DE1153017B

DE1153017B - Verfahren zur Herstellung von 1,4-Bis-dehydro-3-ketosteroiden

Info

Publication number: DE1153017B
Application number: DEM30109A
Authority: DE
Inventors: Thomas Henry Stoudt
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1955-04-08
Filing date: 1956-03-28
Publication date: 1963-08-22

Description

Verfahren zur Herstellung von 1,4-Bis-dehydro-3-ketosteroiden Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von 1,4-Bis-dehydro-3-ketosteroiden durch 1-Dehydrierung, indem man ein entsprechendes 1,2-Dihydro-,4-3-keto- oder -.45-3-hydroxy-(bzw. alkanoyloxy- bzw. -benzoyloxy-) steroid mit einer Kultur von Bacillus sphaericus oder den daraus gewonnen Enzymen unter bekannten aeroben und submersen Bedingungen bebrütet.
Das erfindungsgemäße einstufige Verfahren liefert die erwünschten 1,4-Bis-dehydro-3-ketosteroide direkt und in hoher Ausbeute, ohne daß unerwünschte Nebenprodukte in größerer Menge anfallen.
In der Weise werden z. B. in 4-Stellung ungesättigte 3-Ketosteroide, die 4-Pregnen-3,11,20-trion-17a,21-diol und 4-Pregnen-3,20-dion-11ß,17a,21-triol, in die entsprechenden, in 1,4-Stellung ungesättigten 3-Ketosteroide, wie 1,4-Pregnadien-3,11,20-trion-17a, 21-diol und 1,4-Pregnadien-3,20-dion-11f,17a, 21-triol, übergeführt.
Diese Verbindungen besitzen Cortison-Aktivität, unterscheiden sich aber von Cortison dadurch, daß sie praktisch frei von unerwünschten Nebenwirkungen wie Ödembildung sind, da sie keine merkliche Natrium- oder Wasserretention bewirken.
Die Herstellung von in 1,4-Stellung ungesättigten 3-Ketosteroiden auf chemischem Wege ist unbefriedigend, weil die chemischen Reaktionen zu Gemischen verschiedener Verbindungen führen. Eine Abtrennung der erwünschten Zwischen- und Endprodukte aus derartigen Gemischen ist kostspielig und führt zu niedrigen Ausbeuten an den in 1,4-Stellung ungesättigten 3-Ketosteroiden.
Die Art Bacillus sphaericus, wie sie in Bergey's Manual for Determinative Bacteriology, 6. Auflage, definiert ist, umfaßt mehrere Abarten, wie die Abart rotans und die Abart fusiformis, die in einigen Zusammenstellungen unter den Artbezeichnungen Bacillus rotans und Bacillus fusiformis erwähnt werden. Diese Bacillus-sphaericus-Mikroorganismen können von bekannten Quellen, beispielsweise von der American Type Culture Collection, Washington D. C., bezogen werden, oder sie können aus natürlichen Vorkommen, z. B. aus dem Boden, nach bekannten Verfahren isoliert werden.
Während das erfindungsgemäße bakteriologische Dehydrierungsverfahren allgemein zur Dehydrierung von A4-3-Ketosteroiden ohne Rücksicht auf die Substituenten oder den Grad der Ungesättigtheit der Ringe B, C und D angewendet werden kann, wird gewöhnlich vorgezogen, alsAusgangsstoffe bei diesem Verfahren entsprechende Steroide der Pregnanreihe zu verwenden, beispielsweise d4-3-Keto-pregnenver-Bindungen oder deren 9-Halogenderivate oder .45-3-Oxy-pregnenverbindungen oder deren 9-Halogenderivate oder 45-3-(niedrig-Alkanoyloxy)-pregnenverbindungen oder deren 9-Halogenderivate.
Die in 3-Stellung durch eine sauerstoffhaltige Gruppe substituierten d5-Pregnenverbindungen als Ausgangsstoffe werden durch die Dehydrierungsaktivität der Bacillus-Mikroorganismen direkt zu den entsprechenden d1,4-3-Keto-pregnadienverbindungen umgesetzt, wobei die Umsetzung, wie angenommen wird, über die intermediäre Bildung der d4-3-Ketoverbindung erfolgt.
Sofern die Ausgangsstoffe Hydroxylgruppen in der 3- und/oder 21-Stellung enthalten, kann man deren 3- und/oder 21-Ester niederer Carbonsäuren, wie Essigsäure, Propionsäure, tertiäre Butylessigsäure oder Benzoesäure, verwenden.
