DE1568932A1 - Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Steroiden - Google Patents

Description

dLJ^iIu '}I6±- 3N SPIHITUSMuulLK Ii.Y₀, I) e 1 f t/Holland

7erJahren zur mikrobiologischen Herstellung von Steroiden»

Me Erfindung bezieht nich auf die mikrobiologische Herstellung von Dteroiden,die in 17-otellung keinen kohlenstoffhaltigen ^ubstituenten aufweisen,deren Kohlenstoffskelett die folgende Konfiguration aufweist:

Die Herstellung ,seht aus von steroiden oder uteroidderivaten, die am 17-Kohlenstoffatom als tiubstituenten eine aliphatisch^ Gruppe mit mindestens 8 Kohlenetoffatomen aufweisen«

o'iit langer ^eit ist bekannt,dass bestimmte Mikroorganismen fähig sind,oteroide mit einer jeitenkette am 17-Kob.len-3toffatom,wie zum Beispiel Cholesterin,aufapalteno Im «Jahre 1913 fand Boehng-en,dasa Bakterien der Gattung

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in einem Cholesterin als einzige Kohlenstoff quellt, enthaltenden

( 3) ^{j9b) *

Iy42 v/i dme te TAK diesem Phänomen eine ^?, chi'or se hung, in deren Verlauf er ein üakter isolierte,:· -s er My co bacterium chole^terolicum (Ant.van Leeuv/enhoek 8 (Iy42) ;-2) nannte, Danach er^hienen Publikationen über ..ie Umv/anvlun^ von Cholesterin, in denen Mikroorganismen der (i-attun-fen Prοactinom.yces , iiZotobacter, glavobacterium, ^erobacter, Pseudomonas , Nocaraia, und >jtreptom,yces erwähnt sindo

Bsi ^ieyen Um:yarKllun_t ^f;;en v/ird Cholesterin vollständig zu Vert'inuLU'iiien aiit ni;:di'i^;em iViolekularge'./icht nV^nbaut; Qü lallen tceine merkbaren Mengen von Z\;ischenpro.mieten mit ofceroid-Chnrakter an_oin geringen kennen v-urden r itunter 4-Cholesten-^-on und 7-Dehydrocholesterin festgestellt»Bei einex* Gelegenheit .vurde von 'üJlI eine geringe Menge von 4-Cholesten-3i6-dion erwähnt«

Whibmarsh versuchte den Abbau von Cholesterin (mit Nocardia) durch Zusatz eines organischen Inhibitors zu verlangsamen,in der Hoffnung,Zwischenprodukte zu isolieren,die möglicherweise einen Hinweis auf den Weg, gemäss dem der Abbau vor uich geht,gestatten,Als Inhibitor verwendete er

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8-Hyarox;".'hinolinf es in-r dabei möglich,3-Keto- /Lj-Msnorcnolen-oäure und eine sehr kleine I.Ien_t"e von 3-Keto / λ ' bi -nor^holensäure in sauren 'Jxtivkten des Kulturmediums feet- Eu^t-Ω i5D„In cer neutralen Fraktion wurden kleine mengen von l,-i--AnörG"-taüieii-3,1.7-clion und 4-Androsten-3,17-dion (bioch.J, 90 (1?64) 23P) aufgefundene

ITsah. den Auszügen von Veröffentlichungen der 150. Tagung der Amerikanischen Chemischen Gesellschaft (1965)13 Q unterwarf CeJudlH u.a₀ Ij3,5 (lO)-Choleatatrien der }i,inv;irkung von bakterien,im Hinblick auf öie Möglichkeit der Bildung von istrono&efunöen ;vurde,dass das oubstrat durch Organismen -ler Gattung Nocardia und Hycobacterium nicht umgev/andelt vrurde_o Ancererseite v/urde ciUD-'ch diese Mikroorgeniemen 19-Hydro-r-4-choltEten-3-on leicht in östron und ojlS-Oxido-^-cholesten— 3-on in 6,19-0~-ido-4-androsten-3 j 17-dion umgev/andelt_e

Ep wurde nun gefunden,dass es möglich ist,Steroidkörper herzustellen,die' in 17-btellung keinen kohlenstoffhaltigen Substituenten oder keinen Substituenten in 17**Stellung aufweisen, durch mikrobiologische Umwandlung von Steroiden,die einen gesättigten oder ungesättigten Hest mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in 17-Stellung besitzen, mit Hilfe von Organismen der Gattung Mycobaoterium,wenn die mikrobiologische Umy/andlung in Gegenwart eines anorganischen Inhibitors durchgeführt wird „

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Das Verfahren gemäss der Erfindung geht aus von Steroiden mit einem während der mikrobiologischen Umwandlung angreifbaren Ring~System.

