DE2343400C3

DE2343400C3 - Verfahren zur 12 ß -Hydroxylierung von Digitalis-Glykosiden der A-Reihe

Info

Publication number: DE2343400C3
Application number: DE2343400A
Authority: DE
Inventors: Hanns-Martin 7476 Onstmettingen Boy; Fritz Dr.Rer.Nat. 6840 Lampertheim Kaiser; Hans Joachim Dr. Rer.Nat. 6940 Weinheim Lubs; Ernst Prof. Dr.Rer.Nat. 7400 Tuebingen Reinhard; Kurt Dr.-Ing. 6800 Mannheim Stach
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1973-08-29
Filing date: 1973-08-29
Publication date: 1979-11-08
Also published as: GB1424964A; DE2343400A1; CH593996A5; DD113752A5; US3909357A; DE2343400B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur durch Suspensions-Kulturen von Digitalis lanata-Kal-Umwandlung von Digitalis-Glykosiden der Α-Reihe in lusgewebe. die entsprechenden der C-Reihe (Formel I und Tabelle) ι >

I)

- O

OH

OR,

Tabelle

A-Cilykosiilc	Ki	Il	C-Cilykosidc
R, 11	Il	Il	R, = Oll
Digitoxin	CII, CO	cn,co	üigoxin
/i-Acctyldigitoxin	II	Il	/J-Acetyldigoxin
u-Acctyldigitoxin	CII,	CH,	σ-Acctyldigoxin
//-Mclhyldigiloxin	U	Il	/i-Methyldigoxin
a-Methyldigitoxin	Cilucosc	CH₁CO	ii-Methyldigoxin
Purpurcaglykosid-A	Glucose	Desacctyl-Ianatosid-C
Lanatosid-A		Lanatosid-C

Es ist bekannt, daß Kulturen entdiffercnzierter Zellen von Digitalis zur Produktion von Cardenoliden nicht fiihig sind (J. M. 11. Graves, W. K. Smith: Nature 214, 1248 [1967]; E. Teuschcr: Pharmazie 28, 6 [1973]; H. Pilgrim: Phytochemistry 11, 1725 [1972]; T. Furuya et al.: Phytochcmisiry 12, 1626 [1973]). Als Ursache hierfür ist das Fehlen bestimmter Enzymsysteme, die an verschiedenen Stellen der Cardenolid-Biosynthese eingreifen, erkannt worden. So fehlt in Digitalis-Kallus-Kulturen z. B. das »Cholesterol-Side-Chain-Cleaving Enzyme«, das in der normalen Pflanze für den Abbau des Cholesterins zur Cardcnolid-Vorstufe Pregnenolon sorgt.

Weiterhin unterscheidet sich die Enzymaiisstattung der Kallns-Kulturen von der Normalpflanze an der für die Biotransformation des Progesterons zu 5/?-H-Prcgnan-30-ol-2O-on verantwortlichen Stelle. Kallus-Kulturen bilden hier 5(X-H-Pregnan-3/J-ol-20-on. Es ist deshalb auch nicht gelungen, die Gewebekultur durch Zusatz der Cardenolid-Präkursoren Cholesterin oder Progesteron zur Produktion von Cardenoliden anzuregen. Ferner ist bekannt, daß Kallus-Kulturen von Digitalis purpurea zugesetztes Digitoxin zu Purpureaglykosid-A, Purpureaglykosid-B und Gitoxin umwandeln können, daß also eine Glucosidierung und 16/?-Hydroxylierung des Digitoxins zu Glykosiden der B-Reihe stattfindet [T. Furuya et al.. Chem. Pharni. Bull. 18,1080(1970)].

Diese Umwandlung von Digitoxin in Gitoxin ist nicht nur wissenschaftlich interessant, sondern könnte auch

von einigem praktischen Wert sein, weil dieses Glykosid in Form von Acylderivaten therapeutisch genutzt wird.

Von weit größerer Bedeutung ist jedoch die Hydroxylierung von A-Glykosiden in 12/?-Stellung zu C-Glykosiden, also z. B. die Bildung von Digoxin aus Digitoxin. Es wurde überraschend gefunden, daß diese 12/)-Hydroxylierung erfolgt, wenn man Submers-Kallus-Kulturen von Digitalis lanata mit zugesetzten A-Glykosiden (Digitoxin,«- oder/J-Acetyldigitoxin, Lanato^id-A, Purpureaglykosid-A, a- oder ]3-Methyldigitoxin) inkubiert. Die Hydroxylierung findet bevorzugt in der Stufe

ίο der »genuinen Glykoside« (zu Lanatosid-C, Desacetyllanatosid-C) statt, was bedeutet, daß zugesetztes Digitoxin, a-Acetyldigitoxin. a-Methyldigitoxin erst in 4-Stellung der endständigen Digitoxose glucosidiert und später 12^-hydroxyliert wird. Im Laufe der Versuchszeit treten, besonders bei Lichteinwirkung, jedoch alle aus den Endstufen der Glykosidbiosynthese bekannten Enzymwirkungen auf: Glucosidierung, Glucoseabspaltung, Acetylierung, Desacetylierung, 12/?-Hydroxylierung (vgl. Reaktionsschema).

