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Verfahren zur Herstellung von Dehydroverbindungen der Steroidreihe
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Dehydrov erbindungen der
Steroidreihe, die in 1(2)-und 4(5)-Stellung eine Doppelbindung aufweisen.
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Das in der Patentschrift 956952 beschriebene Verfahren zur Herstellung
von Oxydationsprodukten der Steroidreihe betrifft den biochemischen Abbau der Seitenkette
von Pregnanverbindungen zu Androstanverbindungen und gegebenenfalls Aufspaltung
des Ringes D, wobei gleichzeitig in 1(2)- und gegebenenfalls in 4(5)-Stellung eine
Doppelbindung eingeführt wird. Auf diesem Wege läßt sich z. B. das Progesteron,
wie auch 45-3ß-Oxy-20-oxo-pregnen, 11-Desoxycorticosteron oder 3,20-Dioxoallopregnan,
in einer Verfahrensstufe in A1(4)-3,17-Dioxoandrostadien bzw. 1(2)-Dehydrotestolacton
überführen. Ähnliche mikrobiologische Reaktionen, bei denen im Ring A von Steroiden
eine Doppelbindung eingeführt wird, sind von Perlman et a1., J. Am. Chem. Soc.,
75, S. 5764 f., (1953), beschrieben worden.
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Es wurde nun gefunden, daß in Steroidverbindungen, insbesondere der
Pregnanreihe, die 1(2)- und bzw. oder die 4(5)-ständige Doppelbindung ohne Seitenkettenabbau
oder Ringaufspaltung auf biochemischem Wege eingeführt werden kann, wenn man in
1(2)- und bzw. oder in 4(5)-Stellung gesättigte Steroidverbindungen der aeroben
Einwirkung von Enzymen von Didymella lycopersici, Calonectria decora, Alternaria
passiflorae, Ophiobolus heterostrophus, oder Ophiobolus Miyabeanus unterwirft.
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Die als Ausgangsstoffe verwendeten Steroidverbindungen sind z. B.
Abkömmlinge des Spirostans, Allospirostans, Furostans, Allofurostans, Cholans,Allocholans,
Pregnans, Allopregnans, Androstans und Testans und weisen vorzugsweise in 3-Stellung
eine freie oderfunktionell abgewandelte Oxy- oder Oxogruppe auf. Sie können gesättigt
sein oder Doppelbindungen enthalten, z. B. in 1- oder 4-Stellung, ferner in 5-,
6-, 7-, 8-, 9 : 11-, 14- oder 16-Stellung, oder zusätzliche Substituenten besitzen,
wie freie oder abgewandelte Oxy-, Oxo- oder Carboxylgruppen, ferner Epoxygruppen
oder Halogenatome, beispielsweise in 6-, 7-, 8-, 9-, 11-, 12-, 14-, 15-, 16-, 17-,
18-, 20-, oder 21-Stellung oder Methylgruppen, z. B. in 17a- oder 17ß-Stellung.
Die obengenannten Ausgangsstoffe sind von beliebiger sterischer Konfiguration und
können auch als Racemate vorliegen. Sie umfassen auch solche der sogenannten Nor-
und/oder Homo-Reihen, insbesondere 19-Nor- und D-Homo-Verbindungen. Besonders wichtige
Ausgangsstoffe sind Verbindungen der Pregnanreihe, die in 3- und 20-Stellung freie
oder funktionell abgewandelte Oxy- oder Oxogruppen enthalten, z. B. Progesteron,
11-Dehydro-progesteron, 11-, 12-, 14-, 15-, 16-, 17- oder 18-Oxy-progesterone, d5-
oder 44-Pregnen-3-ol-20-one, 4 5-Pregnen-3,20-diole, 11-Desoxycorticosteron (Cortexon,
44-3,20-Dioxo-21-oxy-pregnen), Cortison (44-3,11,20-Trioxo-17a,21-dioxy-pregnen),
Hydrocortison (44-3,20-Dioxo-11ß,17a,21-trioxy-pregnen), 11-Epi-hydrocortison, Aldosteron
(44-3,18,20-Trioxo-11ß,21-dioxy-pregnen), 18-Oxy-corticosteron, 11-Epi-18-oxy-corticosteron,
18-Oxo- corticosteron, 17a- Oxy- aldosteron, 18 - Oxyhydrocortison, 18-Oxy- und
18-Oxo-cortison, 18-Oxy-und 18-Oxocortexon, Substanz S (Reichstein), 18-Oxy- und
18-Oxo-Substanz S (R e i c h s t e i n), entsprechende statt in 4- in 1-Stellung
ungesättigte Verbindungen, Pregnan-3,20-dion, Pregnan-3-ol-20-on, Allopregnan-3,20-dion,
Pregnan- und Allopregnan-3,11,20-trion-17a,21-diol, Pregnan- und Allopregnan-3,20-dion-11ß,17a,21-triol,
Pregnan- und Allopregnan-3,18,20-trion-11ß,21-diol, Pregnan- und Allopregnan-3,20-dion-llß,18,
21-triol, Pregnan- und Allopregnan-3,20-dion-18,21-diol, die entsprechenden 21-Oxo-Verbindungen
und bzw. oder 9a-Fluor- und Chlorderivate, beispielsweise 9a-Fluorcortison, 9a-Fluor-hydrocortison,
9a-Fluor-aldosteron und 9a-Fluor-18-oxy-corticosteron, ferner in 1(2)- und bzw.
oder in 4(5)-Stellung gesättigte Androstanverbindungen, z. B. A&-
oder 4 5-Androsten-3,17-dion, Testosteron, d 5-Andostren-3-ol-17-on, Adrenosteron
(A4-3,11, 17-Trioxo-androsten), Androstan-3,17-dion, Ätiansäuren, z. B. 44- oder
45-Ätiensäuren, Alloätiansäuren, die insbesondere in 3-, 11- und bzw. oder 18-Stellung
Oxy- oder Oxogruppen aufweisen, bzw. funktionelle Derivate der genannten Verbindungen,
d. h. entsprechende Verbindungen mit funktionell abgewandelten Oxy- oder Oxogruppen.