Als Beispiele von 3-Keto-oder 3-Hydroxysteroid-Ausgangsprodukten mit einer Seitenkette in 17-Stellung seien genannt: Cholesterin,ß-Sitosterol, Stigmasterol, 4-Cholesten-3~on.

Auch ist es möglich,Derivate zu verwenden,v/ie zum Beispiel üster von S'terolen, insbesondere Choles'terilbetainchlorid, Cholesterylacetat, Cholesterylhimisuccinat oder Additionsprodukte, insbesondere 5ÄrChlorcholestanol,oder auch Sterole, in denen im Α-Ring eine oder mehrere zusätzliche Substitutionen durchgeführt wurden bzw. ein weiterer Substituent oder mehrere weitere Substituenten vorliegen. Die für die Umwandlung zu verwendenden Mikroorganismen gehöreh zu der Gattung Mycobacteriun^z.B» Mycobacterium phlei.Mycobacterium butyricum» Geeignete Inhibitoren,die den Abbau derart inhibieren,dass die Steroidringetruktur und die entsprechenden winkelständigen Methylgruppen so weit wie möglich intakt bleiben,sind sum Beispiel bestimmte anorganische Ionen,wie Nickel~Ioö| Kobätt-Ion,Blei-Ion,Kadmium-Ion und Selenit-Ion«

Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung vaa Steroiden mit einem Skelett aus 19 Kohlenstoffatomen_#<lie · . zusammen das Dimethylcyclopentanoperhydrophenanthren Skelett ,.

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bilden,and insbesondere die Herstellung von I₉4^raiuidrostadien-3,17-dion und 4-Androsten-3»17-dion_o

Die iieto-G-ruppe in 17-Stellung kann leicht _swenn keine anderen Substituenten am ^„Kohlenstoffatom vorhanden sind, mittels der Zimmermann-Reaktion festgestellt werden (W₀Zimmermann, Hoppe Seylers Z»Physiol.Chemie 233 (1935) 257)·

Das indrostadiendion ist ein wertvolles Produkt,das als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Verbindungen mit androgener,estrogener,anabolischer und antikonzeptioneller Wirksamkeit dienen kann.

Das neue Verfahren macht es unter anderem möglich,natürlich vorkommendes Cholesterin,das als solches nur in begrenztem Umfang verwendet wird,, in ein Zwischenprodukt von gross em '".. ert umzuwandelna

Eür die praktische Durchführung des Verfahrens ist das Kultivieren der Bsktei~lenspezie\s dar C-attuna; MycGfca in einem Medium notwendig,das eine anorganische oder organische otickstoffquelle enthält_vwle aum Beispiel Aminosäuren₉Ammoniumsalze ,Alkalinitrate unü Srdalkaliniträteppeptonpliaismaische-Flüssigkeit,Hefes:r&s?akt,Mehl aus Baumwoilsariien§Soys"bGhaeaiaehl₈ die eogenanD,ten "distillere*solubles¹⁵ und dergleicfeesi siaci ebenfalls sehr ge©iga@t#!Die Medien müssen keine assimilierbar©

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Kohlenstoffquelle enthalten,wie Zucker,Stärke,mehrwertige Alkohole; ihr Zngegenaein wirkt aber nicht schädigend auf den Verlauf des Verfahrens ein.Überdies enthält ein geeignetes Medium auch die übliche Menge von Sülzen,wie zum Beispiel Alkali- oder Erdolkali-Phosphaten, -Sulfaten oder -Chloriden» Spurenelemente liegen für gewöhnlich bei Verwendung von Leitungswasser ϊή· hinreichenden M_en/?en vor.

Bei Verwendung von natürlichen,aus einem komplizierten Gemisch bestehenden Stickstoff-Quellen,wie zum Beispiel Meismaische-yiüssigkeitjkann oft der Zusatz von Mineralsalzen unterbleiben.

Dia Meditii v/erden in der übliciien ',/eise sterilisiert; sie weisen naoh. dieser Behandlung einen pH-Wert von 4 bis 8,5 auf;eine Azidität von etwa 7 ist üblich.

