Verfahren zur Herstellung von 16-Methyl-1,4-pregnadien-17a-ol-3,20-dioneni Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 16-Methyl-1,4-pregna- dien-17a-ol-3,20-dionen aus den entsprechenden Pregnanen oder 4-Pregnenen. Unter den erfindungs gemäss erhältlichen Steroiden sind von besonderem Interesse die in 11-Stellung eine Oxy- oder Oxo- gruppe aufweisenden 16-Methyl-1,4-pregnadien-17a, 21-diol-3,
20-dione sowie ihre 21-Ester und die in 9-Stellung durch Fluor substituierten Derivate, wel che eine ausserordentlich starke entzündungshem mende Wirkung besitzen und besonders wirksam für die Behandlung von Arthritis und verwandten Krank heiten sind, indem sie eine cortisonartige Wirkung in äusserst geringer Dosierung ausüben, wodurch uner wünschte Nebenwirkungen auf ein Minimum be schränkt werden;
diese Verbindungen lassen sich durch die folgende Strukturformel darstellen, in wel cher X Wasserstoff oder Fluor, R Wasserstoff oder einen niedrigen Acylrest und Z eine Keto- oder Oxy- gruppe bedeutet:
EMI0001.0020
Die 16-Methyl-1,4-pregnadien-17a-ol-3,20-dione werden erfindungsgemäss erhalten, indem man die entsprechenden Pregnane oder 4-Pregnene dehy driert.
Insbesondere zur Dehydrierung der 4-Pregnene kann man Mikroorganismen der Klasse Schizomy- cetes, zu welcher die Ordnungen Actinomycetales und Eubacteriales gehören, oder entsprechende En zyme auf die Steroide zur Einwirkung bringen. Unter den Eubacteriales werden die Gattungen Acetobacter, Aerobacter und Bacillus bevorzugt.
Unter den Actino- mycetales bevorzugt man Mikroorganismen der Gat tungen Nocardia und Mycobacterium. Besonders ge eignet sind die folgenden Arten: Acetobacter xyli- num, Aerobacter aerogenes, Bacillus sphaericus, Nocardia erythropolis, Nocardia blackwellii,
Nocar- dia asteroides, Nocardia minima, Nocardia globerula, Nocardia leishmanii, Nocardia formica, Nocardia convoluta, Nocardia corallina, Mycobacterium smeg- matis, Mycobacterium phlei,
Mycobacterium lacticola und Mycobacterium tuberculosis. Die Art Bacillus sphaericus, wie sie in Bergeys Manual for Determina- tive Bacteriology, 6. Auflage, definiert wird, umfasst mehrere Varietäten, z.
B. die Varietäten rotans, fusi- formis usw.; in einigen Sammlungen werden diese Varietäten mit den Artnamen Bacillus rotans und Bacillus fusiformis bezeichnet. Diese Mikroorganis men aus der Klasse Schizomycetes können zum Bei spiel von der American Type Cultur Collection, Washington, D. C., bezogen werden, oder sie kön nen auch nach bekannten Methoden aus natürlichen Quellen, z. B. aus dem Boden, isoliert werden.
Die Eignung eines Stammes für die Dehydrierung kann nach folgendem Testverfahren ermittelt werden: Ein Nährmedium, enthaltend 1 g Cerelose, 1 g Ed- amin, 0,25 cm3 Getreideweiche, 0,05 g Hefeextrakt und destilliertes Wasser bis 50 cm3, wird auf pH 6,5 gestellt, sterilisiert und mit einer Kultur des Mikro organismen-Stammes geimpft, welcher auf seine 41- Dehydrierungswirkung untersucht werden soll.
