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Verfahren zur Herstellung neuer #1,4-16α-Methylsteroide
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Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man in beliebiger Reihenfolge eine Verbindung der allgemeinen Formel
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worin Rl - R5 die oben angegebene Bedeutung haben, in an sich bekannter Weise auf biochemischem Wege am Kohlenstoffatom 11 bzw. 14 hydroxyliert, wonach man gegebenenfalls das in 11-Stellung eingeführte Hydroxyl in ebenfalls an sich bekannter Weise zur Oxogruppe weiteroxydiert, ferner durch Be-
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21-ständigen Hydroxyls unterwirft.
Für die biochemische Hydroxylierung der Ausgangsstoffe kann man z. B. Curvularia lunata, Mutante NRRL Nr. 2380, verwenden.
Als Oxydationsmittel für die eventuelle Weiteroxydation einer 11α- oder 11ss-ständigen Hydroxyl- gruppe eignet sich beispielsweise N-Brom-acetamid.
Als in 1, 2-Stellung dehydrierend wirkende Mikroorganismen kann man z. B. Bacillus lentus, Mutante MB Nr. 284, oder Corynebacterium simplex, Mutante ATCC Nr. 6946, verwenden.
Zur Acylierung des 21-ständigenHydroxyls kommen insbesondere Essigsäure und niedere aliphatische Carbonsäuren bzw. deren reaktionsfähige Säurederivate in Frage. Die neuen Verbindungen besitzen grosse therapeutische Bedeutung für die Behandlung entzündlicher Erkrankungen.
Nebenwirkungen, wie z. B. eine Beeinflussung des Mineralstoffwechsels, sind trotz der den Mineralocorticoiden nahestehenden Struktur ausserordentlich gering.
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<tb>
<tb>
Verbindung <SEP> Granulomtest <SEP> % <SEP> der <SEP> Wirkung <SEP> auf <SEP> den <SEP> Na/KWD <SEP> 50 <SEP> in <SEP> mg <SEP> Quotienten, <SEP> die <SEP> von <SEP> 10 <SEP> y
<tb> Desoxycorticosteron <SEP> ausgeübt
<tb> lokal <SEP> p. <SEP> o. <SEP> wird, <SEP> bei <SEP> einer <SEP> der <SEP> WD <SEP> 50 <SEP> im <SEP>
<tb> Granulomtest <SEP> entsprechenden
<tb> Dosierung
<tb> Hydrocortisonacetat <SEP> 0, <SEP> 055 <SEP> 3,8 <SEP> 45%
<tb> Dexamethason <SEP> 0,0065 <SEP> 0, <SEP> 08 <SEP> 7 <SEP> ífl/o <SEP>
<tb> Fluorhydrocortisonacetat <SEP> 0,01 <SEP> 0,14 <SEP> 145%
<tb> 16 <SEP> ct-Methyl-1, <SEP> 4-pregna- <SEP>
<tb> dien-llss, <SEP> 21-diol- <SEP>
<tb> -3,20-dion <SEP> 0,01 <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP> 30% <SEP>
<tb> 6 <SEP> a-Fluor-16a-methyl-
<tb> - <SEP> 1, <SEP> 4-pregnadien- <SEP>
<tb> -lié, <SEP> 21-diol-
<tb> -3,20-dion <SEP> 0,01 <SEP> 0,
<SEP> 02 <SEP>
<tb>
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ren bewirkt.
Beispiel 1 : a) Herstellung von 16a-Methyl-4-pregnen-llss, 21-diol-3,20-dion (= 16α-Methylcorticosteron).
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beschickt, durch halbstündiges Erhitzen auf 1200C sterilisiert und nach dem Abkühlen mit einer Sporensuspension von Curvularia lunata beimpft, die durch Abschwemmen einer 7-tägigen Maiskultur (15 g Mais) mit etwa 100 ml physiologischer Kochsalzlösung erhalten wurde.
