AM-Pregnadien-3,20-dion-11 ss-ol-21-al, J1.4-Pregnadien-3,20-dion-l 1ss,21-diol, J1.4-Pregnadien-3,20-dion-1 lss,17a-diol, J1.4-Pregnadien-3,20-dion-11 ss,17a;21-triol;
9-Halogen-J1.4-3-keto-pregnadiene, wie 9-Halogen-J1.4-pregnadien-3,20-dion-17,21-diol, 9-Fluor-41.4-pregnadien-3,20-dion-17a,21-diol, 9-Halogen-J1,4-pregnadien-3,20-dion- 17,11,21-triol, 9-Halogen-J1#4-pregnadien-3,11,20-trion- 17,21-diol, 9-Fluor-41,4-pregnadien-3,11,20-trion-17a,21-diol, 9-Fluor-A1.4-pregnadien-3,20-dion- 11f,17a,21-triol oder die entsprechenden J4-Pregnen-Verbindungen usw.
<I>Beispiel 1</I> Es werden 50 cm3 eines Nährmediums mit folgen der Zusammensetzung hergestellt: Cerelose (handelsübliche Dextrose) 1 g Edamin (handelsüblicher Laktal- bumin-Auszug) 1 g Getreideweiche 0,25 cm3 Destilliertes Wasser auf 50 cm3 Dieses Medium wird mit KOH auf pH 6,5 ge stellt, sterilisiert und geimpft mit etwa 2,5-5 cm3 einer Kultur von Nocardia asteroides (MA 272;
ATCC 9970)-Mikroorganismen, worauf man die geimpfte Kultur unter Rühren während 48 Stunden bei einer Temperatur von 28 C bebrütet. Zur ent-
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stehenden <SEP> Kultur <SEP> gibt <SEP> man <SEP> eine <SEP> Lösung <SEP> von <SEP> 10 <SEP> mg dem Ausgangsmaterial Hydrocortison entsprechen den Bandes, während das Hauptband ein Ultraviolett- Absorptionsmaximum von 242 my besitzt.
Das Pa- pierchromatogramm wird gut getrocknet, worauf man das dem Absorptionsmaximum von 242 ma ent sprechende Band abschneidet und mit Methanol extrahiert. Der methanolische Auszug wird im Va kuum zur Trockne eingedampft, wobei man 41,4_ Pregnadien-llss,17a,21-triol-3,20-dion erhält.
<I>Beispiel 2</I> Bei sonst genau gleichem Vorgehen wie in Bei spiel 1, aber unter Verwendung von 2,5-5 cm3 einer Kultur von Nocardia minima (MA 292; ATCC 8674)- Mikroorganismen wird aus dem methanolischen Aus zug 41.4-Pregnadien-llss,17a,21-triol-3,20-dion er halten.
<I>Beispiel 3</I> Bei sonst genau gleichem Vorgehen wie in Bei spiel 1, aber unter Verwendung von 2,5-5 cm3 einer Kultur von Nocardia asteroides (MA 289; ATCC 10904) erhält man aus dem methanolischen Auszug 41,4-Pregnadien-11 ss,17a,21-triol-3,20-dion.
<I>Beispiel 4</I> Bei sonst genau gleichem Vorgehen wie in Bei spiel 1, aber unter Verwendung von 2,5-5 cm3 einer Kultur von Nocardia globerula (MA 280; ATCC 9356) wird aus dem methanolischen Auszug d 1,4- Pregnadien-11ss,17a,21-triol-3,20-dion erhalten.
EMI0005.0068
<I>Beispiel 9</I> Sechs Portionen zu 50 cm3 des im Beispiel 1 angeführten Nährmediums werden auf pH 6,5 gestellt und durch Erhitzen in einem Autoklaven auf etwa 120' C während 15 Minuten sterilisiert, worauf man jede der sterilisierten Portionen mit einer Kultur von Nocardia blackwellii-Mikroorganismen (ATCC 6846) impft. Die geimpften Kulturen werden während etwa 48 Stunden unter Rühren bei einer Temperatur von 28 C bebrütet.
