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Verfahren zur Kernoxydation von in 4 (5) -Stellung ungesättigten 3-Ketosteroiden
Die Erfindung bezieht sich auf die mikrobiologische Oxydation bestimmter in 4(5)-Stellung
ungesättigter 3-Ketosteroide mit einer Art der Gattung Mycobacterium oder den von
dieser Art erzeugten oxydierend wirkenden Enzymen.
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Man hat bereits mehrere chemische Verfahren für die Oxydation verschiedener
Steroide entwickelt. Diese Verfahren, insbesondere solche für die Einführung sauerstoffhaltiger
funktioneller Gruppen in den Kern, erfordern im allgemeinen mehrere Umsetzungen,
oft auch die Verwendung ätzender oder teurer Chemikalien. Mit vielen dieser Verfahren
werden nur mäßige oder geringe Gesamtausbeuten erzielt.
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Die Einführung von Sauerstoff in den Steroidkern kann auch nach einem
besonderen biologischen Verfahren durchgeführt werden, nämlich durch Perfusion bestimmter
tierischer Organe oder Gewebepräparate mit Lösungen des gewünschten Steroids. Dieses
Verfahren bereitet viele Schwierigkeiten in bezug auf die Beschaffung großer Mengen
der dazu erforderlichen Drüsen, der ordnungsgemäßen Durchführung des Verfahrens
und der Aufrechterhaltung steriler Bedingungen. Ferner ist es bereits bekannt, Steroide
auf biochemischem Wege durch Bebrütung mit verschiedenen Mikroorganismen zu oxydieren.
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Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß durch Bebrütung eines
in 4(5)-Stellung ungesättigten 3-Ketosteroids mit einer Art der Gattung Mycobacterium
oder deren oxydierend wirkenden Enzymen ebenfalls oxydierte Steroidverbindungen
erhalten werden. Dabei werden einige Steroidmoleküle oxydiert, d. h., es werden
eine oder mehrere sauerstoffhaltige funktionelle Gruppen, z. B. Hydroxyl- oder Ketogruppen,
in den Steroidkern eingeführt, während andere Steroidmoleküle dehydriert, d. h.
2 Wasserstoffatome unter Einführung einer Doppelbindung in insbesondere 1(2)-Stellung
aus ihrem Kern entfernt werden. Manchmal können in einem Molekül beide Oxydationsarten
stattfinden. Im allgemeinen erfolgt dies jedoch nicht in starkem Maße. Es finden
also gleichzeitig zwei Oxydationsarten statt, eine Einführung von Sauerstoff und
eine Dehydrierung, so daß nicht nur sauerstoffhaltige, sondern auch dehydrierte
Verbindungen erhalten werden. Das Mengenverhältnis, in welchem die verschiedenartig
oxydierten Verbindungen entstehen, hängt vom verwendeten Ausgangssteroid und vom
verwendeten Mikroorganismus ab; in allen Fällen erhält man jedoch beide Arten. In
manchen Fällen, insbesondere bei Verwendung von Progesteron als Ausgangsmaterial,
werden auch kleinere Mengen eines reduzierten Produktes, das in 4(5)-Stellung gesättigt
ist, isoliert.
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Ziel der Erfindung ist ein wirtschaftliches und auch in großem Maßstabe
leicht durchführbares Verfahren zur Herstellung von im Kern oxydierten sowie von
im Kern dehydrierten Steroiden aus den entsprechenden in 4(5)-Stellung ungesättigten
3-Ketosteroiden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann ausgeführt werden, indem man
das ausgewählte Steroid in wäßriger Lösung oder Suspension mit einer aktiv wachsenden
Mycobacterium-Kultur, mit Mycobacterium-Zellen, die von der wachsenden Kultur abgetrennt
und in einem geeigneten Medium suspendiert wurden, oder mit Extrakten der oxydierend
wirkenden Enzyme aus der Mycobacterium-Kultur in Berührung bringt.