In den Ausgangsstoffen stellt die funktionell abgewandelte Oxygruppe z. B. eine
mit einer aliphatischen, aromatischen oder heterocyclischen Carbonsäure, beispielsweise
Essigsäure,
Propionsäure, Benzoesäure oder Furancarbonsäure veresterte oder eine verätherte
Oxygruppe dar, z. B. die Tetrahydropyranyloxy-, Benzyloxy-oder Triphenylmethoxygruppe.
Die funktionell abgewandelte Oxogruppe ist vorteilhaft eine ketalisierte Oxogruppe,
abgeleitet insbesondere von einem zweiwertigen Alkohol, wie die Äthylendioxygruppe.
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Die genannten Ausgangsstoffe werden verfahrensgemäß mit Enzymen von
Didymella lycopersici, Calonectria decora, Alternaria passiflorae, Ophiobolus heterostrophus
oder Ophiobolus Miyabeanus in Reaktion gebracht. Für ihre Gewinnung eignen sich
Kulturen dieser Pilze in an sich hierfür bekannten Medien, z. B. solche mit Zuckern,
wie Glucose oder Lactose, mit Peptonen, Maisquellwasser, Sojaprodukten u. dgl.,
sowie mit Mineralsalzen, oder aber synthetische Nährlösungen. Man arbeitet insbesondere
unter aeroben Bedingungen, beispielsweise in Schüttelkultur oder bei untergetauchtem
Wachstum unter Rühren und Luftzufuhr. Die genannten Pilze unterscheiden sich von
anderen Mikroorganismen, z. B. den Bakterien, durch gutes Wachstum unter verhältnismäßig
einfachen Zuchtbedingungen. Die verfahrensgemäße Reaktion findet in der beschriebenen
Pilzkultur bzw. mit Hilfe der darin enthaltenen, gegebenenfalls angereicherten oder
abgetrennten Enzyme statt, im einfachsten Fall also in einer Aufschwemmung des abgetrennten
Pilzmycels, des homogenisierten Pilzmycels oder in Filtraten bzw. wasserhaltigen
Extraloten davon.
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Die Isolierung der Verfahrensprodukte läßt sich nach bekannten Methoden
vornehmen. Ihre Abtrennung kann z. B. durch Extraktion des Reaktionsgemisches mit
einem organischen Lösungsmittel, z. B. Methylenchlorid oder Essigester, erfolgen.
Für die weitere Reinigung des so erhaltenen Extraktes eignen sich besonders Chromatographie,
z. B. an Aluminiumoxyd oder Kieselsäuregel, Anwendung von Verteilungsmethoden, z.
B. dem Gegenstromverfahren, oder die Trennung mittels Girard-Reagenzien, wie Trimethylammonium-
oder Pyridiniumessigsäurehydrazid. Anschließend an die Reinigung oder an ihrer Stelle
wird schließlich vorzugsweise aus organischen oder wäßrig-organischen Lösungsmitteln
umkristallisiert.
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Durch Einführung der 1(2)- und bzw. oder 4(5)-ständigen Doppelbindung
gelangt man zu wertvollen Heilmitteln der Steroid-, insbesondere der Pregnanreihe,
die sich, verglichen mit den in 1(2)-Stellung gesättigten, therapeutisch wirksamen
Verbindungen durch eine gesteigerte Wirksamkeit auszeichnen. Von den Verfahrensprodukten
sind insbesondere zu nennen das ._l1(4)-3,11, 20 - Trioxo-17a,21- dioxy-pregnadien,
Al(4) - 3,20-Dioxol 1ß,17a,21-trioxy-pregnadien,A 1(4)-3,11,20-Trioxo-21-oxypregnadien,
41(4)-3,20-Dioxo-llß,21-dioxy-pregnadien, 41(4)-3,20-Dioxo-17a,21-dioxy-pregnadien,
41(4)-3,20-Dioxo-21-oxy-pregnadien, J 1(4)-3,18,20.Trioxo-1lß,21-dioxypregnadien,
A1(4)-3,11,18,20-Tetraoxo-21-oxy-pregnadien, 41(4)-3,20-Dioxo-llß,18,21-trioxy-pregnadien,
.'1(4)-3,18, 20-Trioxo-llß,17a,21-trioxy-pregnadien, 4147-3,11,18, 20-Tetraoxo-17a,21-dioxy-pregnadien,
A1(4)-3,20-Dioxo-1lß,17a,18,21 - tetraoxy - pregnadien, 4 i(4) - 3,20-Dioxo-18,21-dioxy-pregnadien,
410)-3,18,20-Trioxo-21-oxypregnadien, d1(4)-3,20-Dioxo-17a,18,21-trioxS--pregnadien,
41(4)-3,18,20-Trioxo-17a,21-dioxy-pregnadien, die entsprechenden 21-Oxo- sowie 21-Desoxy-verbindungen,
ferner entsprechende funktionelle Derivate, wie Ester, Äther, Halogen-Derivate,
z. B. 9a-Halogen-, insbesondere die Fluor- oder Chlorverbindungen. Sofern die Verfahrensprodukte
nicht die Konfiguration und die Substituenteir von therapeutisch verwendbaren Steroiden
aufweisen, können sie als Zwischenprodukte zu deren Herstellung, z. B. der obengenannten
Verbindungen dienen. Die verfahrensgemäß erhältlichen Umsetzungsprodukte lassen
sich in an sich bekannter Weise in ihre funktionellen Derivate, wie Sauerstoff-,
Schwefel- oder Stickstoffderivate, beispielsweise Ester, Äther, Enolester, Enoli
äther, Ketale, Thioäther und Thioketale, ferner Hydrazone, Oxime und Enamine überführen.
In diesen Verbindungen können die Oxy- und;'oder Oxogruppen vollständig oder teilweise
funktionell abgewandelt sein.