Das bakteriologische Dehydrierungsverfahren nach der Erfindung wird ausgeführt, indem man das in 3-Stellung durch eine sauerstoffhaltige Gruppe substituierte 44- bzw. 45-Steroid der Dehydrierungsaktivität von Bacillus-sphaericus-Mikroorganismen aussetzt. Das kann dadurch erfolgen, daß man das Steroid als festen Stoff oder in einem Lösungsmittel, z. B. einem Dialkylketon, wie Aceton, einem Dialkylformamid, wie Dimethylformamid, gelöst unter sterilen Bedingungen zu einer Kultur der Mikroorganismen in einer Nährlösung zusetzt und das gebildete Gemisch schüttelt, wodurch das Wachstum der Mikroorganismen und die Dehydrierung des Steroids bewirkt werden. Das Steroid kann zu dem Zeitpunkt, in dem die Nährlösung mit der Kultur von Bacillus-sphaericus-Mikroorganismen geimpft wird, zugegeben werden oder kann andererseits zu einer vorhandenen Kultur zugesetzt werden. Statt das Steriod zu der in der Nährlösung vorhandenen Kultur zuzusetzen, kann das Zellgewebe einer solchen vorhandenen Kultur von der Lösung abfiltriert, mit destilliertem Wasser gewaschen, dann in einer gepufferten wäßrigen, das in 3-Stellung durch eine sauerstoffhaltige Gruppe substituierte Steroid enthaltenden Lösung suspendiert und das erhaltene Gemisch geschüttelt bzw. gerührt werden, wodurch das Steroid zu dem entsprechenden 41-4-3-Ketosteroid dehydriert wird. Das letztere kann aus diesem Medium leichter wiedergewonnen werden als aus dem Gemisch, das man erhält, wenn das Steriod in Gegenwart der Mikroorganismen in der ursprünglichen Nährlösung gebildet wird. Andererseits kann das in: 3-Stellung durch eine sauerstoffhaltige Gruppe substituierte 44- bzw. 45-Steroid mit dehydrierenden Enzympräparaten aus dem Wachstum von Bacillus sphaericus behandelt werden, wodurch das entsprechende A1.4-3-Ketosteroid gebildet wird.
Bei Ausführung dieser bakteriologischen Dehydrierung werden als Nährlösungen die gewöhnlich bei der Züchtung von Bazillen gebrauchten verwendet. Die gewöhnlichen Nährstoffe enthalten einen Stickstoff und Kohlenstoff liefernden Stoff, anorganische Salze und, wenn erforderlich, Wuchsstoffe: Der Kohlenstoff kann. von Verbindungen, wie Acetaten oder Lactaten, geliefert werden. Kohlehydrate werden von Bacillus spaericus nur schlecht ausgenutzt; sie können in der Lösung vorhanden sein oder fehlen, ohne daß dadurch die Steroiddehydrierung ernstlich beeinflußt wird. Als Stickstofflieferanten können dienen: ein Ammoniumsalz, Aminosäuren oder Proteine, wie Sojabohnen, Hafer, Hefe, Hefeexrakte, tryptisches Hydrolysat von Casein, Fleischextrakt, Blutmehl, Protein-, Fleisch- und Knochenabfälle, Lachsmehle, lösliche Fischabfälle oder lösliche Destillationsrückstände. Wenn gewünscht, können die Bazillen. unter Verwendung von Protein (oder Aminosäuren), ohne daß irgendein Kohlehydrat in der Lösung vorhanden ist, gezüchtet werden; in diesem Falle liefern die Proteine oder Aminosäuren sowohl den von den Mikroorganismen benötigten Kohlenstoff als auch den Stickstoff.
Während, wie oben ausgeführt wurde, die Dehydrierung des in 3-Stellung durch eine sauerstoffhaltige Gruppe substituierten 94-bzw. d5-Steroids unter Verwendung von dehydrierenden Enzympräparaten aus dem Wachstum von Bacillus sphaericus oder durch Behandeln des Steroids mit einer Suspension einer vorhandenen Kultur in destilliertem Wasser ausgeführt werden kann, wird gewöhnlich vorgezogen, das betreffende Steroid zu einer Nährlösung, die ein 24 Stunden altes Wachstum von Bacillus sphaericus enthält, zuzugeben. Die Menge des Steroids, die zu der Lösung zugegeben werden kann, ist unterschiedlich und hängt von dem zu dehydrierenden Substrat ab, aber vorzugsweise wird eine Konzentration von etwa 0,005 bis 0,21/o- des betreffenden Steroids verwendet, obgleich auch höhere oder niedere Konzentrationen: verwendet werden können. Die das zugesetzte Steroid enthaltende Kultur wird dann babrütet, vorzugsweise unter Schütteln und Belüftung, während einer zusätzlichen Zeitdauer von gewöhnlich etwa 10 bis 50 Stunden, obgleich eine kürzere oder längere Gärungsdauer für die Dehydrierung besonderer 3-Ketosteroidsubstrate vorteilhaft sein kann. Im Hinblick auf die Tatsache, daß verlängerte Gärungen zur Zersetzung eines Teils des erhaltenen d1,4-3-Ketosteroidproduktes führen können, wird gewöhnlich eine Gärungsdauer von etwa 10 bis 24 Stunden bevorzugt, die von dem Steroidsubstrat abhängig ist und, wie gefunden wurde, zu maximalen Ausbeuten an 1-dehydriertem Steroidprodukt führt.