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Für die erfindungsgemäße Umsetzung können zahlreiche in 4(5)-Stellung
ungesättigte 3-Ketosteroide als Ausgangsmaterialien verwendet werden. Zu diesen
gehören z. B. Testosteron, Stigmasteron, 17-Oxy-desoxycorticosteron, Desoxycorticosteron
und andere Verbindungen dieser Art, die alle die folgende Grundstruktur aufweisen
In der obenstehenden Strukturformel kann R die verschiedenartigsten Gruppen bedeuten,
ohne daß hierdurch
die Reaktion in irgendeiner Weise beeinflußt
wird. Sc kann R z. B. Wasserstoff; eine Hydroxyl-,.Keto-, Alkyl=, Acyl-, Alkylen-,
-C 0-C H2-0 H-, -C 0-C H2 O-Acylgruppe, -C 0-C H2 O-Alkylgruppe usw. darstellen,
wobei die Alkyl-, Acyl- und Alkylengruppen nicht mehr als 10 Kohlenstoffatome enthalten.
Falls R ein -einwertiger Rest ist, kann RI Wasserstoff, eine Hydroxyl- oder O-Acylgruppe
bedeuten. Eine derartige. Struktur besitzt Reichsteins Verbindung S oder das 17-Oxy-desoxycorticosteron,
in welcher R = -C 0 C H2 0 H und R1 = -0 H bedeutet. Ist R jedoch zweiwertig, so
fällt R1 selbstverständlich weg. R und R1 können sowohl a- wie auch ß-ständig sein.
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Unterwirft man ein in 4(5)-Stellung ungesättigtes 3-Ketosteroid dem
erfindungsgemäßen Verfahren, so wird in den Kern einiger Steroidmoleküle Sauerstoff
eingeführt. Selbstverständlich ist die Einführung von Sauerstoff in verschiedene
Teile des Steroidkerns erwünscht. Die verwendeten Ausgangsmaterialien unterscheiden
sich hinsichtlich der Sauerstoffeinführung, die leicht oder weniger leicht erfolgen
kann. Es wurde jedoch gefunden, daß in allen untersuchten Fällen, bei denen man
als Ausgangsmaterial ein Steroid der obenstehenden Struktur verwendete, eine Verbindung
erhalten wurde, die im Kern zusätzlich Sauerstoff enthielt. Der Sauerstoff tritt
entweder in Form einer Hydroxyl- oder einer Ketogruppe ein. Gewöhnlich erfolgt zuerst
die Einführung einer Hydroxylgruppe. Wird die Reaktion unter geeigneten Bedingungen
fortgesetzt, so wird die Hydroxylgruppe teilweise oder vollkommen in eine Ketogruppe
umgewandelt. Es ist möglich, daß in den Kern eines gegebenen Steroids mehr als ein
Sauerstoffatom eingeführt wird. Im allgemeinen wird jedoch nur ein Sauerstoffatom
eingeführt. Außer dieser soeben beschriebenen Sauerstoffeinführung findet während
des Verfahrens in einigen Steroidmolekülen auch eine Dehydrierung statt. Diese Dehydrierung
erfolgt hauptsächlich in 1(2)-Stellung.
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Die oxydierten Steroide können durch sorgfältigen papierchromatographischen
Vergleich der erhaltenen Steroide mit bekannten Steroiden bestimmt werden, die außer
in 3-Stellung in verschiedenen Stellungen des Kerns Sauerstoff enthalten; die dehydrierten
Steroide werden mit bekannten Steroiden verglichen, die außer in 4(5)-Stellung in
anderen Stellungen des Kerns ungesättigt sind. Dieses Verfahren wurde bei einer
großen Anzahl von Verbindungen ausprobiert und gewährleistet zuverlässige Ergebnisse
bei der Bestimmung des Grades der Steroidoxydation. Über diese Methode wurde bereits
in der chemischen Literatur berichtet (Bericht des XII. Internationalen Kongresses
für Reine und Angewandte Chemie). Außerdem wurden zum Nachweis der Oxydation des
Steroidkerns noch weitere Standardverfahren verwendet.
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Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können verschiedene
Arten der Gattung Mycobacterium verwendet werden. Zu diesen gehören bekannte Arten,
wie Mycobacterium Art 607, M. berolinense, M. lacticola, M. thamnopheos, M. phlei,
M. tanae, M. butyricüm, M. friedmanni, M. tuberculosis und insbesondere Stämme der
Art M. smegmatis ATCC 101. Die zahlreichen Mycobacterium Arten unterscheiden sich
beträchtlich hinsichtlich der Geschwindigkeit und Leichtigkeit, mit der die Oxydation
durch die Organismen oder die während ihres Wachstums gebildeten Produkte bewirkt
wird. Es wurde gefunden, daß bestimmte Stämme von M. smegmatis zur Durchführung
der erfindungsgemäßen Reaktion besonders geeignet sind. Die verschiedenen Mycobacterien
unterscheiden sich etwas hinsichtlich der erforderlichen Nährmedien. Durch wenige
Versuche ist es jedoch m3glich, die Zusammensetzung geeigneter Medien sowie die
optimalen Verfahrensbedingungen, z. B. pH-Wert, Belüftungs-, Rührgeschwindigkeit
usw., zu ermitteln.
