DE1768215A1 - Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Steroiden - Google Patents

Description

Das Hauptpatent._oeo.ο(Patentanmeldung K 60 488 IVb/12 o) bezieht sich auf ein Verfahren zur Erzeugung von oteroiden,die in 17-3tellung keinen kohlenstoffenthaltenden Substituenten aufweisen,- und z-"ar durch mikrobiologische Umwandlung von Steroiden, die tifti gesättigte oder ungesättigte aliphetische Gruppe mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in 17-Stellung ent~ halten, mittels Organismen der Art Mifcobacterium, die in der Lage sind, das Ringsystem des als Ausgangsmaterigl verv/endeten iteroi^p abzubauen, wobei dieser Abbau des Eingsyytems verhindert "/iru durch Durchführen der mikrobiologinchen Umband 1 un_r: in Gegenwart ein:s anorganischen Inhibitors. -Ir; Inhibitoren dienen speziell anorganische Ionen.

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1. O q H Ί B / I L η k

_BAD

Mikroorganismen, die in der Lage sind, das Kingsystem der speziellen iirt dieser Steroide abzubauen. Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Steroiden mit der Grundstruktur Dimethyl-cyelopentanoperhydrophenanthren, die eine Oxo-, Hydroxy-, Alkoxy- oder Acyloxy-Gruppe an dem Kohlenstoffatom in 3-Stellung und eine Oxo- oder Hydroxy-G-ruppe am Kohlenstoffatom in 17-Stellüng mit der Massgabe aufweisen, da_os - wenn eine Hydroxy-Gruppe an dem.Kohlenstoff in 17-Stellung sitzt - in dieser stellung keine anderen ^ Substituenten vorliegen,und zwar durch mikrobiologische Umwandlung von Steroiden, die die Grundstruktur der obigen Au^- gangsmaterialien aufweisen und die eine Oxo-, Hydroxy-, Alkoxy- oder Acyloxy-Gruppe an dem Kohlenstoffatom in 3-Stellun:- aufweisen und die eine ß-orientierte aliphatische Kohlenvasserstoff-Gruppe mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen an dem Kohlenstoffatom in 17-3tellung aufweisen, in Gegenwart eines anorganischen Ions als Inhibitor, unter Durchführung der Unr/andlung mittels Enzymen von Mikroorganismen,^vwlnn kein Inhibitor zugegen ist, in der Lage sind, die Grundstruktur abzubauen mit Ausnahme von Enzymen von Mikroorganismen der Art Micobaeterium»

Die Mikroorganismen gemäss der Erfindung nahen die Fähigkeit, gemeinsam die dtruktur des Dimethyl-cyclopentanoperhydiOphemmthren - wenn kein Inhibitor zugegen irt - abzu-

2k-;:-'IrK¹Ci¹O ^vei ··· ■ . .. 3p-zLe£3 d--:-r ^ten Noo-ird Lm uri-1 thrcibao \.--·ν»

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Geeignete ^usgangsmaterialien sind zum Beispiel: Cholesterin, ß-Sitosterol, Stigmasterol, 4-Gholesten-3-on und Campesterol, die alle zu der Klasse üer 3-Keto oder 3-Hydroxy-steroide mit einer aliphatischen beitenkette von mindestens S Kohlenstoffatomen in 17-Stellung gehören. Auch Derivate riie-.if-r Sterole können verwendet'werden, zum Beispiel Choleste^ylbetainatchloii:; , Cholesterylacetat, Cholesterylhemi-' succinct=·^fo^er substituierte oterole, wie' ^^Ghlorocholestanol ""oder Sterole , deren Α-Ring einen oder mehrere Substituenten

Infolge des Zugegenseins eines Inhibitors im Reaktionsme dium, in dem die mikrobiologische Umwandlung der Steroide stattfindet, bleibt die Grund struktur der Steroide erhalten und es wird lediglich- die aliphatische Seitenkette in IT-Stel lung angegriffen. Besonders geeignet für diesen Zweck sind anorganische Ionen, wie zum Beispiel da^ Nickelion, Kobaltion, Cadmiumion und Selenit-Ion.