Reaktionsschema Umwandlung von Digitoxin in Lanata-C-Glykoside

I. bis 3. Tag bis 30. Tag , LanatosidA -» Lanatosid-C

3'"-C)CCH,
I.Tag
Digitoxin » Glucodigiloxin

-I- Glucose (Purpureuglykosid-A) -Glucose Hauptweg

+ 12-OH
Digitoxin

bis 30. Tag

I 12-C)II

+ 3'"-OCCH., /
Desacetyl-Ianalosid-C

— Glucose

Digoxin

Die einmal angebrachte 12/Mlydroxylgruppe wird jedoch bis zur Erreichung der optimalen Ausbeute an C-Glykosiden in nennenswertem Ausmaß nicht wieder abgespalten.

Von besonderer Bedeutung ist die 12/Mlydroxylierung von ß-Methyldigitoxin zu dem wichtigen 0-Methyldigoxin. Sie findet statt, obwohl infolge der Blockierung der 4-Hydroxylgruppe in der endständigen Digitoxose durch die Methylgruppe keine Glueosidicrung möglich ist und obwohl beide »Methyldigitoxoside« als tcilsynthetische Abwandlungen für Digitalis-Zellen »unnatürlich« sind.

Die Umwandlung der A-Glykoside findet hauptsächlich im Kallus-Gewebe statt, das die Reaktionsprodukte im Laufe der Zeit mehr und mehr in die Nährlösung abgibt.

Zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden nach bekannten Methoden + ) Gcwebekulturen angelegt, indem man Stengelteile von schossenden Digitalis lanata-Pflanzen oder andere Teile von ein- oder zweijährigen Pflanzen oder auch von steril gezogenen Keimpflanzen keimfrei auf geeignete Nährmedien (z. B. in Schrägagarröhrchen) aufbringt und im Licht verschiedener Intensität oder im Dunkeln bei 20 bis 25°C, vorzugsweise 24°C, bebrütet. Nach 3 bis 4, vereinzelt auch nach 6 Wochen bildet sich an den Pflanzenteilen Wundgewebe in Form von undifferen-/icrten Zellmassen, die unter Beachtung steriler Arbeitsbedingungen vom ursprünglichen Pflanzenteil getrennt und auf ein geeignetes Nährmedium in größere Gefäße (z. B. 300-ml-Erlenmeyerkolben) aufgebracht werden. Nach jeweils 4 bis 8 Wochen werden die Zellkonglomerate, die sich in dieser Zeit gebildet haben, geteilt und die Teile erneut auf frisches Nährmedium übertragen.

Die Kulturen können auf den meisten in der Gewebekultur verwendeten Nährmedien, bevorzugt auf den von Nitsch*) angegebenen, gezogen werden. Dem Medium können Wuchsstoffe (z. B. 5 mg/1 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure) zugefügt werden.

Zur Durchführung der Hydroxylierung werden die Zellkonglomerate in Suspensionskultur gebracht. Je nach Größe des vorgesehenen Reaktionsansatzes kann die Kultur in verschiedenen Gefäßen erfolgen; bei kleineren Ansätzen in Erlenmeyerkolben, bei größeren in Fermentern + ), die zur kontinuierlichen Kultur der Gewebesuspensionen geeignet sind. Die Inkubation erfolgt bei Licht verschiedener Intensität oder im Dunkeln bei Temperaturen zwischen 18 und 38°C, bevorzugt 20—25°C. Die für ein optimales Wachstum der Suspensionskultur notwendige Belüftung wird durch Schütteln der Gefäße oder Einblasen von Luft sichergestellt.

Das umzuwandelnde A-Glykosid wird in einem gceignclcn, leicht flüchtigen, mit Wasser verdünnten organischen Lösungsmittel (z. B. Alkohol) gelöst und nach Sterilfiltration der Suspensionskultur zugesetzt.

Die Versuchsdauer liegt zwischen 7 und 30 Tagen. Danach werden Gewebe und Nährlösung getrennt oder zusammen entweder direkt oder nach Vorbehandlung (Konzentrat, Lyophilisat) nach bekannten Methoden aufgearbeitet, indem man mit organischen Lösungsmitteln extrahiert, die in den Extrakten vorhandenen Glykoside direkt oder nach vorausgegangener Einwirkung von schwachen Basen zur Abspaltung der Acetylgruppe und nach Abspaltung der Glucose mit einer jS-Glucosidase — wobei man das leicht /u trennende Zweikomponentengemisch Digitoxin und Digoxin erhält — durch multiplikative Verteilung oder adsorptionschromaiographisch auftrennt und die gc suchten C-Glykoside kristallisiert.