Die entstehende Kultur wird 24 Stunden lang bei 28 C bebrütet, worauf man eine Probe der Kultur in ein Gefäss einführt, welches weitere 50 cm3 des erwähn ten Nährmediums enthält, die ebenfalls auf pH 6,5 gestellt und sterilisiert wurden. Die zweite geimpfte Kultur wird unter Rühren 24 Stunden lang bei 28 C bebrütet. Die erhaltene Kultur wird zu einer Lösung zugesetzt, welche 10 mg Hydrocortison in 0,1 cm3 Dimethylformamid gelöst enthält. Die die Steroid- verbindung enthaltende Kultur wird unter Rühren während weiteren 10 Stunden bei 28 C bebrütet.
Die Fermentierungsbrühe wird wiederholt mit Äthylace- tat extrahiert; die Äthylacetatauszüge werden ver einigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Ein Teil des verbleibenden Materials wird in Aceton gelöst und auf ein Papierchromatogramm aufgetupft, welches unter Verwendung von Formamid als statio näre Phase und von Chloroform als bewegliche Phase entwickelt wird. Man erhält gewöhnlich zwei Bänder, von denen das untere dem unveränderten Hydrocor- tison und das obere dem d 1-Dehydro-Derivat ent spricht.
Beide Bänder werden abgeschnitten, je für sich mit Methanol eluiert, und die Methanol-Eluate werden der Ultraviolett-Absorptionsanalyse unterwor fen. Die Wirksamkeit des Mikroorganismen-Stammes, welcher auf seine 41-Dehydrierungswirkung unter sucht wird, ergibt sich aus den relativen Anteilen von 41-Dehydro-Derivat und unverändertem Hydrocorti- son, wie sie durch diese Ultraviolett-Absorptionsana- lyse ermittelt werden.
Als Ausgangsstoffe in Betracht kommende, in 11-Stellung eine Oxy- oder Oxogruppe aufweisende 16-Methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dione werden zweckmässig aus dem bekannten 16-Pregnen-3a-o1-11, 20-dion-3-acetat wie folgt hergestellt:
Man setzt das 16-Pregnen-3a-o1-11,20-dion-3-acetat in Gegenwart von Cuprochlorid mit Methylmagnesiumjodid zum 16a-Methyl-pregnan-3a-o1-11,20-dion-3-acetat um, welches man mit wässerig-methanolischer Salzsäure in das 16a-Methyl-pregnan-3a-o1-11,20-dion umwan delt.
Die letztere Verbindung, welche ein starkes Anästhetikum ist, wird in Gegenwart von p-Toluol- sulfonsäure als Katalysator mit Acetanhydrid um gesetzt, wobei man ein Enolacetat-Gemisch erhält, welches 16a-Methyl-17(20)-pregnen-3a,20-diol-11- on-3,20-diacetat enthält.
Nach chromatographischer Reinigung zur Entfernung von unverändertem Aus gangsmaterial setzt man dieses Gemisch mit Perben- zoesäure um und hydrolysiert das dabei erhaltene 16a-Methyl-17a,21-epoxy-pregnan-3a,20=diol-11-on- 3,20-diacetat mit methanolischem Kaliumbicarbonat zum 16a-Methyl-pregnan-3a,17a-diol-11,20-dion. Die letztere Verbindung wird mit Brom in Chloroform zum 21-Brom-16a-methyl-pregnan-3a,17a-diol-11,20- dion bromiert,
welches mit Natriumjodid in Aceton zum 21-Jöd-16a-methyl-pregnan-3a,17a-diol-11,20- dion umgesetzt wird. Dieses Jodderivat wird seiner seits ohne Isolierung mit wasserfreiem Kaliumacetat in 16a-Methyl-pregnan-3a,17a,21-triol-11,20-dion- 21-acetat übergeführt. Diese Verbindung wird mit Chromtrioxyd in Pyridin zum 16a-Methyl-pregnan- 17a,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat oxydiert.
Das 16a-Methyl-pregnan-17a,21- diol- 3,11,20-trion-21- acetat wird mit Brom in Eisessig-Chloroform zum 4-Brom-17a-methyl-pregnan-17a,21-diol- 3,11,20- trion bromiert, welches dann durch Umsetzung mit Semicarbazid in 16a-Methyl-4-pregnen-17a,21-diol- 3,11,20-trion-3,20-bis-semicarbazon-21-acetat über geführt wird.