Die Erfin.ung bezieht sich insbesondere auf die mikrobiologische erzeugung von Steroiden mit eier Grundstruktur Limethyl-cy-clopentanoperhydrophenanthren und speziell auf die Herstellung von l,4-Androstadien-3»17-dion und 4-Androsten-3,17-dion,

Die Keto-O-ruppe in 17-Stellung kann, wenn am Kohlenstoffatom 16 keine Bubstituenten vorliegen, leicht mittels

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der Zimmerman-Reaktion festgestellt werden (V/, Z immer man, Hoüpe üeylers Z.Physiol.Chemie 233 (1935) 257)«

Androstadiendion ist wertvoll, weil es Aung'mgsmaterial für die Herstellung von Verbindungen mit androgener, estrogener, anabolischer und antikonzeptioneller Vv^rirksamkeit ist.

Das neue Verfahren m^cht es unter anderem mö lieh, Cholesterin, wie es in der Natur vorkommt und vie es als solches nur in einem begrenzten Ausmass verwendet wird, in ein Zwischenprodukt von grossem Wert umzuwandeln.

Bei der eigentlichen Durchführung des Verfahrens ist es notwendig, die Mikroorganismen in einem Lledium zu kultivieren, da_s eine anorganische oier organische Stickstoffquelle enthält; zum Beispiel sind Aminosäuren, Ammoniumsalze, Alkalinitrate, ürdalkaliniträte, Peptone, ^ainmair-.'chef lüssi;keit, Hefeextrakt, Baumwollsamenmehl, Sojabohnenmehl, sogenannte "distillers solubles" und dergleichen durchaus geeignet» Assimilierbare wuellen von Kohlenstoff,wie Zucker, Stärke, mehrwertige Alkohole, können in den Media verwendet werden, obwohl in den meisten Fällen daq Zuge^ensein einer organischen Jtickstoffquelle hinreicht , Überdies konn ein geeignetes Medium auch die übliche Menge von jalze, v/ie Phosphaten, julfaten und Chloriden von Alkali- und erdalkalimetallen enthalten. Spurenelemente sind üblicherweise bei Verwendung

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von Leitungswasser in hinreichender Menge zugegen.

^vrerden natürliche, aus komplizierten Mischungen bestehende stickstoff quellen vervendet, wie Maismaischef lüssi;~keit,. so kann der Zusatz von Mineralsalzen meist unterlassen werden.

Die Medien werden in üblicher Weise sterilisiert und können danach einen pH-V/ert von 4 bis 8,5 besitzen, wobei eine Azidität von etwa 7 üblich ist»

Wenn die Zellen unter dauernder Belüftung hinreichend gewachsen sind, kann das Steroid,zum Beispiel Cholesterin oder ß-üitosterol, entweder in einem geeigneten Lösungsmittel, *-yie Ν,Ν-Uimethylformamid gelöst oder in Form einer feinen Suspension in Wasser zugegeben werden. ·

Die Menge des zuzugebenden Inhibitors hängt von den Umständen ab. Ist die Konzentration zu niedrig,-so wird das ^

zugegebene steroid vollständig zu Substanzen mit einem niedrigen Molekulargewicht abgebaut. Ist die Konzentration zu hoch, so wird die Umwandlung des Steroids erheblich verzögert bzw. inhibiert und die Mikroorganiiiien können in manchen Fällen

abgetötet werden. Wenn NiSO,«7H_OQ verwendet wird, so kann eine - 4 2

Konzentration von 10-1000 mg pro Liter hinreichend sein,obwohl

re

es Umstände gibt, in denen eine niedrigeToder höhere Konzentration erwünscht ist. Wird Kobaltchlorid, Gadmiumsulfat oder

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Natriumselenit verwendet, fällt die Konzentration üblicherweise in den oben angegebenen Bereich.