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In den Estern und Enolestern sind die Säurereste solche beliebiger
organischer und anorganischer Säuren, wie aliphatischer, alicyclischer, araliphatischer,
aromatischer oder heterocyciischer Carbon-, Thioncarbon-, Thiolcarbon-oder Sulfonsäuren,
vorzugsweise der Ameisensäure, Essigsäure, Chloressigsäuren, Trifluoressigsäure,
Propionsäure, Buttersäuren, Valeriansäuren, Diäthylessigsäure, Capronsäuren, Oenanthsäuren,
Caprylsäuren, Palmitinsäuren, Crotonsäure, Undecansäure, Undecylensäure, Oxalsäure,
Bernsteinsäure, Pimelinsäure, Maleinsäure, Milchsäure, Carbaminsäuren, Alkoxycarbonsäuren,
(3-Cyclopentylpropionsäure, Hexahydrobenzoesäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure,
Cyclohexylessigsäure, Phenylpropionsäuren, Trimethylgallussäure, Phthalsäure, Furan-2-carbonsäure,
Isonicotinsäure, Methansulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Schwefelsäuren, Haiogenwasserstoffsäuren
oder Phosphorsäuren.
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Wenn erwünscht, lassen sich in erhaltenen Verbindungen funktionell
abgewandelte Oxy- oder Oxogruppen in freie Gruppen überführen. Auf diese Weise können
insbesondere in polysubstituierten Derivaten die funktionell abgewandelten Gruppen
auch teilweise in Freiheit gesetzt werden. Dies erfolgt z. B. durch chemische oder
enzymatische Hydrolyse, beispielsweise unter Verwendung saurer oder basischer Mittel,
durch Umesterung oder Umacetalisierung. Aus den auf diese Weise oder auch direkt
erhaltenen, nur partiell abgewandelten, wie veresterten bzw. verätherten Derivaten
lassen sich durch anschließende funktionelle Abwandlung, z. B. Veresterung oder
Verätherung, polysubstituierte Derivate, insbesondere auch gemischte Ester oder
Äther bzw. Ester-Äther, herstellen.
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Die Verfahrensprodukte können als Heilmittel oder als Zwischenprodukte
zu deren Herstellung Verwendung finden.
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Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher beschrieben.
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Beispiel 1 41 70°,.;ige Bierwürze werden in einem Schüttelgefäß sterilisiert
(pfi 5,1) und mit 150 cm" einer 2 Tage alten Schüttelkultur von Calonectria decora
in 70°;'oiger Bierwürze beimpft. Das Gefäß läßt man 24 Stunden bei 27'C schütteln,
wobei sich die Kultur gut entwickelt. Dann gibt man eine Lösung von 1 g Cortexon
(.44-3,20-Dioxo-21-oxy-pregnen) in 25 cm-; Aceton unter sterilen Bedingungen zu
und läßt weiter bei 27'C schütteln. Nach 2 Tagen wird das Mycel abgetrennt und gut
mit Wasser und Essigester gewaschen. Nach erschöpfender Extraktion der vereinigten
Filtrate mit insgesamt 41 Essigester werden die Extrakte mit Wasser gewaschen, getrocknet
und im Vakuum eingedampft. Der so gewonnene rohe Extrakt (1,1 g) wird an einer Säule
von 30 g Kieselsäuregel nach der Durchlaufmethode chromatographiert, wobei man mit
Chloroform und mit Chloroform-Aceton-Gemischen steigenden Acetongehaltes eluiert.
Die einzelnen Fraktionen (je 100 cm-") untersucht man papierchromatographisch. Die
mit Chloroform eluierten Anteile enthalten nur Verunreinigungen, während sich in
den Chloroform-Aceton-(9:1)-Fraktionen eine neue Substanz befindet, die im Papierchromatogramm
(System Propylenglykol-Toluol) etwas weniger weit als Cortexon wandert. Die Fraktionen
mit höherem Acetongehalt
enthalten nur wenig hochpolares Material.
Die die erwähnte neue Substanz enthaltenden Fraktionen vereinigt man und dampft
sie im Vakuum ein. Durch Umkristallisieren des Rückstandes aus Aceton-Petroläther-Gemischen
erhält man das reine 1-Dehydro-Cortexon vom F. 185 bis 192°C in beinahe quantitativer
Ausbeute. Diese Verbindung reduziert alkalische Silberdiamminlösung rasch und stark.
Die Analyse stimmt auf die Bruttoformel C"H"03 (berechnet C 76,79,H 8,59°/a; gefunden
C 76,67, H 8,840/0). Das UV-Spektrum der freien Verbindung zeigt eine starke Bande
mit dem Maximum bei 244 mu, (a = 14,200), dasjenige des Dinitrophenylhydrazons eine
solche bei 388 mu, (E=39,000). Die entsprechenden Banden des Cortexons liegen bei
240 mu, (c = 16,200) bzw. 378 mu, (e = 39,000).
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Eine Lösung von 40 mg 1-Dehydro-cortexon ([a]" -r-120' in C H C13)
in 2 cm3 Pyridin werden mit 2 cm" Essigsäureanhydrid versetzt und bei Zimmertemperatur
stehengelassen. Nach 16 Stunden dampft man die Lösung im Vakuum bei 30'C ein und
nimmt den Rückstand in einem Chloroform-Äther-(1:4)-Gemisch auf. Man wäscht die
Lösung je dreimal mit 0,1 n-Salzsäure, mit 2°/oiger Natriumhydrogencarbonatlösung
und mit Wasser, trocknet sie und dampft sie im Vakuum ein. Durch Umkristallisieren
des erhaltenen Rückstandes aus einem Aceton-Petroläther-Gemisch erhält man das reine
1-Dehydro-cortexon-21-acetat vom F. = 203 bis 205°C. [a]D = -h134° (CHCl3).