7/erm die Zellen in dem Medium unter konstanter Belüftung hinreichend gewachsen sind,se können. z.B.Cholesterin oder 13-SItO-StUX¹Ol entweder in einen; geeigneten Lösungsmittel,wie zum Beispiel Ν,Ν-Biinethylformsmid,gelöst oder in Perm einer leinen Suspension in Wasser,zugegeben werden»

Uiu Mengt des zuzusetzenden Inhibitors hängt von den Umständen ab»Wenn, die Konzentration zu gering ist,werden die Sterlode vollständig zu Substanzen von niedrigem Molekulargewicht abgebaut* BAD ORiGlNAL

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Ist die Konzentration zu. hoch,so wird die Umwandlung des Steroids in weitem Masse inhibiert und das Mikroorganisma wird sogar häufig abgetötet«Bei Verwendung von NiSO^oTHpO reicht eine Konzentration von 10 bis 1000 mg pro Liter hin*obwohl Umstände vorliegen können,in denen eine niedrigere oder höhere Konzentration erwünscht ist.Fenn Kobaltehlorid,Bleiacetat, Kadmiumsulfat oder Natriumselenit verwendet wird,liegt die Konzentration vorzugsweise ebenfalls in dem oben erwähnten Be ireich.

Der Zeitpunkt des Zugebens der Steroide liegt zwischen 0 und 72 Stunden nach der Animpfungjbefriedigende Resultate werden auch bei späterem Zusetzen erhalten_oVorsugsweise geschieht das Zusetzen jedoch 24 bis 48 dtunden nach der Animpfung der Kultur, wenn die Bakterien hinreichend gewachsen sind„Sin sehr frühes Zugeben,zum Beispiel unmittelbar nach der Animpfung,bleibt möglich.Der Inhibitor wird im allgemeinen gemeinsam mit dem oteroid zugegeben,da die Bakterien nicht getötet werden,wenn der Inhibitor in einer hinreichenden Konzentration zugegeben wird«Dies kann leicht an Kulturen,erhalten durch Aufstreichen der Kultur nach Zusetzen von Steroid and Inhibitor auf ein geeignetes Kulturmedium festgestellt werden»

Di« Umwandlung des Steroids findet bei konstanter Belüftung 'bei einer Tempera'ufrbr zwischen 20 und 45⁰G stattjdas Verfahren ,geht auch bei niedrigeren oder höheren Temperaturen vor sich«

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Die Reaktion führt man vorzugsweise bei 3O⁰C durch;es ist jedoch nicht notwendig,dass die Temperatur während der Phase ti eier Kultur und des Abbauverfahrens die gleiche ist.Das Jiakter kann zunächst während 24 ο t und en bei 26⁰C zum ..,jchsen gebracht werden,v;on-'-ch üie 'temperatur auf ^0⁰C n;-'ch Zusetzen von steroid und Inhibitor erhöht werden Kann.

Die lim -andlung des zugegebenen steroids dauert 1 bis 7 Tage;eine riegel zeigt,dass die ^L1enge des geⁱ.vünschten endproduktes nach 3 'IW; en sich nicht weiter erhöht.-,in wesentliches üauptprodukt,das im ^aIl von oterolen ohne "eitere Substitution im A-_iing gebildet wird,ist l,4-Androstaaien-3,17-dion, mit geringen Mengen 4-Androsten-3,17-dion;die ^u^beutezahlen hängen unter anderem vom Belüften ab.Die beschriebenen Umstände führen zu einer gewünschten Vorherrschaft von 1,4-Androstadien-3,17-dion gegenüber 4-Androsten-3,17-dion_fDie gebildeten uterdjid« können aus ν er flüssigen iCultur durch extrahieren mit einer mit '.,433er nicht mischbaren Flüssigkeit erhalten werden,wie zum Beispiel Methylisobutylketon,Äthylacetat,Methylenchlorid, ChlorofornuDiese ixtrakte werden zur Trockne abgedampft; der Rückstand vird mit einem organischen Lösungsmittel zur entfernung von nichtumgewandeltem substrat,wie zum Beispiel · Cholesterin oder btigmasterol,extrahiert»

Die rückbleibende feste Substanz kann dann weiter gereinigt und in die Komponenten zerlegt werden durch Chromatographie und Umkristallisieren,