Der Zeitpunkt des Zugebens des steroids liegt zwischen 0 und 72 Stunden nach dem Animpfen, obwohl brauchbare Recultate auch bei späterem Zugeben erhalten v/erden. Vorzugsweise jedo4i findet das Zugeben 24 bis 48 Stunden nach der Inokulierung der Kultur statt, wenn die Mikroorganismen hinreichend gewachsen sind, ßin sehr frühes Zugeben, zum Beispiel unmittelbar nach dem Inokulieren, ist möglich. Der Inhibitor wird im allgemeinen zusammen mit dem oter.oid zubegeben, da die Bakterien nicht getötet werden, wenn der Inhibitor in geeigneter Konzentration zugegeben wird. Diese kann leicht festgestellt werden durch Vergleich mit durch Aufstreichen der Kultur, nach Zusetzen des Steroids und Inhibitors auf ein geeignetes Kulturmedium erhaltenen Kulturen.

Die Umwandlung des Steroids findet bei dauerndem Belüften bei einer"Temperatur zwischen 20° und 45°C statt,auch wenn das Verfahren bei niedrigerer oder höherer Temperatur ebenfalls vor sich geht·. Vorzugsweise lässt man die Reaktion bei einer Temperatur von 30⁰C verlaufen, obwohl es nicht notwendig ist, dass die Temperatur während des "'achsens der Kultur und des Abbauprozesses die gleiche ist. Die Mikroorganismen können zunächst während 24 Stunden bei 26°C zum Wachsen gebracht werden, wonach die Temperatur auf 30 C nach Zusetzen von Steroid und Inhibitor erhöht werden kann,

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Die Urav/andlung des zugesetzten üteroidr niattt 1 - 7 Tage in Anspruch; in der Regel steigt die -^enge des gewünschten EndproGuktes npch einer Zeitdauer von drei Tagen nicht mehr an, Sin wichtiges Hauptprodukt, das aus Sterolen ohne weitere Substitution im A-Üing gebildet wird, ist 1,4-Androstadien-3,17-dion mit geringen Mengen von 4-Androsten-3,17-dion, wobei das Ausbeuteverhältnis unter anderem von der Belüftung abhängt. Die oben dargelegten Bedingungen führen zu einer erwünschten Be- _A vorzu.juns der Bildung von l,4-Androstadien-3,17-dion gegenüber 4-Androsten-3,17-dion. Die gebildeten Steroide können aus der Kulturflüssigkeit durch extraktion mit einer mit 7/asser nicht mi-chb.aren Flüssigkeit, wie Methylisobutylketon, Äthylacetat, Kethylenchlorid oder Chloroform, gewonnen werden. Die Extrakte v/eraen zur Trockne abgedampft; der Rückstand wird mit einem organischen Lösungsmittel zur Entfernung von nichtumgewandelten Substra ijwie zum Beispiel Cholesterin oder Stigmasterol,extrahiert, ' .

Die verbleibende Pestsubstanz kann dann weiter gereinigt und durch Chromatographie oder Umkristallisieren in ihre Komponenten zerlegt werden·

Da geeignete Mikroorganismen notwendigerweise Enzyme erzeugen, die das itingsystem der erwähnten Steroid-Substrate mit einer aliphatischen G-ruppe von mindestens 8 Kohlenstoffatomen in 17-ötellung anzugreifen vermögen, ist es möglich, geeignete Mikroorganismen nach den allgemein bekannten Verfahren aufzu-