Beispiel 2 Verwendet man zur Dehydrierung des Cortexons statt der im Beispiel 1
beschriebenen Kultur von Calonectria decora in analoger Weise Kulturen von Alternaria
passiflorae, Ophiobolus heterostrophus oder Ophiobolus Mivabeanus, so erhält man
nach der im Beispiel 1 beschriebenen Aufarbeitung das 1-Dehydro-Cortexon in hoher
Ausbeute. Beispiel 3 Man züchtet, wie im Beispiel 1 beschrieben, in einem Schüttelgefäß
41 einer Kultur von Calonectria decora und gibt unter sterilen Bedingungen eine
Lösung von 1 g Cortison (44-3,11,20-Trioxo-17a,21-dioxy-pregnen) in 25 cm3 Methanol
zu. Das Gefäß wird darauf bei 27'C geschüttelt. Nach 4 Tagen trennt man das Mycel
ab und extrahiert das Kulturfiltrat erschöpfend mit insgesamt 31 Essigester. Die
vereinigten Extrakte werden mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft.
Der so erhaltene rohe Rückstand wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, an 30 g Silicagel
nach der Durchlaufmethode chromatographiert. Die mit Chloroform-Aceton-(6:4)-Gemischen
eluierten Anteile bestehen zur Hauptsache aus einer Substanz, die etwas polarer
ist als das Ausgangsmaterial. Diese Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum eingedampft.
Aus Aceton-Äther-Gemisclien wird das 1-Dehydro-Cortison kristallisiert. F. 231 bis
234'C. Die Substanz reduziert alkalische Silberdiamminlösung rasch und stark und
zeigt im UV-Spektrum eine starke Absorption bei 240mu.
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15,800). Durch Acetylierung mit Pyridin-Acetanhydrid erhält man das
entsprechende 21-Acetat vom F. 224 bis 230'C. In ähnlicher Weise läßt sich z. B
das Önanthat oder Undecylenat herstellen.
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Beispiel 4 Zu 41 einer gut entwickelten Kultur von Calonectria decora
gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g Hydrocortison (44-3,20-Dioxo-11ß,17a,21-trioxypregnen)
in 25 cm3 Methanol. Nach 4tägigem Schütteln bei 27°C wird, wie im Beispiel 1 beschrieben,
extrahiert und chromatographiert. Die mit Chloroform-Aceton-(1:1)-Gemischen eluierten
Anteile enthalten eine Substanz, die etwas polarer als Hydrocortison ist. Diese
Fraktionen vereinigt man und dampft sie ein. Das 1-Dehydro-hydrocortison wird aus
Methanol oder Aceton-Äther-Gemischen umkristallisiert. F.238 bis 2410C. Es reduziert
alkalische Silberdiamminlösung rasch und stark und zeigt im UV-Spektrum eine starke
Absorption bei 244 mli# (a = 15,100). Beispiel 5 In einem Erlenmeyerkolben
von 500 cm3 Fassungsvermögen werden 150 cm3 70°/oige Bierwürze sterilisiert und
mit Calonectria decora beimpft. Man läßt 2 Tage bei 27''C schütteln und gibt zu
der nun gut entwickelten Kultur unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg
Aldosteron (44-3,18,20-Trioxo-11ß,21-dioxy-pregnen) in 1,5 cm3 Aceton zu. Dann schüttelt
man bei 27'C weiter und filtriert nach 38 Stunden das Mycel ab. Das Kulturfiltrat
wird mit Essigester erschöpfend extrahiert, die Extrakte mit Wasser gewaschen, getrocknet
und eingedampft. Der Rückstand wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, an 1 g Kieselsäuregel
chromatographiert, wobei die einzelnen Fraktionen (je 20 cm3) papierchromatographisch
untersucht werden. In den mit Chloroform-Aceton-(1:1)-Gemischen eluierten Anteilen
befindet sich eine Substanz, die etwas polarer ist als Aldosteron und alkalische
Silberdiamminlösung reduziert. Sie wird aus Aceton-Äther-Gemischen kristallisiert
und stellt das 1-Dehydro-Aldosteron dar. Im UV-Spektrum zeigt sie starke Absorption
bei 244 mu,. Beispiel 6 In vierzehn Erlenmeyerkolben von 200 cm3 Fassungsvermögen
werden je 50 cm' 70°/oige Bierwürze sterilisiert und mit Calonectria decora beimpft.
Nach 2tägigem Schütteln bei 27°C haben sich die Kulturen gut entwickelt. Unter sterilen
Bedingungen gibt man zu den vierzehn Kulturen je eine der nachstehenden vierzehn
Verbindungen (je 10 mg in 0,5 cm3 Methanol gelöst) Cortexon, Cortison, Hydrocortison,
17a-Oxy-cortexon, Corticosteron (44-3,20-Dioxo-11ß,21-dioxy-pregnen), 11-Epi-corticosteron
(44-3,10-Dioxo-11 a,21-dioxy-pregnen), 11-Epi-hydrocortison, Aldosteron, 17a-Oxy-aldosteron,
Progesteron, Pregnenolon, 21-Oxy-pregnenolon, 4'-Androsten-3-ol-17-on und Androsten-3,17-dion.
Man läßt 2 Tage bei 27'C weiterschütteln und extrahiert dann die Kulturen mit Essigester.
Die papierchromatographische Untersuchung der einzelnen Extrakte zeigt, daß alle
Ausgangssubstanzen in die entsprechenden 1-Dehydro-Verbindungen übergeführt worden
sind, die gegenüber den Ausgangsstoffen ganz leicht erhöhte Polarität besitzen und
sich in ihren Spektren charakteristisch von diesen unterscheiden. Beispiel 7 Verwendet
man zur Dehydrierung der im Beispie16 genannten Substanzen statt der dort beschriebenen
Kulturen von Calonectria decora Kulturen von Alternaria passifiorae Ophiobolus heterostrophus
oder Ophiobolus Miyabeanus, so zeigt die papierchromatographische Untersuchung der
Extrakte die gleichen Umsetzungsprodukte, wie sie im Beispiel 6 beschrieben sind.
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Beispiel 8 Zu 41 einer gut entwickelten Kultur von Calonectria decora
gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g 3,11,20-Triketo-17a,21-dioxy-allopregnan
in 25 cm' Methanol. Man läßt 3 Tage bei 27'C schütteln und trennt dann das Mycel
ab. Die Extraktion des
Kulturfiltrates und die Chromatographie des
Rohextraktes wird, in gleicher Weise wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt.