Dieses 3,20-bis-Semicarbazon wird mit Natriumborhydrid zu 16a-Methyl-4-pregnen-11fl, 17a,21-triol-3,20-dion-3,20-bis-semicarbazon hy driert, welches unter sauren Bedingungen zu 16a Methyl-4-pregnen-11ss,17a,21-triol-3,20-dion hydro- lysiert wird. Diese Verbindung kann zum Beispiel mit Benzoesäureanhydrid oder niedrigen Fettsäure anhydriden in 21 -Stellung verestert werden.
Das obenerwähnte 16a-Methyl-4-pregnen-17a,21- d'iol- 3,11,20 - trion - 3,20 -bis-semicarbazon-21-acetat kann auch mit Kaliumbicarbonat oder Kalium hydroxyd in wässerigem Methanol in 16a-Methyl-4- pregnen -17a,21- diol- 3,11,20-trion-3,20-bis-semicar- bazon umgewandelt und dieses zu 16a-Methyl-4- pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion hydrolysiert wer den.
Diese Verbindung kann ebenfalls zu den entspre chenden 21-Ester-Derivaten verestert werden.
Das 16a-Methyl-4-pregnen-11ss,17a,21-triol-3,20- dion liefert bei Reaktion mit Acetanhydrid in Pyri- din das entsprechende 21-Acetat, welches mit Me- thansulfonylchlorid und anschliessend mit Kalium acetat oder mit Phosphoroxychlorid umgesetzt wird, wobei 16a-Methyl-4,9(11)-pregnadien-17a,21-diol- 3,20-dion-21-acetat entsteht.
Die letztere Verbindung wird mit unterbromiger Säure umgesetzt zur Bildung von 9a-Brom-16a-methyl-4-pregnen-1 l,B,17a,21-triol- 3,20-dion-21-acetat, welches mit wasserfreiem Ka- liumacetat in Äthanol in 16a-Methyl-9,11-epoxy-4- pregnen-17a,21-diol-3,20-dion-21-acetat umgewan delt wird.
Dieses 9,11-Epoxyd wird dann mit Fluor wasserstoff in Tetrahydrofuran zum 16a-Methyl-9a- fluor-4-pregnen -l 1 a,17a,21- triol-3,20-dion-21-acetat umgesetzt.
Diese Verbindung wird zum 16a-Methyl- 9a-fluor-4-pregnen-l1a,17a,21-triol-3,20-dion hydro- lysiert. Dieser freie 21-Alkohol kann zum Beispiel mit Benzoesäureanhydrid, niedrigen Fettsäureanhy- driden und dergleichen in den entsprechenden 21- Ester übergeführt werden.
Das 16a-Methyl-9a-fluor-4-pregnen-l1a,17a,21- triol-3,20-dion-21-acetat kann auch mit Chromtri- oxyd in Pyridin zum 16a-Methyl-9a-fluor-4-pregnen- 17a,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat oxydiert werden, welches mit einem Hydrolysierungsmittel den freien 21-Alkohol 16a-Methyl-9a-fluor-4-pregnen-17a,21- diol-3,11,20-trion bildet.
Dieser freie 21-Alkohol kann zum Beispiel mit Benzoesäureanhydrid, nied rigen Fettsäureanhydriden und dergleichen zum ent sprechenden 21 -Ester verestert werden.
Zum Zweck der erfindungsgemässen mikrobiolo gischen Dehydrierung dieser Steroide kann man die Steroide als Feststoffe oder in Lösung, z. B. in einem Dialkylketon, wie Aceton, einem Dialkylformamid, wie Dimethylformamid und dergleichen, unter ste rilen Bedingungen in eine nährmediumhaltige Mikro organismenkultur einbringen und das Gemisch rüh ren; das Wachstum des Mikroorganismus und die Dehydrierung des Steroids gehen dann vor sich.