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finden^ durch Konzentrierung dieser geeigneten Organismen aus natürlichen Quellen, wie Boden, Dung, Oberflächenwasser usw. Zu diesem Zweck wird ein Kulturmedium verwendet, da_p Cholesterin als einzige Kohlenstoffquelle enthält, zusammen mit einigen Salzen. Da_s Kulturmedium wird mit Gartenerde, Dung usw. inokuliert und nach der Inkubation bei einer geeigneten Temperatur, zum Beispiel einer Temperatur zwischen 10 und 40⁰C inkubiert, obwohl auch höhere oder niedrigere Temperaturen nicht ausgeschlossen sind. Die Kultur kann auf einer vibrierenden oder ,umlaufenden ο c hütte !map; chine geschüttelt werden, jedoch können auch ungeschüttelte Kulturen für don Konzentrieren der geeigneten Mikroorganismen vurv,endet w.rden. Auch ist es als möglich befunden worden, da ^, Medium in hslbfester Form (Agar-Agar) zu verwenden und die gewünschten Mikroorganismen in Petri-Schalen zu konzentrieren. 5s kann vorteilhaft sein, den Boden einige Monate oder Wochen vor seiner Verwendung mit Cholesterin oder einem Kohlenwasserstoffgemisch zu vermengen. Auf diese Weise wurde Nocardia Stamm CBS Nr. 226.67 aus einem Boden erhalten, der mit verbrauchtem Schmieröl gemischt war. Das für das Konzentrieren verwendete Medium kann zum Beispiel die folgende Zusammensetzung hoben:

Ammoniumnitrat 1 g/Liter

Na₂HPO₄ 1 g/Liter

Cholesterin 1 g/Liter

Leitungswasser

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-L>ie so konzentrierten Mikroorganismen sind nach dem Kultivieren in einem geeigneten Kulturmedium in der Lage, die üteroid-Äusgangsprodukte anzugreifen, wie zum Beispiel Cholesterin oder ß-Sitosterol. Wenn dieser Abbau in Gegenwart eines der erwähnten anorganischen Inhibitoren vor sieh geht, wird ein Steroid mit 19 Kohlenstoffatomen gebildet. Dieses Steroid ist in den meisten "fällen 3,17-Dioxo-l,4-androstadien₉ wenn unter anderem auch 3,17-Dioxo-4-androsten in kleinen Mengen gebilde/t wird» -

Auf diese Weise ist es möglich, eine grosse Anzahl von Stammen geeigneter Mikroorganismen zu isolieren,, Die folgenden mögen erwähnt werden:Arthrobacter Spezies, Stamm CBS Nr_e 220.67,. Arthrobacter Spezies, Stamm CBS Nr„221«67, Arthrobacter Spezies, Stamm CBS Nr₀222,67, Arthrobacter Spezies, Stamm CBS Nr. 223.67, Nocardia Spezies, Stamm CBS Hr.226ο67* Die CBS-Zahlen sind die registrierten Zahlen der bei dem Centraal Bureau voor Schimmelcultures in Baarn (Niederlande) hinterlegten Kulturproben des Mikroorganismus,

Bemerkt sei, dass es nicht notwendig ist, die gewünschten Stämme in dieser Weise zu konzentrieren und zu isolieren. Es ist auch möglich, die Mikroorganismen aus dem Boden und anderen geeigneten Materialieh zu isolieren und dann festzustellen, ob sie die gewünschten Eigenschaften besitzen. So wurden wässrige Suspensionen des Bodens auf ein geeignetes Medium, wie zum Beispiel otärke-Agar oder Asparagin-Agar aufgestrichen.Zur Unterdrückung des normalen Wachsens der Pilze wurde ein

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fungizides Antibiotikum zugegeben, zum Beispiel 15 /Ug Primaricin pro ml. Bei vorhergehender geeigneter Verdünnung der.. Bodensuspension können gesonderte Kolonien von Mikroorganismen isoliert werden. Diese Mikroorganismen können dann in einem Medium kultiviert werden.und die Kultur kann auf ihre Fähigkeit, Steroide anzugreifen, die in 17-Stellung einen gesättigten oder ungesättigten aliphatischen liest von mindestens 8 Kohlenstoffatomen bilden, geprüft werden. Wird der Ibbau in G-egenvart ein°s Inhibitors gemäss der Erfindung durchgeführt, so wird der Abbau des Ringsystems des Steroids unterdrückt und ein Steroid mit 19 Kohlenstoffatomen erhalten, zum Beispiel 3,17-Dioxo-1,4-androstadien_e Auf diese Weise wurde eine Anzahl von Nocardia-Spezies isoliert, die in der Lage sind, Cholesterin anzugreifen und abzubauen und nach Zusetzen des anorganischen Inhibitors gemäss der Erfindung ein Steroid mit 19 Kohlenstoffatomen zu erzeugen. Insbesondere Kocardia Spezies, Stamm CBS Nr. 224.67 und Nocardia, Stamm CBS Nr. 225.67 haben sich für das vorliegende Verfahren als besonders geeignet erwiesen.