Nach Beendigung der Dehydrierung wird das Produkt zweckmäßig aus der Gärflüssigkeit durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, z. B. einem chlorierten Kohlenwasserstoff, wie Chloroform, einem Keton, wie Methylisobutylketon, oder einem Alkylalkanoat, wie Äthylacetat, isoliert. Der Extrakt an d1A-Steroidprodukt und etwa nicht umgesetztem Ausgangsmaterial wird zweckmäßig durch Chromatographie unter Verwendung von Kieselsäure oder aktiviertem Aluminiumoxyd oder mittels absteigender Papierchromatogramme gereinigt. Nach Abtrennung des dehydrierten Produkts von nicht umgesetztem Ausgangsmaterial kann das Produkt durch Umkristallisation aus einem Lösungsmittel, z. B. Äthylacetat oder Äthylacetat-Petroläther, weitergereinigt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren. Beispiel 1 50 ccm einer Nährlösung folgender Zusammensetzung werden hergestellt: »Cerelose« . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 g »Edamin« * * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 g Getreideaufschlämmung . . . . . . . . . . . 0,25 ccm Hefeextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05 g Mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 50 ccm * Handelsbezeichnung für technische Dextrose.
** Handelsbezeichnung für technisches digeriertes Lactalbumin. Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 2,5 bis 5 ccm einer Kultur, die durch Bebrüten von Bacillussphaericus-Mikroorganismen (MB 431) in derselben Lösung während 24 Stunden bei 28°C erhalten wurde, geimpft; die geimpfte Lösung wird dann bei 28° C unter Schütteln 24 Stunden bebrütet. Zu der erhaltenen Kultur wird eine Lösung, die 10 mg Hydrocortison (d4-Pregnen-11ß,17a,21-triol-3,20-dion) in 0,1 ccm Dimethylformamid gelöst enthält, zugesetzt. Die das Steroid enthaltende Kultur wird unter Schütteln während einer zusätzlichen Zeitdauer von etwa 10 Stunden bei 28° C bebrütet.
Die Gärflüssigkeit wird dreimal mit je 50 ccm Äthylacetat extrahiert; die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum auf ein Volumen von etwa 5 ccm eingedampft. Die konzentrierte Lösung wird dann zur Herstellung von Papierstreifenchromatogrammen verwendet, die unter Verwendung von Formamin als stationärer flüssiger Phase und Chloroform als beweglicher flüssiger Phase entwickelt werden. Zwei Zonen werden festgehalten, von denen die eine (entsprechend der beweglicheren Komponente) das für Hydrocortison charakteristische Absorptionsmaximum im Ultraviolett und die andere (die weniger bewegliche Komponente) ein Absorptionsmaximum im Ultraviolett bei etwa 242m, zeigt. Das Papierchromatogramm wird getrocknet und die der 242-mu-Absorption entsprechende Zone abgeschnitten und mit Methanol extrahiert. Das durch Methanolextraktion erhaltene Material wird wieder der Papierstreifenchromatographie unterworfen, wobei Papier, das 48 Stunden mit Methanol extrahiert worden ist, und das vorher benutzte Chloroform-Formamid-System verwendet werden. Das erhaltene Chromatogramm zeigt nur eine Spur einer dem Ausgangsmaterial Hydrocortison entsprechenden Zone, während die größere Zone ein Absorptionsmaximum im Ultraviolett von 242 m#t hat. Das Papierchromatogramm wird gründlich getrocknet und die dem 242-m#t-Absorptionsmaximum entsprechende Zone abgeschnitten und mit Methanol extrahiert. Der Methanolextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und gibt dl.4-Pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion.
Beispiel 2 201 einer Nährlösung der folgenden Zusammensetzung werden hergestellt: »Cerelose« . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 400 g »Edamin« ....................... 400 g Getreideaufschlämmung . . . . . . . . . . . 100 ml Hefeextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 g Mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 201 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 11 eines 24 Stunden alten Wachstums des Mekroorganismus Bacillus sphaericus (MB 431) geimpft. Die geimpfte Kultur wird bei 28° C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet und zu der erhaltenen Kultur eine Lösung von 4 g Hydrocortison in 40 ml Dimethylformamid zugegeben. Die das Steroid enthaltende Kultur wird unter Schütteln während einer zusätzlichen Zeitdauer von etwa 10 Stunden bei 28° C bebrütet.
Die Gärflüssigkeit wird wiederholt mit Äthylacetat extrahiert, die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Eine Probe des Rückstands wird in Aceton gelöst und auf ein Papierchromatogramm getüpfelt, das unter Verwendung von Formamid als stationärer Phase und Chloroform als beweglicher Phase entwickelt wird. Es werden zwei getrennte Zonen erhalten; die untere, dem nicht umgesetzten Hydrocortison entsprechende Zone wird abgeschnitten, die andere, dem 1-Dehydroderivat entsprechende, wird gleichfalls abgeschnitten und mit Methanol eluiert. Die Ultraviolettabsorptionsanalyse dieses Methanoleluates zeigt, daß die obere Zone eine Menge an d1,4-Pregnadien-llß,17a,21-triol-3,20-dion enthält, die einer Gesamtausbeute von annähernd 1 g, bezogen auf die 4 g Hydrocortison als Ausgangsmaterial, entspricht.