Die mit Chloroform-Aceton-(1:1)-Gemischen eluierten Anteile enthalten das 1-Dehydrocortison,
das aus Aceton-Äther-Gemischen kristallisiert erhalten wird, F. = 230 bis 233°C.
Es besitzt die im Beispiel 3 beschriebenen Eigenschaften.
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Wird an Stelle der Lösung von 3,11,20-Triloeto-17a,21-dioxy-allopregnan
eine Lösung von 3,11,20-Triketo-17a,21-dioxypregnan in 25 cm3 Methanol einer analogen
Kultur von Calonectria decora zugesetzt und in der beschriebenen Weise aufgearbeitet,
so erhält man ebenfalls das 1-Dehydro-cortison in guter Ausbeute.
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Beispiel 9 Unter sterilen Bedingungen wird eine Lösung von 1 g 3,20-Diketo-11f,17a,21-trioxy-allopregnan
in 25 cm;, Methanol zu 41 einer Kultur von Calonectria decora gegeben und die Mischung
4 Tage bei 27'C geschüttelt. Dann trennt man vom Mycel ab und führt die Extraktion
des Kulturfiltrates und die chromatographische Ruftrennung des Extraktes, wie im
Beispiel 1 beschrieben, durch. Aus den mit Chloroform-Aceton-(1: 1)-Gemischen eluierten
Anteilen wird das 1-Dehydro-hydrocortison in guter Ausbeute kristallisiert erhalten,
F. = 239 bis 242°C. Es besitzt die im Beispiel 4 beschriebenen Eigenschaften.
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Beispiel 10 Eine Lösung von 1 g Androstan-3,17-dion in 25 cm3 Aceton
wird unter sterilen Bedingungen zu 41 einer Kultur von Calonectria decora gegeben.
Nach 36stündigem Schütteln bei 27'C trennt man das My cel ab und schüttelt das Kulturfiltrat
erschöpfend mit Methylenchlorid aus. Der Extrakt wird je zweimal mit 0,1 n-Salzsäure
und 1°Joiger Natriumbicarbonatlösung und dreimal mit Wasser gewaschen, getrocknet
und im Vakuum eingedampft. Den Rückstand (1,2 g) chromatographiert man an 30 g Aluminiumoxyd
nach der Durchlaufmethode, wobei man mit Petroläther-Benzol-Gemischen, mit Benzol,
mit Benzol-Äther-Gemischen und mit Äther eluiert. Die mit Petroläther - Benzol und
mit Benzol abgelösten Anteile enthalten das bekannte zll#4-Androstadien-3,17-dion,
das aus einem Aceton-Petroläther-Gemisch in rhombischen Platten kristallisiert.
F. = 145 bis 146°C; als= r110' (CHC13).
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Beispiel 11 Zu 41 einer Kultur von Calonectria decora, die, wie im
Beispiell beschrieben, gezüchtet wird, gibt man unter sterilen Bedingungen eine
Lösung von 1 g 11-Dehydro-corticosteron (A4-3,11,20-Trioxo-21-oxy-pregnen) in 25
cm3 Aceton. Man läßt 3 Tage bei 27''C schütteln und filtriert dann das Mycel ab.
Die Extraktion des Kulturfiltrates und die Chromatographie des Rohextraktes an Kieselsäuregel
wird, wie im Beispiel l beschrieben, durchgeführt. Die Chloroform- und die Chloroformaceton-(95:5)-Fraktionen
enthalten Verunreinigungen und etwas Ausgangsmaterial, während die Chloroform-Aceton-(90:10)-Fraktionen
zur Hauptsache aus einer Substanz bestehen, die im Papierchromatogramm etwas langsamer
läuft als das Ausgangsmaterial. Diese Substanz stellt das Ai(4)-3,11,20-Triketo-21-oxypregnadien
dar, das aus Aceton -Äther kristallisiert wird. Die Kristalle zersetzen sich zwischen
200 und 220°, je nach Heizgeschwindigkeit etwas verschieden. Die Substanz absorbiert
im UV bei 240 mp, und zeigt im IR die für die d r M-3-Keto-Gruppierung charakteristischen
Banden bei 5,99, 6,14 und 6,22,,i. Durch Acetylierung mit Pvridin-Acetanhvdrid erhält
man das entsprechende ' 21-Acetat vom F.188 bis 191`C. In ähnlicher Weise läßt sich
z. B. das Ünanthat oder Undecvlenat herstellen. Beispiel 12 Zu 41 einer Kultur von
Calonectria decora, die, wie im Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet wird, gibt man
unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g Corticosteron 0 4-3,20-Dioxo-11[)1,21-dioxy-pregnen)
in 25 cm3 Aceton. Man läßt 4 Tage bei 27-C schütteln und filtriert dann das Mycel
ab. Die Extraktion des Kulturfiltrates und die Chromatographie des Rohextraktes
an Silicagel wird, wie im Beispiel l beschrieben, durchgeführt. Die mit Chloroform
und mit Chloroform-Aceton (95:5) eluierten Anteile enthalten - Verunreinigungen
und Ausgangsmaterial. Mit Chloroform-Aceton (90: 10) und (80:20) wird zur Hauptsache
eine Substanz eluiert, (lie im Papierchromatogramm etwas langsamer wandert als das
Ausgangsmaterial. Es handelt sich um das 1-Deliydrocorticosteron, das aus Aceton
umkristallisiert wird F. 216 bis 220-C (Zersetzung), ä D = r 158° (Alkohol).
Im UV absorbiert die Substanz bei 244 m[-, (s = 15300) und zeigt im IR Banden bei
2,76, 2,86, 5,84, 5,99, 6,14, 6,22, 7,44, 8,73, 9,22, 9,38 und 9,63 ,z.
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Das mittels Pyridin-:Icetanht-drid bei 20''C hergestellte 21 Acetat
schmilzt bei 159 bis 161'C; [(x] D _ -151- (Dioxan), U3'Absorptionsspektrum
i"iax 243 mt-, (a = 14800).