Nach 2-tägiger Vermehrung bei 25 C unter Rühren (220 Umdr/min) und Blüftung (1,65 m3/h) wurden 1, 8 1 der erzeugten Kultur unter sterilen Bedingungen entnommen und in einen gleich grossen Fermenter mit 28,2 l einer Nährlösung aus
4, 4% Glucose (Stärkezucker)
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überführt.
Nach 24stündiger Anzucht unter Rühren und Belüften wie oben wurden 7,5 g 16α-Methyl-desoxycor- ticosteron in 200 ml Äthanol zugesetzt und unter gleichen Bedingungen 28 h fermentiert.
Der Verlauf der Fermentation wurde durch Entnahme von Proben überprüft, die mit Methylisobutylketon extrahiert wurden. Die Extrakte wurden papierchromatographisch im System Dioxan + Toluol/Propylenglykol analysiert.
Nach beendeter Fermentation (28 h) wurde die Kulturbrühe über eine grosse Nutsche abgesaugt. Der Mycelrückstand wurde mehrmals mit Wasser gewaschen. Das Filtrat extrahiert man mit dreimal 10 1 Methylisobutylketon. Der Extrakt wurde in einem Umlaufverdampfer im Vakuum eingeengt und im Rundkolben unter Vakuum vorsichtig zur Trockne eingedampft. Den Rückstand kristallisiert man aus Aceton/ Isopropyläther um.
Fp. = 157 - 158 C (Fermentationsausbeute 60%).
Reinproduktausbeute mit Zweitkristallisaten und Chromatographieren der Mutterlaugen an Silikagel : 53% d. Th.
Analyse : C22H32O4 (MG 360,5) #240 = 15 400
Berechnet : C = 73, 3% H = 9, CJ1/0 0 = 17,7%
Gefunden : C = 73, 1% H = 9, 2% 0 = 17, 2%. b) Herstellung von 16a-Methyl-1, 4-pregnadien-llss, 21-diol-3,20-dion (= 16a-Methyl-l-dehydro- - corticosteron).
Ein Fermenter aus rostfreiem Stahl mit 50 1 Fassungsvermögen wurde mit 30 l einer Nährlösung aus 1% Glucose und 0, 21o Cornsteep beschickt und wie unter Beispiel 1 a) sterilisiert. Man beimpfte mit einer Bakteriensuspension von Corynebacterium simplex, die durch Abschwemmen einer Bouillonagar-Oberfläche von 64 cm2 mit 7 ml physiologischer Kochsalzlösung erhalten wurde.
Nach 24stündiger Vermehrung unter den Bedingungen des Beispiels 1 a) wurden 1, 8 l der erzeugten Kultur unter sterilen Bedingungen entnommen und in einen Fermenter mit 28, 21 des gleichen Mediums überführt. Zur gleichen Zeit versetzte man mit einer Lösung von 7, 5 g 16α-Methyl-corticosteron aus Beispiel 1 a) in 150 ml Äthanol und fermentierte unter gleichen Bedingungen 16 h bei 25 C.
Der Verlauf der Fermentation (14 h) wurde wieder durch Entnahme von Proben überprüft, die mit
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Durch Chromatographieren der Mutterlaugen wurden zusätzlich 2 g erhalten (Gesamtausbeute = 87% d. Th.).
Analyse : CO (MG 358, 48) cm 242 = 15 100
Berechnet : C = 73, 75% H = 8, 4% 0 = 17, 85%
Gefunden : C = 73, 7% H = 8, 9% 0 = 18, 0% c) Herstellung von 16α-Methyl-1, 4-pregnadien-llss, 21-diol-3,20-dion-21-acetat (= 16a-Methyl- - l-dehydro-corticosteron-21-acetat).
500 mg 16α-Methyl-1-dehydro-corticosteron aus Beispiel 1 b) wurden in 3 ml Pyridin mit 1. 5 ml Acetanhydrid 2 h bei Zimmertemperatur stehen gelassen und danach in 20 ml 8% igue Schwefelsäure bei 00C eingerührt. Nach 1 h wurde das kristalline Produkt abgesaugt, mit Wasser gewaschen und getrocknet.