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Lie Hrfinduing wird durch die folgenden₉bevorzugte üusi'ührungsf ormen darstellenden Beispiele weiter veranschaulicht j

BiilbPIBL I

iüine angeimpfte Kultur von iiycoDacterium phlei_gütamm KNGSl 70 wirci hergestellt durch Animpfen ein-3r Kultur dieses bakters auf Bouillon und Inkubation während drei i'a.-jen bei 30°0 in einem iuedium_s bestehend aus einer Lösung von 10 g .. lief eeztrakt (DIJ¹UO) in 1 Liter Leitungswasser vom pH~.,ert 658, das vorher während 50 Minuten bei 110⁰C sterilisiert worden ist j erzeugt oUas Medium war in 2~Liter-Ji^llaschen untergebracht,, Jede i·¹ la-3che enthielt 500 ml des Mediums₀

Die Kultur wurde während 48 stunden, bei 30⁰U tu: .-iner üchiittelapparatur vom Br-ehtyp mit einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute mit einem Schüttelweg von 2 1/2 cm geschütteltpVonach die Bakterien hinreichend gewachsen waren₉ α® weiter- geimpft zu ?/erden₀

Ba^ Mamptfermentatloiasmedimn wird durch ?erdü.nneia von in jedem iPallo 5 g MaiSiiiaioolie-IPlüssi^keix (berechnet als i!ii?ookoasia.bs-i;ans) mit Leritun^sv/asser auf 1 Liter und hiatsr«=· herigss lins^elleii ei θ:«? ^lliseigteeit auf ei&en pH«Vsrt von 7 mit vsrdüaauä'i? Katroshyi^oiryalösung hergestelltoBieses leäium ;j1M iiafipsi fleßohoa vil^j,remi 30 Miauten tei HO⁰G sterilisiert ■üeäe den¹, drei ^vmlXU^QiiXgiiäGhGia enthielt 1 Xiitßi? Maäi

BAD

i'laachen vmrden nun mit einer Impfkultur,vie sie oben beschrieben ist,tm_i:-eimp-i t, vobe: ι λ ,] _^e Flasche 50 ml eingebracht 7/urden.Die Animpfung beirug ,·.■!·■. ο 5>.Die Flaschen wurden '.vührend 43 stunden bei 30⁰C v/ie oben beschrieben geschüttelt.

In jede der bisschen wurde 1 g Cholesterin eingegeben und zwar in Form einer Suspension in .■a^sar-erhalten durch Pulverisieren des oteroida in einem Llörser unter Zugeben von ■,.asser,das 0,1 <j Tween-80 enthielt.t/eiter wurde eine sterile Lösun.* von 750 mg Nio0._e7Hp0 in ..asser zu jeder Planche zugegeben,was 157 nip Nickelionen entspricht.jjie Flaschen wurden nun weiter u.n':en den gleichen i3edin,^:un^';en geschüttelt.Schon nach 12 stunden nach dem Hinzugeben von Cholesterin kann dc<s Zuf/Λ-,; ¹^iI::.;ein vor. l,4-Androntadien-5»17-dion durch Dünnschichtci.ron::. tograpn.: ΐ aux'^ezei^t "/erden.Hierzu wird bilikagel G geniäss S t ::dil verwendet;die jjluierungsf lüssigkeit besteht aus einem u-emisch von Chloroform und Äthylacetat in einem Volumverhältnis vor. 10:1_β

Nach drei l'agen Schütteln werden die Inhalte der drei flaschen zusarnmengetan und-das Gemisch dreimal mit 1/5 seines Volumens ^ethyIisobutylketon extrahiert.Der Extrakt wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampftjder Rückstaue wird mit 20 ml siedenden Methanol extrahiert,Dadurch wird äo.s nichtumgewaldelte Cholesterin entfernt.Aus diesem Rückstand können 1,6 g Cholesterin gewonnen werden.Der Methanolextrakt

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enthält da<$ ge^iiniichte ProdukteNach dem .abdampfen zur Trockne wix*d der jxeut in 8 ml'Benzol auf genommen,worauf diese Lösung über eine Kolonne chromatographiert wird„die 30 g Aluminiumo^yd (AIpO., gemäss "-,,OELlAO,neutral,aktivität III) enthielt „Die Kolonne wird eluiert mit einem Gemisch ηus Benzol und Aceton (10sl)j durch Dünnschichtchromatographie wurde festgestellt,in welche Fraktionen das l,4-Androstaüien-3»17-dion zugegen ist₀Die Fraktionen v/erden gesammelt und abgedampfte