Zu jeder der sechs entstehenden Kul turen gibt man eine Lösung von 10 mg je einer andern 3-Keto-steroid-Verbindung in je 0,1 cm3 Di- methylformamid. Die die 3-Keto-steroid-Verbindun- gen enthaltenden Kulturen werden unter Rühren wäh rend weiteren 24 Stunden bebrütet.
Jedes der so erhaltenen Fermentierungsgemische wird für sich viermal mit je 50 cm3 Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetat-Auszüge jedes einem be stimmten 3-Keto-steroid-Substrat entsprechenden An- Satzes werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Jeder der so erhaltenen sechs Rück stände wird in Aceton gelöst und auf Papierchro- matogrammen aufgezogen, von denen jedes unter Verwendung des in der untenstehenden Tabelle für das betreffende als Ausgangsmaterial dienende Sub strat angegebene Lösungsmittelsystem entwickelt wird.
Die oberen Bänder jedes Chromatogramms, welche den dl-Dehydro-Derivaten entsprechen, werden abge schnitten und einzeln mit Methanol extrahiert, worauf man das aus den methanolischen Auszügen gewonnene Material nochmals der Papierstreifenchromatographie unterwirft. Die oberen Bänder werden wieder abge schnitten, dann getrocknet und mit Methanol extra hiert, wonach man die methanolischen Auszüge im Vakuum zur Trockne eindampft.
Hierbei erhält man die in der nachfolgenden Tabelle angegebenen, den als Ausgangsstoffe dienenden Substraten entsprechen den 4l,4-3-Keto-steroid-Verbindungen:
EMI0006.0028
Für <SEP> die <SEP> Papierstreifenchromatographie <SEP> verwendetes
<tb> Versuch <SEP> Substrat <SEP> Lösungsmittelsystem
<tb> Nr.
<SEP> stationäre <SEP> bewegliche <SEP> erhaltenes
<tb> Phase <SEP> Phase <SEP> ,1,4-3-Keto-steroid
<tb> 1 <SEP> J4-Pregnen-1 <SEP> lss,17a,21- <SEP> Formamid <SEP> Chloroform <SEP> 41,4-Pregnadien-11ss,17a,21 triol-3,20-dion <SEP> triol-3,20-dion
<tb> 2 <SEP> Pregnan-11ss,17a,21- <SEP> Formamid <SEP> Chloroform <SEP> 41,4-Pregnadien-11ss,17a,21 triol-3,20-dion <SEP> triol-3,20-dion
<tb> 3 <SEP> Pregnan-17a,21-diol-3,11,20- <SEP> Formamid <SEP> Chloroform- <SEP> dt,4-Pregnadien-17a,21-diol trion-21-acetat <SEP> Toluol <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 3,11,20-trion
<tb> 4 <SEP> Allopregnan-17a,21-diol- <SEP> Formamid <SEP> Chloroform- <SEP> 41,4-Pregnadien-17a,21-diol 3,11,20-trion-21-acetat <SEP> Toluol <SEP> 1 <SEP> :
<SEP> 1 <SEP> 3,11,20-trion
<tb> 5 <SEP> Pregnan-17a,21-diol- <SEP> Formamid <SEP> Benzol <SEP> ,j1,4-Pregnadien-17a,21-diol 3,20-dion <SEP> 3,20-dion
<tb> 6 <SEP> Allopregnan-17a,21-diol- <SEP> Formamid <SEP> Benzol <SEP> 4l,4-Pregnadien-17a,21-diol 3,11-dion-21-acetat <SEP> 3,11-dion <I>Beispiel 10</I> Es werden 50 em3 eines Nährmediums mit fol gender Zusammensetzung hergestellt:
EMI0006.0030
eCerelose <SEP> 1 <SEP> g
<tb> eEdamin <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Getreideweiche <SEP> 0,25 <SEP> cm3
<tb> Destilliertes <SEP> Wasser <SEP> auf <SEP> 50 <SEP> cm3 Dieses Medium wird mit KOH auf pH 6,5 ge stellt, sterilisiert und mit 2,5-5 cm3 einer Kultur von Nocardia asteroides (MA 272; ATCC 9970)- Mikroorganismen geimpft. Die geimpfte Kultur wird während 48 Stunden unter Rühren bei einer Tempe ratur von 28"C bebrütet.