Man erhielt 558 mg Rohprodukt, das aus wenig Äthanol umkristallisiert wurde. Ausbeute 492 mg (87% d. Th.)
Fp. = 204 - 205 C.
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CBeispiel 2 :
5 a) Herstellung von 16et-Methyl-4-pregnen-21-ol-3, 11,20-trion.
2 g 16α-Methyl-corticosteron aus Beispiel 1 a) wurden in 120 ml Aceton (96%ig) gelöst, mit 1,4 g
N-Bromacetamid versetzt und 3 h bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Man rührte in 600 ml Wasser ein und extrahierte viermal mit je 100 ml Methylenchlorid. Der Extrakt wurde neutral gewaschen, über
Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand (2, 1 g) wurde an Silikagel chroma-
10 tographiert. Mit CHCl : CHCL (l : l) und CHCl wurden 1, 4 g rohe 11-Keto-Verbindung eluiert. Man erhielt nach Umkristallisieren aus Chloroform-isopropyläther 900 mg l44% d. Th.).
Fp. = 176/179 - 181 C.
Analyse : C HO (MG 358, 5) #237 = 15120
Berechnet :C=73,7%H=8,4%O=17,9%
15 Gefunden : C = 71,7% H = 8,5% O = 17,6%. b) Herstellung von 16α-Methyl-1,4-pregnadien-21-ol-3,11,20-trion aus 16et-Methyl-4-pregnen- - 21-ol-3, 11,20-trion.
16a-Methyl-4-pregnen-21-ol-3, 11@20-trion aus Beispiel 2 a) wurde, wie in Beispiel 1 b) beschrie- ben, mit Corynebacterium simplex dehydriert und lieferte 16a-Methyl-1, 4-pregnadien-21-ol-3, 11,20-
20 = trion, das mit dem gemäss Beispiel 2 c) hergestellten Produkt identisch war. c) Herstellung von 16et-Methyl-1, 4-pregnadien-21-ol-3,11, 20-trion aus 16a-Methyl-1, 4-pregna- dien-11ss,21-diol-3, 20-dion.
1 g 16α-Methyl-1-dehydrocorticosteron (s. Beispiel lb) wurde in 60 ml 96% igem Aceton mit 720 mg
N-Bromacetamid 3 h, wie in Beispiel 1 b) angegeben, oxydiert und aufgearbeitet. Man erhielt 1, 2 g 25 Rohprodukt, das nach chromatographischer Reinigung über Silikagel und Umkristallisieren aus Essigester/
Hexan 430 mg (43% d. Th. ) reine 11-Keto-Verbindung ergab.
Fp. = 160/161 - 163 C.
Analyse : C22H28O4 (MG 356,46) #237 = 15 120
Berechnet :C=74,2%H=7,9%O=17,9% 30 Gefunden : C = 73,5% H = 8,2% O = 17,8%. d) Herstellung von 16α-Methyl-1,4-pregnadien-21-ol-3, 11,20-trion-21-acetat.
550 @g 16α-Methyl-1-dehydrocorticosteron-21-acetat aus Beispiel 1 c) wurden in 92 ml 96% igem
Aceton gelöst, mit 1, 1 g N-Bromacetamid 3 h bei Zimmertemperatur, wie in Beispiel 1 b) angegeben, oxydiert und aufgearbeitet. Man erhielt 550 mg Rohprodukt, das an Silikagel chromatographiert wurde.
35 Die Methylenchlorideluate lieferten 390 mg kristalline Substanz, die nach Umkristallisieren aus wenig Äthanol 286 mg Reinprodukt ergaben.
Fp. = 207/209-2100C.