Das Steroid kann gleichzeitig mit der Beimpfung des Nährmediums mit der Schizomycetenkultur oder auch zu einer bereits bestehenden Kultur zugesetzt wer den. Auch kann man zwecks leichterer Gewinnung der dehydrierten Verbindung die Zellen einer solchen Kultur von der Brühe abfiltrieren, mit destilliertem Wasser waschen, dann in einer gepufferten wässrigen Lösung suspendieren, welche das in 11 -Stellung durch eine sauerstoffhaltige Gruppe substituierte 16- Methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion enthält und das Gemisch in Bewegung halten,
bis die Dehydrie- rung des Steroids zu der entsprechenden, in 11-Stel- lung sauerstoffsubstituierten Pregnadienverbindung erfolgt ist. Anderseits kann das in 11 -Stellung sauer stoffhaltige 16-Methyl-4-pregnen-17a.,21-diol-3,20- dion mit dehydrierend wirkenden Enzympräparaten von Schizomyceten in Berührung gebracht werden.
Die üblichen Nährmedien zur Zucht von Schizo- myceten enthalten eine Quelle für Stickstoff und eine Quelle für Kohlenstoff, anorganische Salze und gege benenfalls Wachstumfaktoren. Der Kohlenstoff kann in Form von Acetaten, Lactaten und dergleichen ge liefert werden. Der Stickstoff kann in Form von Ammoniumsalzen, Aminosäuren oder Proteinen, wie Sojabohnen, Hafer, Hefe, Hefeextrakten, teilweise verdautem Kasein, Fleischextrakt, Blutmehl, Protein-, Fleisch- und Knochenabfall, Lachsmehl, Fischmehl, löslichen Fischbestandteilen, löslichen Schlempe- bestandteilen und dergleichen vorliegen.
Gegebenen falls kann man die Schizomyceten unter Verwen dung von Proteinen (oder Aminosäuren) in Abwesen heit von Kohlehydraten züchten, in welchem Falle die Proteine oder Aminosäuren gleichzeitig als Quelle für Kohlenstoff und für Stickstoff dienen. Vorzugs weise arbeitet man so, dass man das in 11 -Stellung durch eine sauerstoffhaltige Gruppe substituierte 16- Methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion zu einem Nährmedium zusetzt, welches eine 24 Stunden alte Schizomycetenkultur enthält.
Die Menge der dem Medium zuzusetzenden Steroidverbindung richtet sich nach dem jeweils zu dehydrierenden Substrat; vor zugsweise arbeitet man jedoch mit einer Konzentra tion von etwa 0,005 bis 0;2 1/a des in 11-Stellung durch eine sauerstoffhaltige Gruppe substituierten 16-Methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dions. Die das Steroid enthaltende Kultur wird dann, vorzugsweise unter Bewegung und Belüftung, eine weitere Zeitlang bebrütet, gewöhnlich 10 bis 50 und vorzugsweise 10 bis 24 Stunden, je nach dem angewandten Steroid substrat. Bei Einhaltung derartiger Gärzeiten gewinnt man das in 1-Stellung dehydrierte Steroid in Höchst ausbeute.
Nach Beendigung der Dehydrierung wird das Endprodukt vorteilhaft aus der Gärbrühe durch Ex traktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, z. B. einem chlorierten Kohlenwas serstoff, wie Chloroform, einem Keton, wie Methyl- isobutylketon, einem Alkylalkanoat, wie Athylacetat und dergleichen, gewonnen. Dieses Extrakt kann chromatographisch an Kieselsäuregel, aktiviertem Aluminiumoxyd und dergleichen oder gegebenenfalls mittels eines Papierchromatogramms gereinigt wer den.