Zur entstehenden Kultur gibt man eine Lösung von 10 mg Pregnan-1 lss,17a,21- triol-3,20-dion in 0,1 cm3 Dimethylformamid. Die die Steroidverbindung enthaltende Kultur wird unter Rühren während weiteren 12 Stunden bei 2811C bebrütet. Die Fermentierungsbrühe wird viermal mit je 50 cm3 Äthylacetat extrahiert, und die Äthylacetat- Auszüge werden vereinigt und im Vakuum auf ein Volumen von etwa 5 cm3 eingedampft.
Die konzen trierte Lösung wird verwendet für ein Papierstreifen- chromatogramm, welches entwickelt wird unter Ver wendung von Formamid als stationäre flüssige Phase und von Chloroform als bewegliche flüssige Phase. Das auf diese Weise erzielte Hauptband zeigt das für Hydrocortison charakteristische Ultraviolett-Absorp- tionsmaximum; das Papierchromatogramm wird ge trocknet, worauf man dieses Band abschneidet und mit Methanol extrahiert.
Das mit Methanol extra hierte Material wird wiederum der Papierstreifen chromatographie unterworfen, unter Verwendung von Papier, welches während 48 Stunden mit Metha nol extrahiert wurde, wobei wiederum das schon erstmals verwendete Chloroform-Formamid-System zur Anwendung gelangt. Das entstehende Chromato- gramm wird gut getrocknet und das Band, welches das für Hydrocortison charakteristische Ultraviolett- Absorptionsmaximum zeigt, wird wiederum abge schnitten und mit Methanol extrahiert.
Der metha- nolische Auszug wird im Vakuum zur Trockne ein gedampft, wobei man Hydrocortison (d4-Pregnen- Il/3,17a,21-triol-3,20-dion) erhält.
Der vorbeschriebene Versuch wird wiederholt unter Verwendung des gleichen Nährmediums, wobei wiederum Pregnan-llss,17a,21-triol-3,20-dion als Substrat dient und die Bebrütungsdauer 12 Stunden beträgt, jedoch unter Verwendung der folgenden Mikroorganismen anstelle von Nocardia asteroides MA 272:
Nocardia minima - (MA 292; ATCC 8674), Nocardia globerula - (MA 280; ATCC 9356), Nocardia leishmanii - (MA 281; ATCC 6855), Nocardia formica - (MA 143; NRLL 2470), Nocardia asteroides - (MA 289; ATCC 10 904).
Durch Extraktion der entstehenden Fermentie- rungsbrühen und Papierehromatographie der getrock neten Auszüge in einem Formamid-Chloroform- System erhält man in jedem Fall auf dem Chromato- gramm ein dem Hydrocortison entsprechendes Band. Durch Eluieren dieses Bandes in der beschriebenen Art und Weise erhält man Hydrocortison, welches auf Grund seines Ultraviolett-Absorptionsspektrums als Hauptsteroidprodukt identifiziert werden kann.
<I>Beispiel<B>11</B></I> Es werden 50 em3 eines Nährmediums mit folgen der Zusammensetzung hergestellt:
EMI0007.0043
Cerelose <SEP> 68 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP> 68 <SEP> g
<tb> Getreideweiche <SEP> 17 <SEP> cm3
<tb> Destilliertes <SEP> Wasser <SEP> auf <SEP> 3400 <SEP> cm3 Dieses Medium wird mit KOH auf pH 6,5 gestellt, sterilisiert und mit etwa 200 cm3 eines vegetativen Erzeugnisses einer Kultur von Nocardia blackwellii (MA 273; ATCC 6846)-Mikroorganismen geimpft.