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Beispiel 13 Zu 41 einer Kultur von Calonectria decora, die, wie im
Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet wird, gibt man unter sterilen Bedingungen eine
Lösung von 1 g 17a-Oxycortexon (Reichsteins Substanz S) in 25 cm3 Methanol. Man
läßt 3 Tage bei 27'C schütteln und filtriert dann das 1@Iycel ab. Die Extralotion
des Kulturfiltrates und die Chromatographie des Rohextraktes an Kieselsäuregel wird,
wie im Beispiel l beschrieben, durchgeführt. Die Chloroform- und die ChloroformAceton-(97,5
: 2,5)-Fraktionen enthalten Verunreinigungen, während mit Chloroform-Aceton
(95: 5) etwas Ausgangsmaterial eluiert wird. Die Chloroform-Aceton-(90: 10)-Fraktionen
bestehen aus einem Gemisch, das neben wenig Ausgangsmaterial und höherpolaren Produkten
zur Hauptsache 1-Dehydro-17a-oxy-cortexon enthält. Dieses wird durch Kristallisation
aus Aceton rein erhalten, F. = 227 bis 233'C (Zersetzung) ; -a.n = -76- (@tlianol)
; UV-Absorptionsspektrum: A",ax 244 mu, (a = l6200). Im IR finden sich Banden
unter anderem bei 2,76, 2,85, 5,84, 6,00, 6,15, 6,23, 9,01, 9,20, 9,55 und 10,04
p.. Das mittels Pyridin-Acetanhydrid hergestellte 21-Acetat schmilzt bei 216 bis
222"C, -aln = -!-86' (Dioxan); UV-Absorptionsspektrum 2."x 2`14 mu. (F = l5400).
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Beispiel 14 Zu 41 einer Kultur von Calonectria decora, die, wie im
Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet wird, gibt man unter sterilen Bedingungen eine
Lösung von 1 g Progesteron in 25 em3 Aceton. Man läßt 24 Stunden bei 27"C schütteln
und filtriert dann das Mycel ab. Die Extraktion des Kulturfiltrates wird, wie im
Beispiel l beschrieben, durchgeführt. Der Rohextrakt wird an einer Säule von 30
g alkalifreiem Aluminiumoxyd chromatographicrt, wobei die einzelnen Fraktionen (je
100 cm3) papierchromatographisch untersucht werden. Die Petroläther-Benzol-Fraktionen
enthalten Ausgangsmaterial, während mit Benzol zur Hauptsache 1-Dehydro-progesteron
eluiert wird. Dieses wird aus Äther-Petroläther kristallisiert, F. = 151 bis 152°C;
-all = -120° (Äthanol) ; UV-Absorptionsspektrum 4",, 245 mp, (E =
16150). Im
IR finden sich Banden unter anderem bei 5,86, 5,99, 6,14,
6,23, 7,23, 7,38, 8,33, 8,62, 10,55 und 12,24 Beispiel 15 In einem Schüttelgefäß
wird 11 einer Nährlösung, enthaltend 15 g Pepton, 10 cm3 Maisquellwasser (Cornsteepliquor),
0,1 g Rohglucose und im übrigen Leitungswasser, auf pn 6,8 eingestellt und sterilisiert.
Dann wird mit einer Kultur Calonectriä decora beimpft. Man läßt 48 Stunden bei 27°C
schütteln und gibt dann zur gut entwickelten Kultur unter sterilen Bedingungen eine
Lösung von 250 mg Cortison in 8 cm3 Methanol. Man schüttelt weiter bei 27°C, filtriert
nach 3 Tagen das Mycel ab und extrahiert das Kulturfiltrat, wie im Beispiel 1 beschrieben,
mit Essigester. Die papierchromatographische Untersuchung des Rohextraktes zeigt,
daß neben wenig höherpolaren Anteilen nur 1-Dehydro-cortison, aber kein Ausgangsmaterial
mehr vorhanden ist. Mittels Kristallisation aus Aceton-Äther und aus Methanol wird
das 1-Dehydro-cortison rein erhalten.
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Beispiel 16 2 g Natriumnitrat, 1 g prim, Kalium-ortho-phosphat, 0,5
g Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,5 g Kaliumchlorid, 50 g Glucose und 1 g Difco-Hefeextrakt
werden in 1 1 Leitungswasser gelöst, durch Zusatz einer Natriumhydroxydlösung auf
p$ 5 gebracht und sterilisiert. Die erhaltene Nährlösung beimpft man mit 50 cm3
einer 4Tage alten Schüttelkultur von Didymella lycopersici und schüttelt sie 48
Stunden bei 27°C, wobei sich die Kultur gut entwickelt. Dann wird unter sterilen
Bedingungen eine Lösung von 250 mg Cortexon in 10 cm3 Aceton zugegeben. Man schüttelt
weitere 2 Tage bei 27°C, putscht dann das Mycel ab, wäscht es mit Wasser und Essigester
und extrahiert die vereinigten Filtrate mit Essigester. Die Essigesterlösungen wäscht
man mitWasser, trocknet sie und dampft sie im Vakuum ein, wobei sich der erhaltene
kristalline Rückstand bei der papierchromatographischen Untersuchung im System Bush
B3 (Ligroin : Benzol : Methanol : Wasser [6,67: 3,33 :8,0:2,0]) als fast reines
1-Dehydrocortexon erweist. Zur Reinigung läßt man es in Chloroformlösung durch eine
Schicht Kieselsäuregel laufen. Das Chloroform-Filtrat enthält wenig Öl. Die weiteren,
mit Chloroform unter Zusatz von 1 bis 3 °/o tertiär-Butanol erhaltenen Filtrate
vereinigt man und dampft sie ein. Der Rückstand liefert aus einem Aceton-Isopropyläther-Gemisch
umkristallisiert 220 mg 1-Dehydrocortexon vom F. = 189 bis 195°C (Zersetzung). Beispiel
17 Zu 1 1 einer gut entwickelten, wie im Beispiel 17 dargestellten Kultur
von Didymella lycopersici gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 250
mg Cortison in 10 cm3 Methanol und läßt 72 Stunden bei 27°C schütteln, wonach die
Kulturflüssigkeit, wie im Beispiel 16 angegeben, aufgearbeitet wird. Auf Grund der
papierehromatographischen Untersuchung im System Propylenglykol-Toluol enthält der
Rückstand der Essigesterextrakte als Steroidanteil praktisch ausschließlich 1-Dehydrocortison.