Nach Trennung des dehydrierten Produktes von dem nicht umgesetzten Ausgangsstoff kann das Pro dukt weiter gereinigt werden, gewünschtenfalls durch Umkristallisieren aus einem Lösungsmittel, wie Äthyl- acetat, Äthylacetat-Petroläther und dergleichen.
Geht man von den obenerwähnten 16-Methyl-4- pegnen-17a,21-diol-3,20-dionen, die in 11-Stellung durch sauerstoffhaltige Gruppen substituiert sind, aus, so erhält man 16-Methyl-1,4-pregnadien-17a,21- diol-3,20-dione, die in 11-Stellung durch sauerstoff haltige Gruppen substituiert sind, wie 16a-Methyl- 1,4-pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion, 16a-Me- thyl-1,4-pregnadien-llss,17a,21-triol-3,20-dion, 16a- Methyl-9a-fluor-17a,21-diol-3,11,
20-trion und 16a Methyl-9a-fluor-11ss,17a,21-triol-3,20-dion.
Wenn das Ausgangsmaterial in Form eines 21- Esters vorliegt, wird nach der mikrobiologischen De hydrierung der entsprechende 21-Alkohol erhalten; denn jede 21-Estergruppe wird während der mikro biologischen Dehydrierung hydrolysiert. Die freie 21- Oxygruppe kann nachträglich wieder verestert wer den, z.
B. mit Hilfe eines Phosphorylierungsmittels, eines von einer niedrigen Carbonsäure abgeleiteten Acylierungsmittels, wie Benzoesäureanhydrid, tertiä rem Butylacetylchlorid, einem niedrigen Fettsäure anhydrid oder einem niedrigen Fettsäurehalogenid, wie Essigsäureanhydrid, Propionsäureanhydrid, einem mehrbasischen Säureanhydrid, wie ss,ss-Dimethyl- glutarsäureanhydrid, Bernsteinsäureanhydrid und der gleichen.
Anstelle der mikrobiologischen Dehydrierung können die 16-Methyl-4-pregnen-17a-ol-3,20-dione oder vorzugsweise die entsprechenden gesättigten 16-Methyl-pregnan-17a-ol-3,20-dione auch in be kannter Weise mit Selendioxyd umgesetzt werden; dadurch wird der Ring A unter Bildung der entspre chenden 16-Methyl-1,4-pregnad'ien-17a-ol-3,20-dione dehydriert.
Die Dehydrierung mit Selendioxyd wird zweckmässig in der Weise durchgeführt, dass man die 16-Methyl-4-pregnen-17a-ol-3,20-dione oder 16-Me- thyl-pregnan-17a-ol-3,20-dione mit Selendioxyd in einem organischen Lösungsmittel, z. B. Dioxan oder einem Alkohol, wie tert. Butanol usw., zusammen bringt und das Gemisch auf höhere Temperatur er hitzt.
Wenn tert. Butanol als Lösungsmittel dient, wird die Reaktion am besten bei dem Siedepunkt des Lösungsmittels durchgeführt; die Reaktion ist dann gewöhnlich in etwa 15 Stunden beendet. Das Reak tionsgemisch wird zur Entfernung von metallischem Selen im allgemeinen filtriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft;
man erhält so die gewünschte 16-Methyl-14-pregnadien-17a-ol-3,20- dion-Verbindung. Das Rohprodukt wird zweckmässig durch Papier streifenchromatographie gemäss der Arbeitsweise ge reinigt, die oben für die Reinigung der durch mikro biologische Dehydrierung hergestellten 16-Methyl- 1,4-pregnadien-17a-ol-3,20-dione beschrieben ist.