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Die erfindungsgemäß hergestellten Produkte können durch Extraktion
mit verschiedenen, mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln aus den
wäßrigen Lösungen isoliert werden. Hierfür eignen sich besonders niedermolekulare,
halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform. Nach der Extraktion kann man das
Lösungsmittel durch Destillation entfernen. Anschließend wird das feste Produkt
isoliert. Dieses kann durch Umkristallisieren aus organischen Lösungsmitteln oder
durch Chromatographieren z. B. über Tonerdesäulen oder andere geeignete feste Adsorptionsmittel
weitergereinigt werden. Die Verwendung einer Kieselerdegel-Äthanolsäule und einer
Mischung von 98: 2 Volumprozent Methylenchlorid und Äthanol (95 %) als Entwickler
erwies sich als besonders vorteilhaft. Verfahren zur Abtrennung von Produkten dieser
Art wurden in der Literatur bereits beschrieben. Für manche Verwendungszwecke brauchen
die Produkte nicht abgetrennt zu werden, sondern lassen sich in Form der rohen Mischung
verwenden. In einigen Fällen erwies es sich als vorteilhaft, die rohen Produkte
zu acylieren und mit den Estern zu arbeiten, da diese etwas beständiger sind.
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Als Ausgangsmaterialien für die erfindungsgemäße Um-Setzung kann eine
große Anzahl von in 4(5)-Stellung ungesättigten 3-Ketosteroiden verwendet werden,
z. B. die bekannten Verbindungen: Testosteron, Stigmasteron, Progesteron und Reichsteins
Verbindung S. Die oxydierten Produkte können als Zwischenprodukte für die Synthese
anderer nützlicher Verbindungen verwendet werden. So eignen sich z. B. die dehydrierten
Produkte mit einer Doppelbindung in 1(2)-Stellung einer 3-ständigen Ketogruppe und
der im Ausgangsmaterial schon vorhandenen 4(5)-ständigen Doppelbindung besonders
für die sogenannte @; Inhoffen«-Aromatisierung. Hierbei entstehen mehrere Östrondenvate.
Beim Dehydrierungsprodukt von Reichsteins Verbindung S kann die Seitenkette leicht
auf übliche Weise unter Bildung einer 17-ständigen Ketogruppe abgespalten werden,
z. B. durch Oxydation mit Chromsäure. Durch Aromatisierung des hierbei erhaltenen
Produktes nach Inhoffen, d. h. durch Erhitzen auf hohe Temperatur in einem Kohlenwasserstoff,wird
die sehr wertvolleVerbindung Östron hergestellt. Durch Einführung sauerstoffhaltiger
funktioneller Gruppen in den Kern der erfindungsgemäß verwendeten Steroide erhalten
diese neue chemische Angriffspunkte und ihre Fähigkeit, weitere chemische Reaktionen
einzugehen, wird stark erhöht. Außerdem werden durch die Einführung von Hydroxylgruppen
sehr erwünschte Änderungen in der Löslichkeit bewirkt.
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Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung des erfindungsgemäßen
Verfahrens. Beispiel I Zu 50 ccm einer Nährlösung der folgenden Zusammensetzung
| Festes, normales Nährmedium ..... 8 g/1 |
| Glycerin ......................... 20 ccm/1 |
| Tween 80 ........................ 0,2 ccm/1 |
| Asparagin ....................... 5 g/1 |
wurde eine auf festem Agarmedium gezüchtete Kultur von Mycobacterium smegmatis (Pfizers
Kulturensamm-Jung Nr. 2) gegeben. Das Medium wurde vor der Impfung sterilisiert.
Das geimpfte Gemisch wurde in einen 250 ccm
fassenden Erlenrneyerkolben
gefüllt und der Kolben 3Tage bei etwa 27° geschüttelt. Der Inhalt einer Flasche
wurde dann zur Impfung von 2 1 des gleichen sterilisierten Mediums verwendet, das
sich in einem 41 fassenden Gefäß zur Durchführung der Gärung unter submersen Bedingungen
befand. Das Medium wurde geimpft und die Mischung unter sterilen Bedingungen gerührt
und belüftet. Das Rührwerk lief mit einer Geschwindigkeit von 1750 Umdrehungen/Minute.