Man filtriert den Rückstand in Chloroformlösung durch Kieselsäuregel. Die Chloroformfiltrate
geben wenig Öl. Mit Chloroform-Aceton (6:4) erhält man einen kristallinen Rückstand,
der aus einem Aceton-Äther-Gemisch umkristallisiert 225 mg reines 1-Dehydrocortison
vom F. = 231 bis 234°C liefert.
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Beispiel 18 Zu 1 1 einer gut entwickelten, wie im Beispiel 17 hergestellten
Kultur von Didymella lycopersici gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung
von 250 mg Hydrocortison in 10 cm3 Methanol. Nach 10tägigem Schütteln bei 27°C wird
die Kultur, wie im Beispiel 17 angegeben, aufgearbeitet. Der Rückstand der Essigesterlösungen
erweist sich im Papierchromatogramm (System Propylenglykol-Toluol) als fast reines
1-Dehydro-hydrocortison. Zur Abtrennung von Begleitsubstanzen nimmt man ihn in Chloroform
auf und filtriert die Lösung durch Kieselsäuregel. Die Chloroformeluate, die eine
kleine Menge eines Öls enthalten, werden verworfen. Die Chloroform-Aceton-(1 : 1)-Eluate
vereinigt man und dampft sie ein. Der Rückstand wird aus Methanol oder einem Aceton-Äther-Gemisch
umkristallisiert, wobei 210 mg reines 1-Dehydro-hydrocortison vom F. = 238 bis 241'C
erhalten werden. Beispiel 19 Zu 120 cm3 einer gut entwickelten, wie im Beispiel
17 erhaltenen Kultur von Didymella lycopersici gibt man unter sterilen Bedingungen
eine Lösung von 30 mg 3;11,20-Triketo-17a,21-dioxy-allopregnan in 2 cm3 Methanol.
Man läßt 10 Tage bei 27°C schütteln und arbeitet die Kultur wie im Beispiel 17 angegeben
auf. Der Rückstand der Essigesterextrakte enthält auf Grund der papierchromatographischen
Untersuchung im System Propylenglykol-Toluol neben unverändertem Ausgangsmaterial
1-Dehydrocortison, das durch Chromatographie an Kieselsäuregel und anschließende
Kristallisation aus einem Aceton-Äther-Gemisch in reiner Form gewonnen wird. Beispiel
20 Zu 21 einer gut entwickelten, wie im Beispiel 17 erhaltenen Kultur von Didymella
lycopersici gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 500 mg 44-3,11,20-Trioxo-17a-methyl-21-acetoxy-pregnen
in 15 cm3 Aceton. Man läßt 3 Tage bei 27°C schütteln und arbeitet dann wie im Beispiel
17 beschrieben auf. Der Extraktionsrückstand (585 mg) besteht auf Grund der
papierchromatographischen Untersuchung praktisch nur aus 41(4)-3,11,20-Trioxo-17a.-methyl-21-oxy-pregnadien.
Durch Kristallisation aus einem Aceton-Petroläther-Gemisch wird es in Nadeln gewonnen,
die bei 183 bis 186'C unter leichter Zersetzung schmelzen. [a]D = +120°C
(Alkohol), UV-Absorption: rlmax 240 mp. (s = 14,600). Das IR-Spektrum zeigt die
für 41.4-3-Ketone charakteristischen Banden bei 5,98, 6,13 und 6,21 #t. Das mittels
Pyridin-Acetanhydrid hergestellte 21-Acetat schmilzt bei 198 bis 201°C, [a]" = -;-135°
(Chloroform), UV-Absorptionsspektrum Anaax 240 mp. (e = 14,800).
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Beispiel 21 Zu 41 einer gut entwickelten, wie im Beispiel
17 erhaltenen Kultur von Didymella lycopersici gibt man unter sterilen Bedingungen
eine Lösung von 1 g 17a-Äthinyl-testosteron in 25 cm3 Aceton. Man läßt 8 Tage bei
27°C schütteln und arbeitet dann die Kultur gemäß den Angaben im Beispiel
17 auf. Die papierchromatographische Untersuchung des Extraktionsrückstandes
zeigt, daß er praktisch nur aus 1-Dehydro-17a-äthinyltestosteron besteht. Durch
Kristallisation aus einem Aceton-Äther-Gemisch wird die reine Substanz erhalten.
F. = 228 bis 233°C. [a]D = -17° (Chloroform).
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Beispiel 22 Zu 21 einer gut entwickelten, wie im Beispiel 17 erhaltenen
Kultur von Didymella lycopersici gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung
von 180 mg 6-Dehydro-cortexon-21-acetat in 10 cm3 Aceton und läßt dann 3 Tage bei
27°C schütteln. Dann wird die Kultur wie im Beispiel 17 beschrieben aufgearbeitet.
Der Extraktionsrückstand
(190 mg) besteht gemäß papierchromatographischer
Untersuchung praktisch ausschließlich aus freiem 1,6-Bis-dehydro-cortexon, das aus
Aceton-Äther-Gemischen kristallisiert wird. Im IR-Spektrum finden sich die für die
41(4)-3-Ketone charakteristischen Banden bei 5,98, 6,13 und 6,22 p.. Es schmilzt
bei 166 bis 168°C, [a]D = -I-112' (Aceton). Das mittels Pyridin-Acetanhydrid
hergestellte 21-Acetat schmilzt bei 158 bis 162°C, [a]D = -f-123° (Äthanol), UV-Absorptionsspektrum
Amax 223 mp, (a = 11,600), 256 m#t (a = 9,900) und 300 m#t (e = 12,800). Beispiel
23
Zu 41 einer gut entwickelten, wie im Beispiel 17 erhaltenen Kultur von
Didymella lycopersici gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g 11-Dehydro-progesteron
in 20 cm3 Aceton. Man läßt 8 Tage bei 27'C schütteln und arbeitet dann wie im Beispiel
17 beschrieben auf. Im Extraktionsrückstand kann mittels papierchromatographischer
Untersuchung ausschließlich das 1,11-Bis-dehydro-progesteron nachgewiesen werden.