Die folgenden Beispiele zeigen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung«

Beispiel I

Eine Inokulationskultur von Npcardia Sp. Stamm CBS Nr.225.67 wird hergestellt durch Inokulieren einer Kultur dieses Mikroorganismus auf Pepton-Glukose-Agar, Inkubieren während drei Tagen bei 30⁰C in einem Medium aus einer Lösung von 10 g

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Hefeextrakt (DIPCO) in 1 Liter Leitungswasser vom pH-Wert 6,8, das vorhergehend 30 Minuten bei 110 C sterilisiert worden war. Das Medium liegt in 500-ml Kolben vor; jeder Kolben enthält 100 ml Medium.

Die Kultur wird während. 48 Stunden bei 30⁰C auf einem umlaufenden ochüttelapparat mit einer Geschwindigkeit von 250 Drehungen pro Minute und einem Schiit te Iw eg von 2 1/2 cm ge— schüttelt;danach sind die Mikroorganismen hinreichend zur weiteren Inokulierung entwickelt. Das Hauptfermentationsmedium wird hergestellt durch Verdünnen von jeweils 3 g Maismaischef lüssig.. keit (berechnet auf Trockensubstanz) mit Leitungswasser zu 1 Liter, Auflösen von 3 g Glukose in der Flüssigkeit und Einstellen des Mediums auf einen pH-Wert von 7 mit wässrigem w'atrimnhydroxyd. Dieses Medium wird in 12 Kolben 30 Minuten bei HO⁰C sterilisiert, Die 2-Liter-Kolben enthalten je 1 Liter Medium.Die Kolben werden nun mit'der Inokulationskultur , deren Herstellung oben beschrieben ist, inokuliert, wobei 50 ml zu jedem Kolben ^ zugegeben wurden. Der Inokula-tions-Prozentsatz beträgt also 5 /j«

Die Kolben werden 24 stunden bei 30⁰C - wie oben beschrieben - geschüttelt«

Das Substrat, Cholesterin, wird in einem Mörser unter Zugeben von „asser, dos 0,1 °/o Tween-80 enthielt, gepulvert. Die Suspension wird zu den oben erwähnten Kulturen in solcher Menge zugegeben, dass jeder Kolben 1 g Cholesterin enthält. Zur gleicher

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Zeit wird eine sterile Lösung von 500 mg CoCIp·6H₂O in Wasser zu jedem Kolben zugegeben, was 125 mg Kobaltionen pro Liter entspricht» Die Kolben werden dann unter den gleichen Bedingungen weitergeachüttelt. Bereits 12 - 24 Stunden noch dem Zufügen von Cholesterin kann das.Zugegensein von 3»17-DiOXo-I,4-Andro3tadien und 3,17-Dioxo-4-androsten durch Dünnschichtchromntographie nochgewiesen werden. Dafür werden einige wenige Milliliter der Kulturflüssigkeit mit einem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert; das Chromatogrophieren des Extrakten wird unter Verwendung von Silikagel G- gemäss STAHL durchgeführt.