+ ) H. K ob I i t /.,Zeil- und Gewebczüchningbei Pflanzen
G. Fischer Verlag, Stuttgart 1972.

·) Vgl. H. Koblitz, loc.cn.

') K. Reinhard: Dtsch. Apoth. Ztg. 107,1201 (l%7).

Der Reaktionsverlauf und der Zeitpunkt optimaler Ausbeute an C-Glykosiden kann durch qualitative und quantitative Dünnschichtchromatographie von Probeextrakten der Gewebe und Nährmedien aus einzelnen Versuchsansätzen, die man alle 1 bis 4 Tage zieht, verfolgt werdea

Man verwendet dazu am besten: DC-Fertigplatten Silicagel, Fließmittel I=wassergesättigtes Methylethylketon, Fließmittel II = Xylol-Methyläthylketon (2 :3)+5% Formamid auf mit Formamid imprägnierten Platten. Die quantitative Glykosidmessung erfolgt dc-direktfluorometrisch, z. B. wie in Plan ta Medica, 21,5 (1972) beschrieben.

Beispiel 1
12/J-Hydroxylierung von Digitoxin (Lichtversuch)

Als Nährmedium wird eine Lösung folgender Zusammensetzung (pro Liter Lösung) verwendet:

950 mg KNO₃, 720 mg NH₄NO₃, 185 mg MgSO₄ · 7 H₂O, 166 mg CaCb, 68 mg KH₃PO₄, 25 mg MnSO₄ - 4 H₂O, 10 mg H₃BO₃, 10 mg ZnSO₄ ■ 7 H₂O, 0,25 mg Na₂MoO₄ ■ 2 H₂O, 0,025 mg CuSO₄ · 5 H₂O, 5 ml einer Lösung aus 7,45 g Äthylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz + 5,57 g FeSO₄ · 7 H₂O pro Liter, 100 mg myo-Inosit. 2 mg Glycin, 5 mg Nicotinsäure. 0,5 mg Pyridoxin · HCl, 0,5 mg Thiamin · HCI, 0,5 mg Folsäure, 0,05 mg Biotin, 20 g Saccharose, 300 ml Kokosmilch.

In 40 Erlenmeyerkolben (300 ml) werden Suspensionskulturen aus vorkultivierten Zellkonglomeraten von Digitalis lanata-Kallusgewebe in je 50 ml Nährmedium mit je 2 mg Digitoxin, gelöst in 1 ml 40%ig. Äthanol, versetzt. Die Inkubation erfolgt auf einer Rundschüttelmaschine mit 60 bis 70 Umdrehungen/Min, unter Belichtung. Die Sauerstoffspannung beträgt dabei etwa 5 mMol O₂/Stunde und Liter. Die lnkubationsteinperatur liegt bei 24°C. Inkubationsdauer: 25 Tage.

Danach wird der Inhalt der 40 Kolben durch Filtration in Gewebe und Nährlösung getrennt. Das Gewebe wird direkt, die Nährlösung nach Einengen am Rotationsverdampfer bei 50°C gefriergetrocknet.

Trockenrückstand Gewebe: 90 g.

Nährlösung: 18 g.

Die Trockenrückstände werden getrennt 20 Min. am Rückfluß mit 80%ig. Methanol extrahiert, die Extrakte mit 30%ig. Ammonsulfatlösung versetzt und mit Pelroläther entfettet. Die Methanolphasen werden mit Wasser versetzt und fünfmal mit der Hälfte ihres Volumens Chloroform ausgeschüttelt.

Die eingedampften Trockenrückstände betragen:

Gewebeextrakt (GE) 2,5 g, Nährlösungsextrakt (N LE) 0,4 g.

Zur dc-direktfluorometrischen Glykosidbestimmung werden Proben entnommen.

Zusammensetzung in GE +NLE in % der Glykosidsumme:

Zur Isolierung der C-Glykoside als Digoxin werden GE und NLE gemeinsam wie folgt aufgearbeitet:

2,9 g Extrakt werden in 25 ml 70%ig. Methanol+ 6 ml Triethylamin 3 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen und anschließend am Rotationsverdampfer zur Trockene gebracht. Nach Zugabe von 250 ml Wasser und 500 mg Strophanthobiase läßt man 6 Tage bei Raumtemperatur stehen, versetzt danach mit 50 g Ammonsulfat, schüttelt viermal mit 80 ml Chloroform aus und bringt die vereinigten Chloroformextrakte zur Trockne (2,2 g). Nach multiplikator Verteilung im Phasengemisch Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff-Methanol-Wasser (1:1:1:1) über 4 Schritte erhält man aus der mit Chloroform extrahierten wäßrigen Phase nach Umkristallisation mit Chloroform-Methanol/Diisopropyläther42 mg Digoxin.