Der Hücketand wird auc einem Gemisch von Aceton und Heptan (1:3) umkristallisiert_oAuf diese Veise werden 160 mg kristalle erhalten,aus denen nach erneuter -kristallisation L'chliesslich 138 mg'eines reinen Produktes erhalten vird«Dieser . ert entspricht einer Ausbeute von 1"),4 70, bezogen auf das verbrauchte Cholesterin«,

Der Schmelzpunkt beträgt 137 _f 5--139⁰C j der einer Probe von Androstadien-Dion τοη analytischer Qualität beträgt 137-138°C. iin Gemisch der beiden kristallinen Produkte zeigt keine Verringerung des ochmelzpunkteScDie Infrarotspektren der beiden btoffe sind identisch« ·

BEISPIEL II

Analog dem Verfahren des Beispiels I wird eine Kultur von Mycobacterium phlei _t Stamm KlNiGSi¹ 75-3/53 erzeugt«

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Die Hauptfermentation wird durchgeführt in drei 500-ml-Flaschen, von denen jede 100 ml Medium enthält.Auch hier -vird wiederum eine Animpf kultur von 5 i<> verwendet ,bezogen auf die Menge des ^riauptf ermentationsmediums.Die Flaschen werden in der üblichen Veise geschüttelt;48 Stunden nech dem Animpfen wird jeder Flasche 200 mg Cholesterin zugegeben unrJ ferner 50 mg WiSO,ο7ΗρΟ>wonach mit dem ochütteln fortgefahren wird.

Nach drei Ta_cen enthalten die drei Flaschen zusammen eine Menge an l,4-Androstadien-3,17-dion,die zwischen 188,9 und mg variiert,für gewöhnlich mit geringen Mengen von zusätzlichem 4-Androsten-3,17-dion«

Die Ausbeute variiert zwischen 42,8 und 53,6 $?,bezogen auf das zugefügte Cholesterin,,

BEISPIEL III

Bei einem Verfahren gemäss Beispiel II wird eine Eultur von Mycobacterium phlei,Stamm KNG-SF 70 verwendet.

Zu jeder der Flaschen werden 400 mg Cholesterin zugegeben; nach vier Tagen kann 93 mg l,4-Androstadien-3,17-dion mittels der im Beispiel I beschriebenen Methode isoliert werden.Die Menge des nichtumgewandelten Substrats beträgt für jede Flasche 230 mg.Es wurden also mindestens 170 mg Cholesterin in •jeder Flasche umgewandelt;die theoretische Ausbeute würde 124 mg l,4-Androstadien-3»17-dion betragen.Diese Zahlen zeigen, dass die UmwandlUÄÄ i.a ^iner JLuabeute von 75 /ό,bezogen auf

umgewandeltes Cholesterin,und von 31,6 -,O₁ bezogen auf zuössetssbe* OhoIe öterin, bet.cui^»

!BEISPIEL IV

G-eniäss Beispiel II wird Mycobac berium butyric um. ATCG 11,314 behandelt„Die Isolierung und reinigung erfolgt nach Beispiel I_{e t} Die Ausbeute betrug 30 mg l,4-Androstadien-3,17-dion in jeder iilasche nach dreitägigem SchUtteln.Die Ausbeute beträgt 20,4 #, bezogen auf zugesetztes Cholesterin,

BEISPIEL V

Ifyoobacterium phlei, Stamm KNGSI¹ 70 wird wie im Beispiel II angegeben behandelt.Anstelle von Cholesterin werden jedoch 400 mg ß-6itosterol in jede Flasche zugegeben.Kaoh 4 Tagen werden 37 mg l,4-Androstadien-3,17-dion aus jeder der Haschen gemäss Beispiel I isoliert.Dies entspricht einer Ausbeute von 13,5 $» bezogen auf zugesetztes ß-Sitosterol^ „■

BEISPIEL VI

Es wird naoh dem Verfahren des Beispiels III gearbeitet, jedoch werden 400 mg Stigmasterol in jede der Flaschen eingegeben, Naoh drei Tagen kann mittels DUnnschiohtohromatagraphie wie im' Beispiel I beschrieben l,4-Androstadien-3,17-dion festgestellt