Auch können DC-Fertigplatten Kieselgel Fora (Merck A.G.) verwendet werden. Der Eluent besteht aus einem Geminch von Chloroform und Äthylacetat im Volumenverhältnis von 100:6» Nach dreitägigem schütteln des Inhalts der 12 Kolben werden die Inhalte vereinigt; das Gemisch wird dreimal mit 20^seines Volumens mit Methylisobutylketon extrahiert. Der Extrakt wird unter vermindertem Druck zur Trockne abgedampft; der Rückstjnd wird mit 8 ml siedenden Methanols extrahiert. Diese Behandlung führt zur Avtrennung von nichtreagiertem Cholesterin von dem gewünschten Produkt. Aus dem Hackstand können 5,2 g Cholesterin wied er gewonnen v/erden. Der Methanol-Extrakt enthält da<* Androste-

diendion. Nach dem .bclamnf en zur Trockne wird der Rückstand "InN Benzol
Aufgenommen; die Lösung wird in einer Kolonne mit 150 g Tonerde

O-z nach Wo elm, neutral, Aktivität III) chrom.·: tographiert.

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Die Kolonne wird mit einem Gemisch von Benzol und .aceton (10 : 1) elulert. Die Androstadiendion enthaltenden Fraktionen werden durch Dünnschichtchromatographie ermittelt. Diese Fraktionen werden vereinigt und abgedampft.

Der Rückstand (710 mg) wird aus einem Genisch von Aceton und Heptan (1:3) umkristallisiert. Als Endprodukt ergeben sich 640 mg reines Produkte Der ochmelzpunkt beträgt 139,5 - 14O,5°C; eine sehr reine Probe Androstadiendion schmilzt bei 141-142⁰Ce Ein Ger.isch der beiden kristallinen Produkte zeigt keine Erniedrigung des Schmelzpunktes. l>ie Infrarot-Spektren der beiden Proben sind identisch. Die Ausbeute an kristallinem Produkt, bezogen auf -verwendetes Cholesterin, ist 12,9 °fo·

Beispiel II .

Gemäss dem in Beispiel I beschriebenen Verfahren wird eine Kultur Arthrobacter Sp.Stamm CBS Nr.220,67 hergestellt.

Die Umwandlung wird durchgeführt in drei 500-ml Kolben mit je 100 ml Medium. Auch hier entspricht die Menge Inokulierungskultur 5 /δ des Volumens des Hauptfermentationsmediums. Die Kolben werden in der üblichen Weise bei 30 C geschüttelt;jedem Kolben werden 200 mg Cholesterin und 50 mg NiSO.,7H₂O 24 Stunden nach dem Inokulieren zugegeben, wonach die Kolben weitergeschilttelt v/erden. Nach einer Inkubation von 3-4 Tagen beträgt die Genamtmenge an 3,17-Dioxo-l,4-androstadien in den Kolben 70,2 bis 112 mg. In den meisten Fällen werden auch geringe Mengen

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3,17-Dioxo-4-androsten gebildet. Im allgemeinen verschwindet jedoch der grösste Teil dieser Verbindung η ch dem Schütteln wäh«· rend einiger Tage«

Die Ausbeute variiert zv/i sehen 16 und 25,6 $, bezogen auf zugefügtes Cholesterin»

Beispiel III

G-emäss dem Verfahren des Beispiels II wird eine Kultur Arthrobacter Sp.Stamm CBS Nr₀ 221,67 verwendet«

Zu jedem Kolben werden 400 mg Cholesterin und 50 mg CoClpeoHpO zugegeben. Nach viertägigem schütteln bei 30⁰C können 52 mg 3,17-Dioxo-l,4-androstadien aus jedem Kolben auf die in Beispiel I beschriebene Weise isoliert werden. Die Menge an gebildetem 3»17-Dioxo-4-androsten ist vernachlässigbar gering.Die Menge an nichtreagiertem Cholesterin beträgt in jedem Kolben 290 mg W JiiS werden also 110 mg Cholesterin in jedem Kolben umgewandelt, woraus sich theoretisch nicht mehr als 80 mg 3»17-Dioxo-1,4-androstadien bilden können. Die Umwandlung geht also in einer Ausbeute von 65 °ß>t bezogen auf umgewandeltes Cholesterin, und 17,8 $, bezogen auf zugesetztes Cholesterin, vor sich»

Beispiel IV

Analog Beispiel III wird Arthrobacter Sp»Stamm CBS Nr. 222_# 67 verwendet. Isolierung und Reinigung gemäss Beispiel I ergibt 29 mg 3»17-Dioxo-l,4-androstadien in jedem Kolben nach

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viertägigem öchüttelri. Die Ausbeute beträgt 10 ?ί, bezogen auf zugesetztes Cholesterin..