Beispiel 2
12/?-Hydroxylierung von Lanatosid-A (Lichtversuch)

Die Versuchsanordnung und Kulturbedingungen sind die gleichen wie in Beispiel 1 beschrieben.

Die Umsetzung wird durch Probenahmen alle 1 bis 4 Tage dc-direktfluorometrisch verfolgt. Das Optimum 2> des Gehalts an C-Glykosiden wird nach 22 Tagen erreicht. Es überwiegt die Hydroxylierung von Lanatosid-A zu Lanatosid-C, die nach dem 6. Tag verstärkt verlaufi. Vom 10. Tag der Inkubation an bilden sich auch geringere Mengen an Desacetyl-Ianatosid-C. In fast Sd gleichbleibender Menge wird während der ganzen Versuchsdauer Purpureaglykosid-A gefunden, das sich bereits am 1. Tag nachweisen läßt.

Glykosidzusammcnsetzung am 22. Tag in % der Summe:

Purpureaglykosid-A

Lanatosid-A

Digitoxin

A-Glykosidc

Desacetyl-Ianatosid-C

Lanatosid-C

Digoxin

C-Glykoside

28,2

2,8

Spur

31,0

50,0

18,5

0,5

69,0

Purpurcaglykosid-A Lanatosid-A	10 51
A-Glykosidc	61
Dcsacctyl-Ianatosid-C Lanatosid-C	7 32
C-Glykoside	39

-, B c i s ρ i c 1 3

12ß-Hydroxylierung von I .anatosid-A (Dunkelversuch)

Die Vcrsuchsbcdingiingcn sind die gleichen wie im Beispiel I mit der Abweichung, daß die Kulturen im >(> Dunkeln gehalten werden.

Ein Optimum des Gehalts an C-Glykosid wird 25 Tage nach Beginn der Inkubationszeit erhalten. 90% der Glykosidc liegen dann als Lanatosid-C vor. Die restlichen 10% sind nicht umgesetztes Lanatosid-A. v, Desacctyllanatosid-C wird nur in Spuren gebildet. Bereits nach 6 Tagen sind 31%, nach 12 Tagen 60% Lanatosid-C entstanden. Purpureaglykosid-A wird nicht gebildet.

mi Beispiel 4

12/Ϊ-1 lydroxylierung von 0-Mcthyldigitoxin
(Lichtversuch)

Die Kiiluirbcdingungen sind die gleichen wie in

b^r- Beispiel 1 beschrieben. Bereits 7 Tage nach Beginn der Inkubation ist das Optimum erreicht. Das Glykosidgcmisch setzt sich dann aus 60% /3-Mcthyldigitoxin und 40% /J-Mcthyldigoxin zusammen. Weitere Umwand-

lungsprodukte entstehen nicht. Die Hauptmenge der beiden Glykoside befindet sich während der gesamten Versuchsdauer im Gewebe.

Beispiel 5
12j9-Hydroxylierung vonoc-Acetyldigitoxin

Die Versuchsbedingungen sind die gleichen wie in Beispiel 1 mit der Abweichung, daß im Dunkeln vorkultivierte Zellkonglomerate in der Suspensionskultur nach Zusatz des «-Acetyldigitoxins erst 2 Tage lang belichtet, dann bis zum Versuchsende im Dunkeln inkubiert werden.

Nach 25 Tagen ist das Optimum der Umsetzung erreicht.

Glykosidzusammensetzung am 25. Tag in % der Summe:

Purpureaglykosid-A
Lanatosid-A

A-Glykoside

15

24

Desacetyl-Ianatosid-C
Lanatosid-C

C-Glykoside

20 56

76

Beispiel 6

12/?-HydroxyIierung von j9-Methyidigitoxin
ι» (Dunkelversuch)

Die Versuchsbedingungen sind die gleichen wie ir Beispiel 4 beschrieben mit der Abänderung, daß irr Dunkeln vorkultivierte Gewebesuspensionskulturer

i) nach Zusatz des /J-Methyldigitoxins während de: gesamten Versuchsablaufs im Dunkeln inkubiert wer den. Bereits nach 7 Tagen ist das Optimum dei Umsetzung erreicht. 70% der zugesetzten Substanz liegen als /?-Methyldigoxin vor, wovon sich 80% in dei Nährlösung befinden.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur 12/}-Hydroxylierung von Digitalis-Glykosiden der Α-Reihe, dadurch gekennzeichnet, daß man Submers-Kallus-Kulturen von Digitalis lanata mit den A-Glykosiden inkubiert und die erhaltenen Glykoside der C-Reihe in an sich bekannter Weise isoliert