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YlI

Eine Kultur von Mycobacterium/ phlei, dtaarn ICIfCrBi¹ 70 wird wie im Beispiel III anregeben hergestellt,wobei anstelle von 50 mg Nickelsulf-rt eine gleiche Menge von Kobaltchlorid in ju'l der Flaschen zugegeben v/ird»Naoh z'vei tätigen _■ oh Li titeln L'?i ;-0" kann durch Dünnschichtchrom^togr-iphie c!--.s Zugegensein von l,4-Androstadien-3,17-dion und 4-Andro3ten-3,17-aion f^ntj^-

BEISPIEL VIII

Es wird wie im Beiapiel VII gearbeitet|»it dem Unterschied, dass anstelle von Nickelsulfat 5 mg Kadmiumauüifat zu jeder der Flaschen zugegeben wurden_#Nach eintägigem Schütteln konnte die Anwesenheit von l,4-Androstadien-3,17-dion und 4-Androsten-3,17-dion durch Dünnschichtchromatographie feet-v<:tollt -/erden. Überdies waren zwei andere unbekannte Flecken sichtbar,die eine positive Zimmermann-Reaktion zeigen.Die Menge des Produktes wird festgestellt durch Extraktion der Flüssigkeit mit Methylisobutylketon und Chromatographieran des Extraktes auf Papier in einem System von Benzol und Heptan (5:4)»gesättigt mit Formamid, 151uierung der Flecken mit Methanol und Messen der Auslöschung bei einer '»/ellenlange von 2 44 mn in einem Unicam-Spectrophotojneteri

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Gemisch von 1,4-AiIi¹I ro et-- ^Ίΐ-η-3» 17-dion un-l 4-Λ:ιΊϊ·- ^ t e i " ,17-lion. i3t in jeder dor Ji¹I isoliert in einer Ll^ii^i you 23,4 (Ausbeute von 10 ;■■>, bezogen .~uf zugesetztes Cholesterin) zugegen«

BiLISPlJL IX

Das 'Verfahren des Beispiels YII wird wiederholt,jedoch •rird anstelle von Nickelsulf at 50 mg Bleiacetat in jeder eier flaschen verwendetoNach zwei la^en ziijt -?ioh =3hon sine beträchtliche 3l1-<α^,ν 'vo-i l,4-indro3t;iii3-i-3,17-^i""i,JT;^t₃ ¹S- -^t-illt ^vai '";t'3l"3

')dä 7erf hren de·. i3eispielt3 VII wird wiederholt, jedoch werden ancfcollö ron Hickelsulfat 50 mg w rtriuinselenit. zu jeder der flaschen zugegeben.Hittele'l)ünn--'ⁱhi,^>l.v"c"-..vciⁱritDj.iⁱ _t:hie kann das- Zu^e^risein bzv;₀ ,lie ^iIo.unj von 1,4-An-IrO-stalien-3,17-dion festgestellt · '-jrdsne 4--An^iO -λ\~ ,

gestellt jrdsne 4--An^i¹O -■' -λ\~" , 17 i-31 eb-eii-L ill ι ζ is ? J μ»

•3EI3PIEL XI

Das Verfahren des Beispiels III wird angewendet mit dem •Unterschied,dass anstelle von Cholesterin 200 mg 4-Cholesten-3-on jeder der Flaschen zugegeben werden„Nach dreitägigem Schütteln kann mittels der Methode der Auslösrihungsme^E'iru,^,

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wie sie im Beispiel VIII beschrieben ist,eine i<ienge von 25-30 mg l,4-Androsta:>ien-3,17-dion f estgea teilt ■-^r'ion, (au --.^Ί"'-;·αΐ . v-r: IC·,T-SO, 2^:fo, bezogen auf zugesetztem uhol^a tex'in)»

BuilSPr.JL XII

J]S v/ird das Verf.hrun des ."Beispiels III any elende t, mit dem Unterschied,d.MSS anstelle von Cholesterin 200 mg von leicht wasserlöslichem. Cholasterylbetainchlofin %\\ \-·.^Λzv ·Ήγ ^1ί -h ■ ι ^r/:UL;£3j2b3n -ν:.rden«Nach viertägigem Schütteln wird das Produkt isoliert und gereinigt in der ir^ri Beiiipie!¹. I beschriebenen V/eice. Auf diese '/eiäe werden 20—25 mg 1,4-Anv.z'of:tudion-' , 17—\Lon u^v..-.^: eins kleine i.ienge von 4-Androsten-3»17-dion erh-,lten (Ausbeute 18,3-22,9 °/o, bezogen auf zu^eyet^te- Ghc-1 ■; ζ i oyJ.l- I ai:i-hlor L^).