Der Hauptteil des nach Eindampfen des Athylacetatextrakts erhaltenen Rückstands wird einer Zweiphasentrennung mit 70o/oigexn wässerigem Methanol und Petroläther unterworfen, wodurch ölige Verunreinigungen in die Petrolätherphase gehen. Das Methanol der wässerigen Methanolphase wird im Vakuum abgedampft und die zurückbleibende wässerige Aufschlämmung mit Athylacetat Extrahiert. Der Athylacetatextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Aceton gelöst und der Papierstreifenchromatographie unter Verwendung von Formanid als stationärer Phase und Chloroform als beweglicher Phase unterworfen. Die obere, dem 1-Dehydroderivat entsprechende Zone wird abgeschnitten, mit Methanol extrahiert und das durch Methanolextraktion erhaltene Material wieder der Papierstreifenchromatographie unterworfen. Die obere Zone wird wieder abgeschnitten, gründlich getrocknet, mit Methanol extrahiert und der Methanolextrakt im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das zurückbleibende Material wird aus Äthylacetat Petroläther umkristallisiert, und es werden annähernd 200 mg im wesentlichen reines 41,4-Pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion erhalten; Smp.222 bis 228°C. Beispiel 3 201 :einer Nährlösung der folgenden Zusammensetzung werden hergestellt: »Cerelose« . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 400 g »Edamin« ....................... 400 g Getreideaufschlämmung . . . . . . . . . . . 100 nil Hefeextrakt ..................... 20 g Mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 201 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 11 eines 24 Stunden alten Wachstums des Mikroorganismus Bacillus sphaericus (MB 431) geimpft. Die geimpfte Kultur wird bei 28° C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet und die erhaltene Kultur zu einer Lösung von 4 g Cortison in 40 ml Dimethylformamid hinzugegeben. Die das Steroid enthaltende Kultur wird unter Schütteln während einer zusätzlichen Zeitdauer von etwa 10 Stunden bei 28° C bebrütet.
Die Gärflüssigkeit wird wiederholt mit Athylacetat extrahiert; die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Die Analyse einer Probe des zurückbleibenden Materials durch Papierchromatographie und anschließende Messung der Ultraviolettabsorption des in den beiden getrennten Zonen des Chromatogramms enthaltenen Materials zeigt, daß das zurückbleibende Material annähernd 3 g nicht umgesetztes Cortison und etwa 1 g dl-4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion enthält.
Der Hauptteil des nach Eindampfen des Athylacetatexrakts erhaltenen Rückstands wird einer Zweiphasentrennung mit 70°/oigem wässerigem Methanol und Petroläther unterworfen, wodurch ölige Verunreinigungen in die Petrolätherphase gehen. Das Methanol der wässrigen Methanolphase wird im Vakuum abgedampft und die zurückbleibende wässerige Aufschlämmung mit Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Aceton gelöst und der Papierstreifenchromatographie unterworfen unter Verwendung von Formamid als stationärer Phase und Benzol als beweglicher Phase für die Entwicklung des Chromatogramms. Die obere, dem 1-Dehydroderivat entsprechende Zone wird abgeschnitten, mit Methanol extrahiert und das mit Methanol extrahierte Material wieder der Papierstreifenchromatographie unterworfen. Die obere Zone wird wieder abgeschnitten, gründlich getrocknet, mit Methanol extrahiert und der Methanolextrakt im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Äthylacetat-Petroläther umkristalhert, und es werden annähernd 250 mg im wesentlichen reines A1.4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion erhalten; Smp. 232 bis 236° C.
Beispiel 4 201 einer Nährlösung der folgenden Zusammensetzung werden hergestellt: »Cerelose« ...................... 400 g »Edamin« . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 400 g Getreideaufschlämmung . . . . . . . . . . . 100 ml Hefeextrakt ..................... 20 g Mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 201 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 11 eines 24 Stunden alten Wachstums des Mikroorganismus Bacillus sphaericus (MB 431) geimpft. Die geimpfte Kultur wird bei 28° C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet und zu der erhaltenen Kultur eine Lösung von 4 g 44-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion in 40 ml Dimethylformamid hinzugegeben. Die das Steroid enthaltende Kultur wird unter Schütteln etwa 10 Stunden bei einer Temperatur von 28'C bebrütet.
Die Gärflüssigkeit wird wiederholt mit Athylacetat extrahiert; die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird einer Zweiphasentrennung mit 7011/oigem wässerigem Methanol und Petroläther unterworfen, wodurch ölige, in der Petrolätherphase lösliche Verunreinigungen entfernt werden. Das Methanol der wässerigen Methanolphase wird im Vakuum abgedampft und die zurückbleibende wässerige Aufschlämmung mit Athylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Aceton gelöst und in Papierchromatogramme übergeführt, die unter Verwendung von Formarnid als stationärer Phase und Benzol als beweglicher Phase entwickelt werden. Von jedem Chromatogramm werden die oberen, dem 1-Dehydroderivat entsprechenden Zonen abgeschnitten und mit Methanol extrahiert; das mit Methanol extrahierte Material wird wieder der Papierstreifenchromatographie unterworfen. Die obere Zone wird wieder abgeschnitten, gründlich getrocknet mit Methanol extrahiert und der Methanolextrakt im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Äthylacetat Petroläther umkristallisiert und daraus im wesentlichen reines 31,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion erhalten; Smp. 230 bis 236° C. Beispiel 5 201 einer Nährlösung folgender Zusammensetzung werden hergestellt: »Cerelose« ...................... 400 g »Edamin« ....................... 400 g Getreideaufschlämmung . . . . . . . . . . . 100 ml Hefeextrakt ..................... 20 g Mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 201 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 11 eines 24 Stunden alten Wachstums des Mikroorganismus Bacillus sphaericus (MB 431) geimpft. Die geimpfte Kultur wird bei 28° C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet und zu der erhaltenen Kultur eine Lösung von 4 g ga-Fluor-d4-pregnen-11ß,17a,21-triol-3,20-dion in 40 ml Dimethylformamid hinzugegeben. Die das Steroid enthaltende Kultur wird unter Schütteln etwa 10 Stunden bei einer Temperatur von 28° C bebrütet.