Analyse : C24H30O5 (MG 398, 5) é237 = 14820
Berechnet : C = 72, 3% H = 7,6% O = 20,1% 40 Gefunden : C=71, 6% H = 7,9% O = 20,1%.
Beispiel 3 : a) Herstellung von 16α-Methyl-4-pregnen-14α, 21-diol-3,20-dion.
Ein Fermenter aus rostfreiem Stahl mit 501 Fassungsvermögen wurde mit 301 einer Nährlösung aus
5% Saccharose 45 1% Rübenzuckermelasse
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0, 5% Cornsteepliquor (PH = 7) beschickt, durch halbstündiges Erhitzen auf 1200C sterilisiert und nach dem Abkühlen mit einer Sporensuspension von Curvularia lunata beimpft, die durch Abschwemmen einer 7tägigen Maiskultur (15 g Mais) mit etwa 100 ml physiologischer Kochsalzlösung erhalten wurde.
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Nach 2tätiger Vermehrung bei 25 C unter Rühren (220 Umdr/min) und Belüftung (1, 65 m3/h) wurden 1, 8 1 der erzeugten Kultur unter sterilen Bedingungen entnommen und in einen 50 l-Fermenter mit 30 l einer Nährlösung aus
5% Saccharose
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5-Methyl-4-pregnen-21-ol-3,20-dion in 200 ml Äthanol zugesetzt und 28 h unter gleichen Bedingungen fermentiert.
Der Verlauf der Fermentation wurde durch Entnahme von Proben überprüft, die mit Methylisobutyl- keton extrahiert wurden. Die Extrakte wurden papierchromatographisch im System Dioxan + Toluol/Propylenglykol analysiert.
Nach beendeter Fermentation wurde die Kulturbrühe abgesaugt und mit Methylisobutylketon extrahiert. Der Extrakt wurde im Vakuum eingedampft und der Rückstand über Silikagel chromatographisch in die 11ss- und 14α-hydroxylierte Verbindung aufgetrennt. Die Fraktionen mit 16a-Methyl-4-pregnen- - 14a, 21-diol-3, 20-dion wurden als Rohprodukt acetyliert :
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abgesaugt, mit Wasser gewaschen, getrocknet und dann aus Isopropyläther umkristallisiert. Ausbeute 1, 7 g.
F. = 192/193-194 C.
Analyse : C HOg (MG 402, 5) e = 15200
Berechnet : C = 71, 71o H = 8, 5% 0 = loo
Gefunden : C = zo H = 9, 0% 0 = 20, 1%. b) Herstellung von 16α-Methyl-14-pregnadien-14α,21-diol-3,20-dion.
16α-Methyl-4-pregnen-14α,21-diol-3, 20-dion wird, wie in Beispiel 1 b) beschrieben, mit Corynebacterium simplex dehydriert und liefert 16a-Methyl-1, 4-pregnadien-14a, 21-diol-3, 20-dion.
Beispiel 4 : a) Herstellung von 16α-Methyl-6α-chlor-4-pregnen-11ss,21-diol-3,20-dion.
16α-Methyl-6α-4-pregnen-21-ol-3,20-dion wird, analog wie in Beispiel 1 a) beschrieben, in llss-Stellung hydroxyliert. Das hiebei als Ausgangsmaterial dienende, bisher nicht beschriebene 16a-Methyl-6α-chlor-4-pregnen-21-ol-3, 20-dion (Fp. = 171 - 173 C, 21-Acetat: Fp. = 144-145, 5C) wird aus 16a-Methyl-5-pregnen-3ss-ol-20-on-acetat durch Addition von Chlor an die 5- bis 6-Doppelbindung, Verseifung der 3-Acetoxygruppe, Bromierung des 21ständigen Methyls, Umsetzung des eingeführten 21=Bromatoms mit Kaliumacetat, Oxydation des 3ständigen Hydroxyis zur Ketogruppe, schliessliche Abspaltung von Chlorwasserstoff und gewünschtenfalls Verseifung der 21-Acetoxygruppe gewonnen. b) Herstellung von 16α-Methyl-6α-chlor-1,4-pregnadien-11ss,21-diol-3,20-dion.