Beispiel V

Das Verfahren des Beispiels IV wird unter Verwendung von Arthrobacter Sp.Stamm CBS Nr.· 222.67 mit dem Unterschied durchgeführt, d,_:ss 50 mg NiSO.eTILjO jedem Kolben zugegeben wird« 24 Stunden nach dem Zusetzen von Cholesterin und Inhibitor kann durch Dünnschichtchromatographie, wie in Beispiel I beschrieben, das Zugegensein von 3»17-Dioxo-1,4-Androstadien und 3»17-Dioxo-4-androsten festgestellt werden.

Beispiel VI

Das Verfahren gemäss Beispiel IV wird durchgeführt mit dem Unterschied, dass Arthrobacter Sp.jtamm CBS Nr. 221,67, Arthrobacter Sp.Stamm C3S Nr. 223<>67j bzw«, Nocardia Sp, Stamm CBS Nr. 225o67 ' "benutzt werden. Bei Verwendung von NiSO,.7HpO als Inhibitor wird 3,17-Dioxo-l,4-androstadien in Mengen, die von 24 - *8 mf in je^em Kolben variierten, festgestellt, sodass die Ausbeute, bezogen auf zugesetztes Cholesterin, von 8,2 bis 13 fi variiert«,

Beispiel VII _ ■

5s wird wie im Beispiel I beschrieben, eine Inokulierungskultur von Nocardia Sp. Stamm CBS Nr, 224«67 hergestellt. Das Hauptfermentationsmedium besteht aus einer Lösung von 5 g MaismaischeflUssirkeit (als Peststoff berechnet) pro Liter

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Wasser mit 1 g Hefeextrakt (DII¹CO). Das Medium wird auf pH 7 mit wässriger Natriumhydroxydlösung eingestellt und 30 Minuten bei HO⁰C sterilisiert. Die verwendeten 500-ml"Kolben enthalten je 100 ml dieses Mediums. Der Inokuli^rungsprozentsatz beträgt 5 <fo.

Nach 24-stündigem Schütteln wird zu jedem Kolben 200 mg Cholesterin in Form einer wässrigen Suspension und eine Lösung von 50 mg CoClp^öHpO zugegeben. Nach dreitägigem Schütteln werden 32 mg 3,17-Dioxo-1,4-Androstadien aus jedem Kolben nach dem in Beispiel I beschriebenen Verfahren isoliert. Die Ausbeute beträgt 22 $, bezogen auf eingesetztes Cholesterin.

Beispiel VIII

Wie in Beispiel VII beschrieben, v/ird eine Kultur Nocardia Sp-.Stamm CBS Nr,224.67 hergestellt. Zu jedem Kolben werden 200 mg Cholesterin und 15 mg CdSO. zugegeben. Nach 24 stündigem Schütteln kenn durch Dünnschichtchromatogrophie, •-vie in Beispiel I beschrieben, das Zugegens ein von 3,17-jjioxo-l,4-androstadien festgestellt herden»

Beispiel IX

Eine Kultur von Nocardia Sp.ljtamm CBS Hr.224.67 oder Nocardia Sp.Stamm CBS Nr. 225.67 wird auf die in Beispiel VII beschriebene V/eise hergestellt. Zu jedem Kolben v/erden 200 mg Cholesterin und Natriumselenit in von 3 bis 10 mg pro Kolben (30 bis 100 mg/Liter) variierenden Mengen zugesetzt. Nach 24stündigem schütteln kann durch Dünnnohichtchromatographie, wie in Beispiel I beschrieben, das Zu^^enr.e-in eines Gemir-cht-r