Die Gärflüssigkeit wird wiederholt mit Äthylacetat extrahiert; die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird einer Zweiphasentrennung mit 7011%igem wässerigem Methanol und Petroläther unterworfen, wodurch ölige, in der Petrolätherphase lösliche Verunreinigungen entfernt werden. Das Methanol der wässerigen Methanolphase wird im Vakuum abgedampft und die zurückbleibende wässerige Aufschlämmung mit Äthylacetat extrahiert. Der Athylacetatextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Aceton gelöst und in Papierchromatogramme übergeführt, die unter Verwendung von Formamid als stationärer Phase und Chloroform als beweglicher Phase entwickelt werden. Die oberen, dem 1-Dehydroderivat entsprechenden Zonen werden abgeschnitten und mit Methanol extrahiert; das mit Methanol extrahierte Material wird wieder der Papierstreifenchromatographie unterworfen. Die obere Zone wird wieder abgeschnitten, gründlich getrocknet, mit Methanol extrahiert und der Methanolextrakt im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Athylacetat-Petroläther umkristallisiert und daraus im wesentlichen reines 9a-Fluor-41,4-pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion erhalten. Die Acetylierung dieses Materials mit Essigsäureanhydrid in Pyridin ergibt im wesentlichen reines 9a-Fluor- 41,4-pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat; Smp. 236° C. Beispiel 6 201 einer Nährlösung der folgenden Zusammensetzung werden hergestellt: »Cerelose« . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 400 g »Edamin« . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 400 g Getreideaufschlämmung . . . . . . . . . . . 100 ml Hefeextrakt ..................... 20 g Mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 201 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 11 eines 24 Stunden alten Wachstums des Mikroorganismus Bacillus sphaericus (MB 431) geimpft. Die geimpfte Kultur wird bei 28° C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet und zu der erhaltenen Kultur eine Lösung von 4 g d4-Pregnen-11ß,21-diol-3,20-dion in 40 ml Dimethylformamid hinzugegeben. Die das Steroid enthaltende Kultur wird unter Schütteln etwa 10 Stunden bei einer Temperatur von etwa 28° C bebrütet.
Das durch die Dehydrierungsaktivität von Bacillussphaericus-Mikroorganismen gebildete J1.4-Steroid wird mit Äthylacetat aus der Gärflüssigkeit extrahiert und gereinigt, im wesentlichen unter Anwendung desselben Reinigungsverfahrens wie im Beispiel 4 einschließlich (1) Zweiphasentrennung mit Petroläther und Methanol, um petrolätherlösliche ölige Verunreinigungen zu entfernen, (2) Papierstreifenchromatographie unter Verwendung von Formamid als stationärer Phase und Benzol als beweglicher Phase und (3) Umkristallisieren aus Äthylacetat Petroläther um im wesentlichen reines 41,4-Pregnadien- 11ß,21-diol-3,20-dion zu erhalten; Smp.231 bis 234° C.
Beispiel 7 201 einer Nährlösung der folgenden Zuammensetzung werden hergestellt: »Cerelose« . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 400 g »Edamin« . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 400 g Getreideaufschlämmung . . . . . . . . . . . 100 ml Hefeextrakt ..................... 20 g Mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 201 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 11 eines 24 Stunden alten Wachstums des Mikroorganismus Bacillus sphaericus (MB 431) geimpft. Die geimpfte Kultur wird bei 28° C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet und zu der erhaltenen Kultur eine Lösung von 4 g 44-Pregnen-21-ol-3,20-dion in 40 ml Dimethylformamid hinzugegeben. Die das Steroid enhaltende Kultur wird unter Schütteln etwa 10 Stunden bei 28° C bebrütet.
Die Gärflüssigkeit wird wiederholt mit Äthylacetat extrahiert; die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird einer Zweiphasentrennung mit 70o/oigem wässerigem Methanol und Petroläther unterworfen, wodurch ölige, in der Petrolätherphase lösliche Verunreinigungen entfernt werden. Das Methanol der wässerigen Methanolphase wird im Vakuum abgedampft und die zurückbleibende wässerige Aufschlämmung mit Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Aceton gelöst und in Papierchromatogramme übergeführt, die unter Verwendung von 50 % Methanol-Forman-iid als stationärer Phase und 50 °/o Benzol-Cyclohexan als beweglicher Phase entwickelt werden. Die oberen, dem 1-Dehydroderivat entsprechenden Zonen jedes Chromatogramms werden abgeschnitten und mit Methanol extrahiert; das mit Methanol extrahierte Material wird wieder der Papierstreifenehromatogaphie unterworfen. Die obere Zone wird wieder abgeschnitten, gründlich getrocknet, mit Methanol extrahiert und der Methanolextrakt im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Äthylacetat-Petroläther umkristallisiert und daraus im wesentlichen reines 41,4-Pregnadien-21-ol-3,20-dion erhalten; Smp. 191 bis 193° C.