<I>Beispiel 1</I> 50 cm3 eines Nährmediums folgender Zusammen setzung werden bereitgestellt: Technische Dextrose (bekannt unter der Handelsbezeichnung Cerelose ) 1 g Technisches digeriertes Lactalbumin (be kannt unter der Handelsbezeichnung Edamin ) 1 g Maismaischflüssigkeit 0,25 cm3 mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 50 cm3 Dieses Medium wird mit KOH auf ein pA von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 2,
5 bis 5 cm3 einer Kultur von Bacillus sphaericus (ATCC-245) beimpft; die beimpfte Kultur wird dann bei 28 unter Rühren 24 Stunden lang bebrütet. Dann setzt man der Kultur eine Lösung von 16a-Methyl-4-pregnen-17a, 21-diol-3,11,20-trion in 0,2 cm3 Dimethylformamid zu. Die das Steroid enthaltende Kultur wird dann weiter 24 Stunden unter Bewegung bei 28 bebrütet.
Man extrahiert die Gärbrühe mit vier Anteilen von je 50 em3 Äthylacetat, vereinigt die Athylacetat- extrakte und dampft sie im Vakuum auf etwa 5 cm3 ein. Die konzentrierte Lösung wird dann auf Papier- chromatogramme aufgetragen, welche unter Verwen dung von Dimethylformamid als stationäre Phase und von Benzol-Chloroform <B><I>50:</I></B> 50 als bewegliche Phase entwickelt werden.
Nach achtstündiger Entwicklung in einem absteigenden System werden die obern Bän der aller Chromatogramme, welche dem d 1-Dehydro- Derivat entsprechen, abgeschnitten und mit Methanol extrahiert, und das methanolisch ausgezogene Mate rial wird wiederum der Papierstreifenchromatogra- phie unterworfen. Das obere Band wird wiederum abgeschnitten, gut getrocknet und mit Methanol ex trahiert, und der methanolische Auszug wird im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wird aus Äthylacetat-Petroläther umkristallisiert, wo bei man 16a-Methyl-1,4-pregnadien-17a,21-diol-3, 11,20-trion erhält.
<I>Beispiel 2</I> Ein wie in Beispiel 1 bereitetes Nährmedium wird mit 2,5 bis 5 cm3 einer Kultur von Nocardia asteroides (ATCC-9970) geimpft. Die geimpfte Kultur wird 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur unter Rüh ren bebrütet. Zur entstandenen Kultur fügt man eine Lösung, welche 10 mg 16a-Methyl-4-pregnen-11N, 17a,21-triol-3,20-dion in 0,2 cm3 Dimethylformamid enthält. Die das Steroid enthaltende Kultur wird unter Rühren während weiteren 24 Stunden bei 28 C bebrütet.
Die Fermentieirungsbrühe wird viermal mit je 50 em3 Äthylacetat extrahiert; die Äthylacetat- auszüge werden vereinigt und im Vakuum auf ein Volumen von etwa 5 cm3 eingedampft.
Die konzen- trierte Lösung wird auf Papierchromatogramme auf getragen, welche unter Verwendung von Dimethyl- formamid als stationäre Phase und von Benzol- Chloroform 50<B><I>:50</I></B> als bewegliche Phase entwickelt werden. Die obern Bänder aller Chromatogramme, welche dem d 1-Dehydro-Derivat entsprechen, wer den abgeschnitten und mit Methanol extrahiert. Das mit Methanol extrahierte Material wird wiederum der Papierstreifenehromatographie unterworfen. Das obere Band wird wiederum abgeschnitten, gut ge trocknet und mit Methanol extrahiert.
Die methano- lischen Auszüge werden im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Athylacetat- Petroläther umkristallisiert, wobei man 16a-Methyl- 1,4-pregnadien-llss,17a,21-triol-3,20-dion erhält. <I>Beispiel 3</I> Ein wie in Beispiel 1 bereitetes Nährmedium wird mit etwa 2,5 bis 5 cm3 einer Kultur von Mycobac- terium smegmatis (NRRL B-1667) geimpft.
Die ge impfte Kultur wird dann während 24 Stunden unter Rühren bei<B>28 </B> C bebrütet. Zur erhaltenen Kultur gibt man eine Lösung, welche 10 mg 16a-Methyl-9a- fluor-4-pregnen-11ss,17a,21-triol-3,20-d'ion in 0,2 cm3 Dimethylformamid enthält. Die das Steroid enthal tende Kultur wird unter Rühren während weiteren 24 Stunden bei 28 C bebrütet.