16α-Methyl-6α-chlor-4-pregnen-11ss,21-diol-3,20-dion wird, wie in Beispiel 1 b) beschrieben, mit Corynebacterium simplex dehydriert und liefert 16α-Methyl-6α-chlor-1,4-pregnadien-11ss,21-diol -3,20-dion.
Beispiel 5 : a) 16α-Methyl-6α-fluor-4-pregnen-11ss, 21-diol-3,20-dion.
16α-Methyl-6α-fluor-4-pregnen-21-ol-3,2-dion-21-acetat (Fp. = 132/134-138 C, UV e = 15 000) wird nach vorstehender Fermentationsmethode (Beispiel 1 a) mit Curvularia lunata in 118 -Stel- lung hydroxyliert, wobei gleichzeitig die 21-Acetatgruppe verseift wird.
Das hiebei als Ausgangsmaterial dienende, bisher nicht beschriebene 16α-Methyl-6α-fluor-4-pregnen-21-ol-3,20-dion-21-acetat wird aus 16α-Methyl-5-pregnen-3ss,21-diol-20-on-21-acetat (Fp. = 152-1540C) durch Addition von Bromfluor (aus N-Bromacetamid und Fluorwasserstoff) an die 5-bis 6-Doppelbindung, Oxydation der 3ssHydroxylgruppe mit Chromsäure, Einführung der 4-Doppelbindung durch Abspaltung von Bromwasserstoff und saure Isomerisierung des 6ss-Fluorsubstituenten zum 16α-Methyl-6α-fluor-4-pregnen-21-ol-3,20- - dion-21-acetat dargestellt.
Durch chromatographische Reinigung an Silikagel wird das 16α-Methyl-6α-fluor-4-pregnen-11ss,21- - diol-3, 20-dion isoliert und aus Essigester umkristallisiert. Fp. = 166/1670C, E = 14400.
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b) 16α-Methyl-6α-fluor-4-pregnen-11ss,21-diol-3,20-dion-21-acetat.
Durch Umsetzung mit Acetanhydrid in Pyridin bei Zimmertemperatur wurde wie in Beispiel 1 c) das
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Wie in Beispiel 1 b) wird 16α-Methyl-6α-fluor-4-pregnen-11ss,21-diol-3,20-dion mit Corynebacterium simplex dehydriert. Der Extraktionsrückstand wird über Silikagel chromatographiert und liefert nach Umkristallisation aus Methylenchlorid/Isopropyläther 16α-Methyl-6α-fluor-1,4-pregnadien- - llss, 21-diol-3, 20-dion.
Fp. = 18 0/181-182'C, E 15 320.
Beispiel 6 : a) 16α-Methyl-6α-fluor-4-pregnen-14α,21-diol-3,20-dion.
Aus den gemäss Beispiel 5 a) erhaltenen Mutterlaugen wird durch nochmalige chromatographische Auftrennung 16α-Methyl-4-pregnen-14α,21-diol-3,20-dion isoliert. Nach Umkristallisieren aus Essig-
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c235 = 14000.16α-Methyl-6α-fluoro-4-pregnen-14α,21-diol-3,20-dion wird, wie unter Beispiel 1 c) beschrieben, acetyliert und aus Äthanol/Isopropyläther umkristallisiert.
Fp. = 179/180-182 C, e6 = 14400. c) 16α-Methyl-6α-fluor-1,4-pregnadien-14α,21-diol-3,20-dion.
Analog der Verfahrensweise des Beispiels 1 b) wird 16α-Methyl-6α-fluor-4-pregnen-11ss, 21-diol- - 3, 20-dion mit Corynebacterium simplex dehydriert. Der Extraktionsrückstand wird über Silikagel chromatographiert und ergibt nach Umkristallisieren aus Essigester 16α-Methyl-6α-fluor-1,4-pregnadien- -14α,21-diol-3,20-dion.