Beispiel 8 50 ml einer Nährlösung der folgenden Zusammensetzung werden hergestellt: »Cerelose« ...................... 1 g »Edamin« . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 g Getreideaufschlämmung . . . . . . . . . . . 0,25 ml Hefeextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05 g Mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 50 ml Diese Lösung wird mit KOH aus einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 2,5 bis 5 ml einer Kultur, die durch Bebrüten von Bacillussphaericus-Mikroorganismen in derselben Lösung während 24 Stunden bei 28° C erhalten wurde, geimpft; die geimpfte Kultur wird dann bei 28° C unter Schütteln 24 Stunden bebrütet. Zu der erhaltenen Kultur wird eine 10 mg d4-Pregnen-11,B-ol-3,20-dion in 0,1 ml Dimethylformamid enthaltende Lösung gegeben. Die das Steroid enthaltende Kultur wird unter Schütteln etwa 10 Stunden bei 28° C bebrütet.
Die Gärflüssigkeit wird dreimal mit je 50 ml Äthylacetat extrahiert; die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum auf ein Volumen von etwa 5 ml eingedampft. Die konzentrierte Lösung wird dann zur Herstellung von Papierstreifenchromatogrammen benutzt, die unter Verwendung von 50 % Methanol-Formamid als stationärer Phase und 50 0/0 Benzol-Cyclohexan als beweglicher Phase entwickelt werden. Zwei Zonen werden festgehalten, von denen eine (entsprechend der beweglicheren Komponente) das für 11ß-Hydroxy-progesteron charakteristische Absorptionsmaximum im Ultraviolett zeigt und die andere (weniger bewegliche Komponente) ein Absorptionsmaximum im Ultraviolett bei etw 241 mit. Das Papierchromatogramm wird getrocknet, die der weniger beweglichen Komponente entsprechende Zone abgeschnitten und mit Methanol extrahiert. Das mit Methanol extrahierte Material wird wieder der Papierstreifenchromatographie unterworfen, wobei das vorher verwendete Lösungsmittelsystem benutzt wird. Das erhaltene Chromatogramm zeigt nur eine Spur der dem 11ß-Hydroxy-progesteron als Ausgangsmaterial entsprechenden Zone. Das Papierchromatogramm wird gründlich getrocknet, die größere Zone, die ein Absorptionsmaximum im Ultraviolett bei 241 m#t hat, wird abgeschnitten und mit Methanol extrahiert. Der Methanolextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und daraus d1,4-Pregnadien-llß-ol-3,20-dion erhalten.
Beispiel 9 201 einer Nährlösung der folgenden Zusammensetzung werden hergestellt: »Cerelose« ...................... 400 g »Edamin« . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 400 g Getreideaufschlämmung . . . . . . . . . . . 100 ml Hefeextrakt ..................... 20 g Mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 201 Diese Lösung wird mit KOH auf einen PH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 11 eines 24 Stunden alten Wachstums des Mikroorganismus Bacillus sphaericus (MB 431) geimpft. Die geimpfte Kultur wird bei 28° C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet und zu der erhaltenen Kultur eine Lösung von 4 g 44-Pregnen-3,20-dion in 40 ml Dimethylformamid gegeben. Die das Steroid enthaltende Kultur wird unter Schütteln etwa 10 Stunden bei annähernd 28° C bebrütet.
Die Gärflüssigkeit wird wiederholt mit Äthylacetat extrahiert; die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird einer Zweiphasentrennung mit 70%igem wässerigem Methanol und Petroläther unterworfen, wodurch ölige, in der Petrolätherphase lösliche Verunreinigungen entfernt werden. Das Methanol der wässerigen Methanolphase wird im Vakuum abgedampft und die zurückbleibende wässerige Aufschlämmung mit Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Aceton gelöst und in Papierchromatogramme übergeführt, die unter Verwendung von 50 °/a Methanol-Formamid als stationärer Phase und 50 9/o Benzol--Cyiclohexan als beweglicher Phase entwickelt werden. Die oberen, dem 1-Dehydroderivat entsprechenden Zonen jedes Chromatogramms werden abgeschnitten und mit Methanol extrahiert; das mit Methanol extrahierte Material wird wieder der Papierstreifenchromatographie unterworfen. Die obere Zone wird wieder abgeschnitten, gründlich getrocknet, mit Methanol extrahiert und der Methanolextrakt im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Äthylacetat Petroläther umkristallisiert und daraus im wesentlichen reines d1,4-Pregnadien-3,20-dion erhalten; Smp. 148 bis 150° C.
Beispiel 10 201 einer Nährlösung der folgenden Zusammensetzung werden hergestellt: »Cerelose« . . . . . . . . . . . . . . . . ...... 400 g »Edamin« ....................... 400 g Getreideaufschlämmung . . . . . . . . . . . 100 ml Hefeextrakt ..................... 20 g Mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 201 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 11 eines 24 Stunden alten Wachstums des Mikroorganismus Bacillus sphaericus (MB 431) geimpft. Die geimpfte Kultur wird bei 28° C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet und zu der erhaltenen Kultur eine Lösung von 4 g 45-Pregnen-3-ol-20-on in 40 ml Dimethylformamid hinzugegeben. Die das Steroid enthaltende Kultur wird unter Schütteln etwa 10 Stunden bei annähernd 28° C bebrütet.