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von 3,17-üioxo-l,4-androstadien und 3,17-Dioxo-4-androsten in jedem Kolben festgestellt werden«

Beispiel X ■

Gemäss dem Verfahren des Beispiels II wird eine Kultur von Arthrobacter Sp.Stamm CBS Nr.221_β67 hergestellt;anstelle von Cholesterin werden 200 mg ß-Sitosterol zugegeben_eDer Inhibitor ist NiSO. ·7H₂O«-Nach: 3 Tagen enthalten die Kolben ' m 3,17-Dioxo-1,4-Androstadien in von 19 bis 24 mg in jedem Kolben variierender Menge «,Die Ausbeute ist etwa 15 °/°i bezogen auf zugegebenes ß-Sitosterol.(Das im Handel erhältliche ß-Sitosterol enthält eine Anzahl von Steroid.en praktisch gleicher struktur,sodass eine exakte Bestimmung der Ausbeute nicht möglich ist)·

Beispiel XI

Das Beispiel X wird wiederholt, mit dem Unterschied, dass eine der folgenden Kulturen verwendet wird;Arthrobacter Sp. ötamm CBo Nr.222,67 bzw. Nocardia Sp.Stamm CBS Nr.226.67 . In beiden Fällen kann das Zugegensein von 3,17-Dioxo-1,4-androßtadien nach 3 Tagen unter Verwendung der Dünnschichtchromatographie ,wie im Beispiel I beschrieben,festgestellt werden« .

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Beispiel XII

G-einäss Beispiel II wird eine Kultur Nocardia üp.btamm CBS Nr. 225e67 in 4 jeweils 100 ml Medium enthaltenden Kolben hergestellte Zu jedem'Kolben werden 50 mg von CoClpoßHpO zugefügt. Zu dem Inhalt der 4 Kolben werden v/änsrire suspensionen von

a) 3-0xo-4-choleEten

b) Stigmasterol

c) 5oÄ»-Chloi"ocholestanol und

d) eine Lösung von Chol .-sterylbetainat-chlorid

zugegeben«

In allen Fällen beträ.rt die Menge des zu jedem Kolben zugefügten Steroids 100 mg.

Nach 2 Tagen wird das Zugegensein von 3,17-Dioxo-1,4-androstadien durch Dünnschichtchromatographie, wie im Beispiel I beschrieben, festgestellt»

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Claims (1)

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von ο-^e ro id en von einer Grundstruktur:Dimethyl-cyclopentanoperhydrophenanthren:

mit einer Oxo, Hydroxy, Alkoxy- oder Acyloxy-Gruppe in
3-dtellung und einer Oxo- oder Hydroxy-Gruppe in 17-Steilung — mit der Massgabe, dass,v^renn eine Hydroxyl-Gruppe in
17-Stellung steht, keine anderen Substituenten in dieser Stellung zugegen sind - durch mikrobiologische Umwandlung von oteroiden der gleichen Grundstruktur mit einer Oxo-, Hydroxy-,Alkoxy- oder Acyloxy-Gruppe in 3-Stellung und . ™ einer ß-orientierten aliphatischen Kohlenwasserstoff-Gruppe mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in 17-Steilung in. Gegenwart ein^s anorganischen Ions als Inhibitor,
dadurch gekennzeichnet, dass die Um-andlung mit Enzynen
von Mikroorganismen durchgeführt ^vird, die den Abbau der oben angegebenen Struktur bei Abwesenheit eines Inhibitors bewirken, mit Ausnahme der enzyme von Mikroorganismen _VOn der Art Mycobacterium.

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2, Verfahren gerr.äss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, d;^;;-s die Umwandlung mittels Enzymen einer Ar.throbacte-r-5jpezieB durchgeführt wird;

3β Verfahren gemärs Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daps die Um".^randlung mittels Enzymen einer Nocardia-SpezieB durchgeführt wird_p

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