Die Fermentierungsbrühe wird dreimal mit je 50 cm3 Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetat-Aus- züge werden vereinigt und im Vakuum auf ein Volu men von etwa 5 cm3 eingedampft. Die konzentrierte Lösung wird dann verwendet zur Anfertigung von Papierstreifenchromatogrammen, welche unter Ver wendung von Dimethylformamid als stationäre flüs sige Phase und von Benzol-Chloroform <B><I>50:</I></B> 50 als bewegliche flüssige Phase entwickelt werden.
Es werden zwei Bänder festgestellt, von denen das eine (das der beweglicheren Komponente entspricht) das für 16a-Methyl-9a-fluor-4-pregnen-llss,17a,21-triol- 3,20-dion (Ausgangsmaterial) charakteristische Ultra- violett-Absorptionsmaximum zeigt, während das an dere (entsprechend der weniger beweglichen Kom ponente) ein Ultraviolett-Absorptionsmaximum bei etwa 245 m,cc besitzt. Das Papierchromatogramm wird getrocknet und das der Absorption bei 245 m,cc entsprechende Band abgeschnitten und mit Methanol extrahiert.
Das mit Methanol extrahierte Material wird wiederum der Papierstreifenchromatographie unterworfen, wobei man Papier verwendet, das 48 Stunden lang mit Methanol extrahiert wurde, und zwar unter Anwendung des gleichen Chloroform- Formamid-Systems wie vorher. Das erhaltene Chro- matogramm zeigt nur eine Spur eines dem Ausgangs material entsprechenden Bandes, wobei das Haupt band ein Ultraviolett - Absorptionsmaximum bei 245 m,u zeigt. Das Papierchromatogramm wird gut getrocknet, und das dem Absorptionsmaximum bei 245 mit entsprechende Band wird abgeschnitten und mit Methanol extrahiert.
Der methanolische Auszug wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei man 16a-Methyl-9a-fluor-1,4-pregnadien-11ss,17a, 21-triol-3,20-dion erhält.
<I>Beispiel 4</I> Man arbeitet wie in den Beispielen 1, 2 und 3, wobei man jedoch anstelle der in diesen Beispielen benutz- ten Mikroorganismen und Ausgangsstoffe die in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten Mikroorganis- menstämme und Steroide benutzte. Die erhaltenen Fermentierungsbrühen wurden nach den in den Bei spielen 1, 2 und 3 beschriebenen Isolierungsverfah- ren aufgearbeitet.
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<I>Beispiel 5</I> Zu einer Lösung von 110 mg 16a-Methyl-4- pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat in 6 cm3 t-Butanol, 0,01 cm3 Eisessig und 0,03 cm3 Acetanhy- drid gibt man 70 mg selenige Säure (H2Se03). Das Gemisch wird über Nacht auf Siedetemperatur erhitzt, worauf man weitere 50 mg selenige Säure zusetzt und das Erhitzen während weiteren 24 Stunden fortsetzt.
Die Lösung wird von metallischem Selen abfiltriert und zu einem Öl eingedampft, welches dann in Athylacetat gelöst wird. Die Athylacetat- lösung wird mit wässrigem Natriumbicarbonat und dann mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen und getrocknet. Das Lösungsmittel wird aus der trockenen Lösung abgedampft, wobei man ein Öl erhält, wel ches in Benzol gelöst und aus diesem Lösungsmittel an mit Säure gewaschener Tonerde adsorbiert wird.
Das Adsorbat wird mit Äther-Petroläther und dann mit Gemischen aus Äther und Chloroform mit zuneh mendem Chloroformgehalt eluiert. Die Äther-Chloro- form-Elüate 4 : 6 werden vereinigt und zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wird aus Athyl- acetat-Äther umkristallisiert, wobei man 16a-Methyl- 1,4-pregnadien-17a,21- diol- 3,11,20-trion-21-acetat, Schmelzpunkt 208-212 C, erhält.