Die Gärflüssigkeit wird wiederholt mit Äthylacetat extrahiert; die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird einer Zweiphasentrennung mit 70o/oigem wässerigem Methanol und Petroläther unterworfen, wodurch ölige, in der Petrolätherphase lösliche Verunreinigungen entfernt werden. Das Methanol der wässerigen Methanolphase wird im Vakuum abgedampft und die zurückbleibende wässerige Aufschlämmung mit Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Aceton gelöst und in Papierchromatogramme übergeführt, die unter Verwendung von 50°/o Methanol-Formamid als stationärer Phase und 509/o Benzol-Cyclohexan als beweglicher Phase entwickelt werden. Die oberen, dem 1-Dehydroderivat entsprechenden Zonen jedes Chromatogramms werden abgeschnitten und mit Methanol extrahiert; das mit Methanol extrahierte Material wird wieder der Papierstreifenchromatographie unterworfen. Die obere Zone: wird wieder abgechnitten, gründlich getrocknet, mit Methanol extrahiert und der Methanolextrakt im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Äthylacetat Petroläther umkristallisiert und daraus im wesentlichen reines d1,4-Pregnadien-3,20-dion erhalten; Smp. 148 bis 150° C.
Beispiel 11 50 ccm jeder der sieben verschiedenen Nährlösungen mit Zusammensetzungen, wie sie in der nachfolgenden Tabelle angegeben sind, werden auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und durch 15minütiges Erhitzen auf etwa 120°C in einem Autoklav sterilisiert; jede Lösung wird mit einer Kultur von Bacillus-sphaericus-Mikroorganismen (MB 431) geimpft. Die geimpften Kulturen werden bei 28° C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet, und zu jeder der erhaltenen Kulturen wird eine Lösung von 10 mg Hydrocortison in 0,1 ml Dimethylformamid hinzugegeben. Die das Hydrocortison enthaltenden Kulturen werden dann unter Schütteln weitere etwa 24 Stunden bei 28° C bebrütet.
Jede einzelne so erhaltene Gärflüssigkeit wird dreimal mit je 50 ml Athylacetat extrahiert; die jeweils einer Flüssigkeit entsprechenden, aus einer besonderen Lösung stammenden Athylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Jeder der so erhaltenen sieben Rückstände wird polarographisch auf seinen Gehalt an d1,4-Prenadien-11ß,17a-21-triol-3,20-dion analysiert, indem das Halbstufenpotential bei 1,52 Volt gemessen wird. In der folgenden Tabelle sind die Zusammensetzungen der verwendeten Lösungen und die Menge an 41.4-Pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion (A'-Hydrocortison), die mit jeder derartigen Lösung erhalten worden ist, in Prozenten der theoretisch aus 10 mg Hydrocoriison als Ausgangsmaterial erhältlichen angegeben:

Beispiel 12 10 mg 44-Pregnen-11a,17a,21-triol-3,20-dion werden der Dehydrierungsaktivität von Bacillussphaericus-Mikroorganismen (MB 431) ausgesetzt und das dehydrierte Produkt gemäß dem bei der Dehydrierung von d4-Pregnen-llß-ol-3,20-dion im Beispiel 8 beschriebenen Verfahren isoliert, wodurch d1.4-Pregnadien-11a,17a,21-triol-3,20-dion erhalten wird.
Beispiel 13 10 mg d4-Androsten-3,17-dion werden der Dehydrierungsaktivität von Bacillus-sphaericus-Mikroorganismen (MB 431) ausgesetzt und das dehydrierte Produkt gemäß dem bei der Dehydrierung von d4-Pregnen-11ß o1 3,20-dion im Beispiel 8 beschriebenen Verfahren isoliert, wodurch d1,4-Androstadien-3-17-dion erhalten wird.
Beispiel 14 50 ml der im Beispiel 8 beschriebenen »Edamin«-Lösung werden auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und durch 15minütiges Erhitzen auf etwa 120° C in einem Autoklav sterilisiert. Die sterilisierte Lösung wird mit Bacillus-sphaericus-Mikroorganismen (A. T. C. C. - 245) geimpft, die geimpfte Kultur bei 28° C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet und die erhaltene Kultur zu einer Lösung von 10 mg Hydrocortison in 0,1 ml Dimethylformamid hinzugegeben. Die das Hydrocortison enthaltende Kultur wird dann unter Schütteln weitere etwa 10 Stunden bei 28° C bebrütet.
Die so erhaltene Gärflüssigkeit wird dreimal mit je 50 ml Athylacetat extrahiert; die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der so erhaltene Rückstand wird polarographisch analysiert, indem das Halbstufenpotential bei 1,52 Volt gemessen wird, und enthält eine Menge an 41.4-Pregnadien-11ß,17a21-triol-3,20-dion, die einer Ausbeute von mehr als 50% der theoretisch aus 10 mg Hydrocortison als Ausgangsmaterial erhältlichen entspricht.