Fp. = 241/242 - 243 C, #242 = 16500. d) 16α-Methyl-6α-fluor-1,4-pregnadien-14α,21-diol-3,20-dion-21-acetat, 16α-Methyl-6α-fluor-1,4-pregnadien-14α,21-diol-3,20-dion wird, wie in Beispiel 1 c) beschrie- ben, acetyliert und aus Essigester umkristallisiert.
Fp. = 220/223 - 236 , #241 = 15500.
Beispiel 7 : a) 16α-Methyl-1,4-pregnadien-14α,21-diol-3,20-dion.
Analog Beispiel 1 b) werden 301 einer sterilen Nährlösung aus 0, 1% Hefeextrakt, 0,5% Cornsteepliquor und 0,2go Glucose mit einer Bakteriensuspension von Bacillus lentus, Mutante MB Nr. 284, beimpft. Nach 24stündiger Vermehrung werden 1,81 dieser Kulturbrühe zu 28,21 eines sterilen Mediums gleicher Zusammensetzung überführt. Zu gleicher Zeit werden 7, 5. g 16α-Methyl-4-pregnen-14α,21-diol-3,20- - dion in 150 ml Äthanol zugesetzt und 30 h bei 25 C fermentiert. Die Kulturbrühe wird, wie in Beispiel 1 b) beschrieben, aufgearbeitet, wobei man 5, 2 g kristallines Rohprodukt erhält, das aus Essigester umkristallisiert wird.
Man erhält dabei 3, 7 g vom Fp. 242/244-246 C.
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CGefunden : C = 73,6% H = 8,5% O = 18,5%. b) 16α-Methyl-1,4-pregnadien-14α,21-diol-3,20-dion-21-acetat.
320 mg 16α-Methyl-14,-pregnadien-14α,21-diol-3,20-dion werden in 3 ml Pyridin mit 1, 5 ml Essigsäureanhydrid 2 h bei Zimmertemperatur, wie unter Beispiel 1 c) beschrieben, acetyliert und aufgearbeitet. Das Rohprodukt wird aus Essigester umkristallisiert.
Fp. = 208/209 - 210 C.
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C24HsGefunden :C=71,96%H=9,97%O=19,95%.
Beispiel 8 :
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a-Methyl-9a-fluor-4-pregnen-llss, 21-diol-3, 20-dion.Methylisobutylketonextraktes wird an Silikagel chromatographiert und ergibt aus den Chloroform/Essig- ester- (2 : l)-eluaten die llss-Hydroxylverbindung, die als Rohprodukt für die weitere Dehydrierung verwendet wird.
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b) 16α-Methyl-9α-fluor-1,4-pregnadien-11ss,21-diol-3,20-dion.
16α-Methyl-9α-fluor-4-pregnen-11ss,21-diol-3,20-dion aus Beispiel 8 a), als Rohprodukt eingesetzt, wird, wie in Beispiel 7 a) beschrieben, mit Bacillus lentus 30 h fermentiert und aufgearbeitet. Der Rückstand des Methylisobutylketonextraktes liefert 16α-Methyl-9α-fluor-1,4-pregnadien-11ss,21-diol- - 3, 20-dion (Rohprodukt). c) 16α-Methyl-9α-fluor-1,4-pregnadien-11ss,21-diol-3, 20-dion-21-acetat.
16α-Methyl-9α-fluor-1,4-pregnadien-11225,21-diol--3,20-dion werden als Rohprodukt, wie in Bei- spiel 1 c) beschrieben, acetyliert und aufgearbeitet. Das erhaltene Rohacetat wird aus Isopropyläther/
Methylchlorid umkristallisiert.
Fp. = 220 - 2261) C, UV #@@@ = 15600.
Beispiel 9 :
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Der Verlauf der Fermentation wird durch Entnahme von Proben überprüft, die mit Methylisobutylketon extrahiert werden. Die Extrakte werden papierchromatographisch im System Dioxan/Toluol/Propy- lenglykol analysiert.