<I>Beispiel 6</I> Zu einer Lösung von 10 mg 16a-Methyl-4-pre- gnen-llss-17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat in 6 cm3 t-Butanol, 0,01 cm3 Eisessig und 0,03 cm3 Acetanhy- drid gibt man 70 mg selenige Säure. Das Gemisch wird über Nacht auf Siedetemperatur erhitzt, worauf man weitere 50 cm3 selenige Säure zusetzt und das Erhitzen während weiteren 24 Stunden fortsetzt.
Die Lösung wird von metallischem Selen dekantiert und zu einem Öl eingedampft, welches dann in Athyl- acetat gelöst wird. Die Athylacetatlösung wird mit wässrigem Natriumbicarbonat und dann mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen und getrocknet. Das Lösungsmittel wird aus der trockenen Lösung ab gedampft, wobei man ein Öl erhält, welches in Ben zol gelöst und aus diesem Lösungsmittel auf mit Säure gewaschener Tonerde adsorbiert wird.
Das Adsorbat wird mit Äther-Petroläther und dann mit Gemischen aus Äther und Chloroform mit zunehmen dem Chloroformgehalt eluiert. Die Äther-Chloroform- Eluate 4 : 6 werden vereinigt und zur Trockne ein gedampft, und der Rückstand wird aus Athylacetat- Äther umkristallisiert, wobei man 16a-Methyl-1,4- pregnadien-llss,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat er hält.
<I>Beispiel 7</I> Man geht gleich vor wie in Beispiel 6 beschrie ben, verwendet jedoch anstelle des 16a-Methyl-4- pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion-21-acetates als Ausgangsmaterial 9 a-Fluor-16a -methyl- 4 - pregnen- 17a,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat und erhält da durch 9a-Fluor-16a-methyl-1,4-pregnadien-17a,21- diol-3,11,20-trion-21-acetat. <I>Beispiel 8</I> Man geht gleich vor wie in Beispiel 6 beschrie ben, verwendet jedoch anstelle des 16a-Methyl-4- pregnen-17a,21-diol-3,11,
20-trion-21-acetates als Ausgangsmaterial 9a-Fluor-16a-methyl-4-pregnen- llss,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat, wobei man als Produkt 9a-Fluor-16a-methyl-1,4-pregnadien-llss, 17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat erhält.
<I>Beispiel 9</I> Zu einer Lösung von 110 mg 16a-Methyl-pre- gnan-17a,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat in 6 cm3 t-Butanol, 0,01 cm3 Eisessig und 0,03 cm3 Acetanhy- drid gibt man 70 mg selenige Säure. Das Gemisch wird über Nacht zum Sieden erhitzt, worauf man weitere 50 mg selenige Säure zusetzt und das Erhit zen während weiteren 24 Stunden fortsetzt. Die Lö sung wird von metallischem Selen dekantiert und zu einem Öl eingedampft, welches dann in Athylacetat gelöst wird.
Diese Lösung wird mit wässrigem Na- triumbicarbonat und dann mit Wasser neutral ge waschen und getrocknet. Das Lösungsmittel wird aus der getrockneten Lösung verdampft; das verbleibende Öl wird in Benzol gelöst und aus diesem Lösungs mittel an säuregewaschenes Aluminiumoxyd adsor- biert. Das Adsorbat wird mit Äther-Petroläther und darauf mit Gemischen aus Äther und Chloroform mit zunehmendem Chloroformgehalt eluiert. Die 4 : 6 Äther-Chloroformeluate werden vereinigt und zur Trockne eingedampft;
der Rückstand ergibt nach Umkristallisieren aus Äthylacetat-Ather 16a-Methyl- 1,4-pregnadien-17a,21-diol-3,11,20 - trion - 21- acetat. F. = 208-212 .