Die geimpfte Kultur wird während 48 Stunden unter Rühren und unter Luftzufuhr bei einer Temperatur von 280 C bebrütet. Zur entstehenden Kultur gibt man eine Lösung von 0,64 g Pregnan-3ss,17a,21- triol-11,20-dion-21-acetat in Dimethylformamid. Die die Steroidverbindung enthaltende Kultur wird unter Rühren und Luftzufuhr während weiteren 24 Stunden bei 280 C bebrütet.
Die Fermentierungsbrühe wird mit Äthylacetat extrahiert, und der Auszug wird abgetrennt und zur Trockne eingedampft. Der trockene Rückstand wird zwischen Petroläther und 70o/oigem wässerigem Methanol verteilt; die Petroläther-Schicht wird ver worfen. Das wässerige Methanol, welches das Pro dukt enthält, wird unter reduziertem Druck einge dampft zur Entfernung des Methanols.
Die ent stehende wässerige Schicht wird mehrmals mit Äthyl- acetat extrahiert, und die Äthylacetat-Schicht wird zur Trockne eingedampft, wobei man teilweise ge reinigtes 41,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion erhält.
Diese Substanz kann gereinigt werden, indem sie in Pyridin gelöst wird und mit Acet- anhydrid im überschuss versetzt zur Bildung von d1,4-Pregnadien -17a,21- diol- 3,11,20-trion-21-acetat, welches aus dem Acetylierungsgemisch gewonnen wird durch Zugabe von Wasser und Abfiltrieren des ausgefallenen Materials.
Das d1,4-Pregnadien- 17a,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat wird in Äther gelöst und auf aktivierter Tonerde chromatographiert. Zur Entwicklung des Chromatogramms verwendet man als Lösungsmittel Äther und ein Gemisch von Äther mit Chloroform. Das gewünschte Produkt wird mit Chloroform von der Säule eluiert, und das chloroformische Eluat wird eingedampft, wobei man in hoher Ausbeute reines kristallines 41.4-Pregnadien- 17a,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat erhält.
<I>Beispiel 12</I> Zwei Portionen zu je 50 cm3 des im Beispiel 1 angeführten Nährmediums werden mit KOH auf pH 6,5 gestellt, durch 15minütiges Erhitzen in einem Autoklaven auf 1200 C sterilisiert, worauf man die sterilisierten Medien je mit einer Kultur von Nocar- dia blackwellii (ATCC 6846)-Mikroorganismen impft. Die geimpften Kulturen werden unter Rühren wäh rend 48 Stunden bei 28 C bebrütet. Hiernach wird das Kulturprodukt zentrifugiert, wobei die Zellen zurückgehalten werden und die überstehende Flüssig keit verworfen wird.
Die erhaltenen Zellen werden mit destilliertem Wasser gewaschen und mit auf pH 7,0 gepuffertem Wasser auf ein Volumen von 25 cm3 gebracht. Zur einen dieser Zellsuspensionen gibt man eine Lösung von 5 mg Pregnan-3,17a,21-triol-11,20- dion-21-acetat in 0,1 cm3 Dimethylformamid;
zur andern Zellsuspension gibt man eine Lösung von 5 mg Pregnan-17a,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat in 0,1 cm3 Dimethylformamid. Die die Pregnanverbin- dungen enthaltenden Zensuspensionen werden dann unter Rühren während etwa 12-15 Stunden be brütet.
Jede der so erhaltenen Fermentierungsbrühen wird für sich viermal mit je 50 cm3 Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetat-Auszüge von jeder der beiden Brühen werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei man in beiden Fällen relativ reines 41.4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20- trion erhält.
Die Ausbeute beträgt in beiden Fällen, wie aus der polarographischen Analyse der Produkte hervorgeht, mehr als 85%, der Theorie.