Es wird aus einem Aceton-Petroläther-Gemisch in kristalliner Form erhalten (F. =
166 bis 168°C) und zeigt im IR-Spektrum unter anderem Banden bei 5,98, 6,17 und
6,22 #t, [a] ö = 112° (Aceton), UV-Absorptionsspektrum Am., 245 m#t (E =
17,750). Beispiel 24 Zu 21 einer gut entwickelten, wie im Beispiel 17 erhaltenen
Kultur von Didymella lycopersici wird unter sterilen Bedingungen eine Lösung von
500 mg 17a-Methyltestosteron in 15 cm' Aceton gegeben. Man läßt 3 Tage bei 27'C
schütteln und arbeitet dann die Kultur gemäß den Angaben in Beispiel 17 auf. Der
Extraktionsrückstand wird in wenig Aceton gelöst. Bei der Zugabe von Äther wird
das 1-Dehydro-17a-methyl-testosteron in derben Kristallen erhalten. F. = 163 bis
164°C. [a]D = + 0 '
(Chloroform), UV-Absorptionsspektrum @@nax
245 m#t (a = 15600). Beispiel 25 2 g Natriumnitrat, 1 g prim. Kalium-ortho-phosphat,
0,5 g Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,5 g Kaliumchlorid, 50 g Glucose und 1 g Hefeextrakt
(bekannt unter dem Handelsnamen >#Difco(;) werden in 11 Leitungswasser gelöst, durch
Zusatz einer Natriumhydroxydlösung auf pH 5 gebracht und sterilisiert. Die erhaltene
Nährlösung beimpft man mit 50 cm3 einer 4 Tage alten Schüttelkultur von Didymella
lycopersici und schüttelt sie 48 Stunden bei 27''C, wobei sich die Kultur gut entwickelt.
Zu 120 cm3 dieser Kultur von Didymella lycopersici gibt man unter sterilen Bedingungen
eine Lösung von 30 mg 9a-Fluor-hydrocortison in 2 cm3 Methanol. -Man läßt 5 Tage
bei 27'C schütteln, putscht dann das llycel ab, wäscht es mit Wasser und Essigester
und extrahiert die vereinigten Filtrate mit Essigester. Die Essigesterlösungen wäscht
man mit Wasser, trocknet sie und dampft sie im Vakuum ein. Der Extraktionsrückstand
enthält auf Grund der papierchromatographischen Untersuchung 1-Dehydro-9a=fluor-hydrocortison,
das mittels eines präparativen Papierchromatogramms (System Propylenglykol-Toluol)
von unverändertem Ausgangsmaterial abgetrennt wird. Aus Aceton bildet es Kristalle
vom F. = 263 bis 266'C (Zersetzung), [a]D = -f-108° (Äthanol), UV-Absorptionsspektrum
7,.a" 240 mlt (a
= 15,800). Es wird im Hochvakuum getrocknet und mit 4 cm3
Pyridin-Essigsäureanhydrid-(1 : 1)-Gemisch in üblicher Weise bei Zimmertemperatur
acetyliert. Das erhaltene 21-Acetat des 1-Dehydro-9a-fluor-hydrocortisons wird aus
einem Aceton-Petroläther-Gemisch umkristallisiert und schmilzt bei 244 bis 246'-C
(Zersetzung), [a]D = -f-108'' (Dioxan), LV-Absorptionsspektrum dmux 240 m#t (E =
16,250).
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Beispiel 26 2 g Natriumnitrat, 1 g prim. Kalium-ortho-phosphat, 0;5
g Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,5 g Kaliumchlorid, 50 g Glucose und 1 g -Difco"-Hefeextrakt
werden in 1 1 Leitungswasser gelöst, durch Zusatz einer Natriumhydroxydlösung auf
pH 5 gebracht und sterilisiert. Die erhaltene Nährlösung beimpft man mit 50 cm3
einer 4 Tage alten Schüttelkultur von Didymella lycopersici und schüttelt sie 48
Stunden bei 27'C, wobei sich die Kultur gut entwickelt. Zu 120 cm3 dieser Kultur
von Didymella lycopersici gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30
mg 9,11(3-Oxido-17a-oxycortexon-21-acetat in 2 em3 Methanol. Man läßt 5 Tage bei
27'C schütteln, putscht dann das My cel ab, wäscht es mit Wasser und Essigester
und extrahiert die vereinigten Filtrate mit Essigester. Die Essigesterlösungen wäscht
man mit Wasser, trocknet sie und dampft sie im Vakuum ein. Der Extraktionsrückstand
enthält auf Grund der papierchromatographischen Untersuchung 1-Dehydro-9,11(3-oxido-17a-oxy-cortexon,das
mittelseines präparativen Papierchromatogramms (System Propylenglykol-Toluol) von
unverändertem Ausgangsmaterial abgetrennt wird. Das Rohprodukt wird im Hochvakuum
getrocknet und mit 4 em3 Pyridin-Essigsäureanhydrid-(1 : 1)-Gemisch in üblicher
`Verse bei Zimmertemperatur acetyliert.
-
Das erhaltene 1-Dehydro-9,1113-oxido-17a-öxy-cortexon-21-acetat (30
mg) löst man in 5 cm3 Dioxan, vermischt mit 1,25 cm3 2,5 n Fluorwasserstoffsäure
in Chloroform und läßt 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen. Dann gibt man Wasser
zu und extrahiert mit Chloroform-Äther (1 : 3). Nach dem Waschen mit Wasser, Trocknen
und Verdampfen der Lösungsmittel im Vakuum erhält man das 1-Dehydro-9a-fluor-hydrocortison-21-acetat
vom F. = 235 bis 237''C.