XIII

Es wird d-.^s Verfahren des Beispiels IV angewendet mit dem Unterschied,dass 200 mg 5<*rChlorcholestanol zu jeder der PIafc-chen znje.-r'i'nen ■■■/e.^Ien.Die Isolierung und Reinigung geschieht räch Beispiel I_eErhalten werden 16,7 mg l,4-Androstadien-3,17-dion und 3»9 mg 4-Androßten-3»17-dionjdie Gesaratsunbeute betrügt 13,3 )o_t bezogen auf zug2 vsb9ie3 Cholesterin.Die jebille ct;ii Produkte •?nth:il-;-ji 13,9 jS 4-λί ■ ό·· ;;.^ι-3|17--11·>η-

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Claims (2)

1. - 17 Patentansprüche

   fehren zur Herstellung von Steroiden,die in 17-Stellung keinen kohlenstoffhaltigen Substituenten enthalten,insbesondere von 1,4-Androstadien-3,17-dion und 4-Androsten-3,17-dion, durch mikrobiologische, Umwandlung von Steroiden,die einen gesättigten oder ungsoMttigten aliphatischen ReSt mit mind catena 8 Kohlenstoffatomen in 17-S"tä.-lung enthalten,unter Verwen^un,, sin;= liikroorganismus der G-attung Mvcobacterium ^⁸-^¹⁰⁰^- gekennzeichnet ,dass als AUS&angssteroide mit einem gesättigten oder ungesättigten aliphatischen Rest mit mindestens 8 Kohlenstoff atomen in 17-3tollunij =;olch? c Kvr-i 1 ü v .. r-'r- .·.> ί -:?:· V-I₅ " -j,' ·ί _li'ix-3ystem durch -lie mikrobiologiycae Umwandlung mit Mikroorganismen der G-attung iJycο"Όaοterium angegriffen werden, insbesondere Cholesterin oder ein Derivat von Chole?terin,ß-Sito-ί t:-irol oder si'-i Derivat von ß-Sitosterol,Stigmasterol oder ein Derivat von Jtivmasterol, 4-Choles ben-3-on o-lar 5-öhlorcholeo tanol r>t\-i.e -ϊΐη Derivat ψοα 5-Chlorcholestanol,und dass der Angriff des Ringayäüoraa verhindert wird durch Durchführung der mikrobiologischen Umwandlung in Gegenv/art eines anorganischen Inhibitors ₀
2. 2. Verfahren gemäss Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet,dass ein Ion als anorganischer Inhibitor verwendet wird.

   3· Verfahren gemäss Anspruch 1 bzw. 2, dadurch gekennzeichnet, dass Nickelion als anorganischer Inhibitor verwendet wird»

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   1121/1187.

   4β Verfahren gemäss Anspruca 1 ta·:/«, 2, a-KUirch .'j-.lcenriZXi'.li:. . '■■, dass Cadraiumion mis anorgunischer Inhibitor veny«=.na^t 'icdo

   Verfahren gemäss Anspruch 1 bzv/-, 2, iiH.'iiu'oh .^ek s Kobaltion als anorganiych^r Inhibitor verw^n^et wird»

   δ_β Verfahren gem-'iss Anspruch 1 bzv/_o 2, d:r uroh jeicermzi.ioh dass xileiion als tinor^inir^h^r Inhibitor vsc-r^.x ,)t v/i.r·!.

   7« '/erfahren gamä-ss Anspruch 1 bzw, 2, dadurch gekennzeichnet, el ι .^ f3 delenition -ila mor^· tnisoh.:r Inhibitor ν er -.ve η lot -vird_o

   8_e Verfahren gemäss lüisprueh 1—7,da'iui'oii _o"h1v v:.-' i..h:i: 1 ,>! Ilycobacterium phlei als Mikroorganismus v;;r--;;-n.^:.fdt >^>rird.

   9e Verfahren gemäss Anspruch 1-7»da,¹ uroh j^kennz -.lehnet,dass Itycobacterium butyricum als Mikroorganismus verwendet wird»

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