Nach beendeter Fermentation (28 h) wird die Kulturbrühe über eine grosse Nutsche abgesaugt. Der Mycelrückstand wird mehrmals mit Wasser gewaschen und das Filtrat mit 3 X 10 l Methylisobutylketon extrahiert. Der Extrakt wird anschliessend in einem Umlaufverdampfer im Vakuum eingeengt und im Rundkolben vorsichtig im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird an Silicagel chromato-
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(1 : 3) -Eluate4, 5 ml Acetanhydrid 3h bei Zimmertemperatur stehen gelassen und anschliessend in 60ml80/0ige eiskalte Schwefelsäure eingerührt. Der ausgefallene Niederschlag wird abgesaugt und nach dem Trocknen aus Essigester umkristallisiert.
Das in etwa 90% figer Ausbeute erhältliche Reinprodukt schmilzt bei 229/232 bis 2400C (Zers.) ; zoop = +133,8 (CHCl3): #233 = 16 000.
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9a-difluor-1, 4-pregnadien-lIss, 21-diol-3. 20-dion.(Zers.)] wird mit Bacillus lentus, Mutante MB 284, in 1, 2-Stellung dehydriert, wobei gleichzeitig die 21-Acetatgruppe verseift wird.
Hiezu wird ein Fermenter aus rostfreiem Stahl mit 50 1 Fassungsvermögen mit 30 1 Nährlösung aus 0, 1% Hefeextrakt, 0, 5% Cornsteepliquor und 0, 2% Glucose beschickt und durch halbstündiges Erhitzen auf 1200C sterilisiert ; nach dem Abkühlen wird mit einer Bakteriensuspension von Bacillus lentus MB 284 beimpft.
Nach 24stündiger Vermehrung bei 280C und unter Rühren (220 Umdr/min) und Belüften (1, 65 m3/h) werden 1, 8 1 der erzeugten Kultur unter sterilen Bedingungen entnommen und in einen gleich grossen Fer- menter mit 28 l der gleichen sterilisierten Nährlösung überführt.
Gleichzeitig werden 6 g 16α-Methyl-6α,9α-difluor-4-pregnen-11ss,21-diol-3,20-dion-21-acetat in 200 ml Dimethylformamid zugesetzt und unter gleichen Bedingungen 50 h fermentiert.
Der Verlauf der Fermentation wird durch Entnahme von Proben überprüft, die mit Methylisobutylketon extrahiert werden. Die Extrakte wurden dünnschichtchromatographisch (System Benzol/Essigester 4 : 1) analysiert.
Durch Aufarbeitung analog Beispiel 10 a) erhält man einen ölig-kristallinen Rückstand, der an Silicagel chromatographiert wird. Mit Essigester-Chloroform 1 : 2 wird das 16a-Methyl-6a, 9a-difluor-1, 4- - pregnadien-llss, 21-diol-3, 20-dion extrahiert, das aus Essigester/Äther umkristallisiert wird und dann
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60%);eEssigsäureanhydrid bei Zimmertemperatur analog Beispiel 10 b) acetyliert und aufgearbeitet. Nach Umkristallisieren aus Essigester erhält man 160 mg vom Schmelzpunkt 259/260-261 C; E237 = 16500.
Das als Ausgangsprodukt dienende, bisher nicht beschriebene. 16a-Methyl-6a, 9a-difluor-4-pregnen- - 21-ol-3, 20-dion-21-acetat kann aus 16α-Methyl-6α-fluor-4-pregnen-11α,21-diol-3,20-dion-21-ace- tat durch Dehydratisierung der lIa-Hydroxygruppe zur entsprechenden A'"-Verbindung und anschlie- ssende Anlagerung von Fluorwasserstoffsäure in Pyridin an die entstandene 9, 11-Doppelbindung erhalten werden.
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