Beispiel 15 50 ml der im Beispiel 8 beschriebenen »Edamin«-Lösung werden auf einen pa-Wert von 7 eingestellt und durch 15minütiges Erhitzen auf etwa 120° C in einem Autoklav sterilisiert. Die sterilisierte Lösung wird mit Bacillus-sphaericus-Mikroorganismen (A. T. C. C. -7054) geimpft, die als eine Abart fusiformis von Bacillus sphaericus manchmal als Bacillus fusiformis erwähnt werden. Die geimpfte Kultur wird bei einer Temperatur von 28° C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet. Zu der erhaltenen Kultur wird eine Lösung von 10 mg Hydrocortison in 0,1 ml Dimethylformamid hinzugegeben. Die das Hydrocortison enthaltende Kultur wird dann unter Schütteln weitere etwa 10 Stunden bei 28° C bebrütet.
Die so erhaltene Gärflüssigkeit wird dreimal mit je 50 ml Äthylacetat extrahiert; die Athylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der so erhaltene Rückstand wird polarographisch analysiert, indem das Halbstufenpotential bei 1,52 Volt gemessen wird; es wird ein Gehalt an d1,4-Pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion gefunden, der einer Ausbeute von über 50'% der theoretisch aus 10 mg Hydrocortison als Ausgangsmaterial erhältlichen entspricht.
Beispiel 16 50 ml der im Beispiel 8 beschriebenen »Edamin«-Lösung werden auf einen pH-Wert von 7 eingestellt, durch 15minütiges Erhitzen auf etwa 120P C in einem Autoklav sterilisiert, die sterilisierte Lösung mit Bacillus-sphaericus-Mikroorganismen (A. T. C. C. -7055) geimpft, die als eine fusiformis-Abart von Bacillus sphaericus manchmal als Baccilus fusiformis erwähnt werden. Die geimpfte Kultur wird bei 28° C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet. Zu der erhaltenen Kultur wird eine Lösung von 10 mg 9a-Fluor-d4-pregnen-11ß,17a,21-triol-3,20-dion in 0,1 ml Dimethylformamid hinzugegeben. Die das Steroid enthaltende Kultur wird unter Schütteln etwa 10 Stunden bei 28° C bebrütet.
Die so erhaltene Gärflüssigkeit wird dreimal mit je 50 ml Äthylacetat extrahiert; die Athylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der so erhaltene Rückstand wird polarographisch analysiert, indem das Halbstufenpotential bei 1,52 Volt gemessen wird; es wird ein Gehalt an 9a-Fluor-41,4-pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion gefunden, der einer Ausbeute von über 50%- der theoretisch aus 10 mg 9a-Fluord4-pregnen-11ß,17a,21-triol-3,20-dion als Ausgangsmaterial erhältlichen entspricht.
Beispiel 17 13 Teile der im Beispiel 8 beschriebenen »Edamin«-lösung zu je 50 ml werden auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und durch 15minütiges Erhitzen auf etwa 120° C in einem Autoklav sterilisiert. Jede der sterilisierten Lösungen wird mit einer Kultur von Bacillusspaericus-Mikroorganismen (MB 834) geimpft; diese Kultur wurde aus Erde eines Ölfeldes in Texas isoliert und wird als bakterielles Isolat 246 EX bezeichnet. Die geimpften Kulturen werden bei einer Temperatur von 28° C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet; jede der dreizehn erhaltenen Kulturen wird mit je einer Lösung von 10 mg einer jeweils verschiedenen 3-Hydroxy- bzw. 3-Ketosteoridverbindung in 0,1 ml Dimethylformamid versetzt. Die die verschiedenen Steroide enthaltenden Kulturen werden dann unter Schütteln weitere etwa 10 Stunden bebrütet.
Jede der so erhaltenen Gärflüssigkeiten wird für sich dreimal mit je 50 ml Äthylacetat extrahiert; die jeweils einer Flüssigkeit entsprechenden, aus einem besonderen Steoridsubstrat stammenden Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Jeder der so erhaltenen dreizehn Rückstände wird in Aceton gelöst und in Papierchromatogramme übergeführt, von denen jedes unter Verwendung des in der folgenden Tabelle für das einzelne Substrat als Ausgangsmaterial angegebenen Lösungsmittelsystems entwickelt wird.
Die oberen, den 1-Dehydroderivaten entsprechenden Zonen jedes Chromatogramms werden abgeschnitten, jede für sich mit Methanol extrahiert und das mit Methanol extrahierte Material wieder der Papierstreifenchromatographie unterworfen. Die oberen Zonen werden wieder abgeschnitten, dann getrocknet, mit Methanol extrahiert und die Methanolextrakte im Vakuum zur Trockne eingedampft. Für jedes als Ausgangsmaterial verwendete Substrat wird die besondere, in der folgenden Tabelle angegebene d1,4-Ketosteroidverbindung erhalten.

Claims

PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Herstellung von 1,4-Bis-dehydro-3-ketosteroiden, dadurch gekennzeichnet, daß man ein 1,2-Dihydro-d4-3-keto- oder -45-3-hydroxy (bzw. -alkanoyloxy- bzw. -benzoyloxy-) steroid mit einer Kultur von Bacillus sphaericus oder den daraus gewonnenen Enzymen unter bekannten aeroben und submersen Bedingungen bebrütet.