Die Belüftung erfolgte 48 Stunden mit einer Geschwindigkeit von einem Volumen steriler
Luft/Volumen Medium/Minute. Die im Medium entstehenden Zellen wurden abzentrifugiert
und mit Wasser gewaschen.
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20 ccm eines Enzym-Reaktionsgemisches mit einer 0,01 molaren Konzentration
an Natriumfumarat sowie Magnesiumsulfat, einer 0,03-molaren Konzentration an Natriumcitrat
und einem Gehalt von 0,125"/, Adenosintriphosphat wurden in einen 125 ccm fassenden
Erlenmeyerkolben gefüllt. Nach Einstellung des pH-Wertes mit Zitronensäure auf 6,0
wurden dem Reaktionsgemisch 25 mg des Acetats von Reichsteins Verbindung S zugesetzt.
Das Reaktionsgemisch wurde mit den Zellen von 100 ccm der unter submersen Bedingungen
durchgeführten Gärung geimpft und bei 37° stehengelassen. In bestimmten Zeitabständen
wurden Proben entnommen und die Steroide mit Chloroform extrahiert. Nach Abtrennung
der organischen Phase wurde das Lösungsmittel entfernt und das Produkt in Äthanol
gelöst. Von dieser Äthanollösung wurden Proben unter Anwendung des oben beschriebenen
chromatographischen Verfahrens auf Papierbogen aufgetragen. Es wurde gefunden, daß
nach 6 Stunden eine gewisse Oxydation im Kern des Acetats von Reichsteins Verbindung
S stattgefunden hatte. Die Reaktion schritt ziemlich rasch vorwärts, und nach 24
Stunden war eine merkliche Umwandlung eingetreten. Nach 48 Stunden hatte eine maximale
Oxydation des Steroidkerns stattgefunden. Die papierchromatische Untersuchung unter
Verwendung des sogenannten Lösungsmittelsystems V (mit Wasser gesättigtes Benzol)
führte zu den folgenden Ergebnissen. Die in der Tabelle angegebenen Zahlen sind
RF-Werte. In den Klammern sind die Steroide angegeben, mit welchen die Flecken auf
dem Papierchromatogramm übereinstimmen. Diese Versuche wurden 48 Stunden nach der
Impfung des Mediums mit Zellen durchgeführt.
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RF-Werte bei Verwendung von System V
1,00 (Acetat von Reichsteins
Verbindung S) 0,58 (Reichsteins Verbindung S) ; 0,30 (d'-Dehydro-Derivat von Reichsteins
Verbindung S und 14a-Oxy-Derivat von Reichsteins Verbindung S) 0,20 (noch nicht
ermittelt) Beispiel II Einem 41 fassenden Pyrexglaskessel, der für die Durchführung
der Gärung unter Belüftung und submersen Bedingungen eingerichtet war, wurden 21
des folgenden Mediums (welches als »Turfitts Medium« bekannt ist) zugesetzt
| Ammoniumnitrat ................ 0,1 0/0 |
| Saures Dikaliumphosphat ........ 0,025 0/0 |
| Magnesiumsulfat-Heptahydrat ..... 0,25 0/0 |
| Natriumchlorid ................. 0,0005 0/0 |
| Eisensulfat-Heptahydrat .......... 0,000010/0 |
| Calciumcarbonat ................. 0,5 0/ |
| 0 |
Das wäßrige Medium wurde sterilisiert und anschließend mit 0,25g des Acetats von
Reichsteins Verbindung S behandelt. Danach wurde die Mischung mit 100 ccm einer
in einer Schüttelflasche auf Nährlösung gezogenen Kultur von Mycobacterium smegmatis
(Pfizers Kulturensammlung Nr. 2) geimpft. Die Mischung wurde gerührt und mit steriler
Luft belüftet. Danach wurde die gesamte Mischung mit 21 Chloroform extrahiert. Proben
dieses Produktes wurden papierchromatographisch mit drei verschiedenen Systemen
untersucht. Die folgende Tabelle zeigt die Rf-Werte der verschiedenen Systeme. Die
Verbindungen, denen die Lage der einzelnen Flecken entspricht, sind am Rand der
Tabelle aufgeführt.
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Rf-Werte
| System |
| III*) I IV**) 1 V***) |
| 0,07 0,5 (Reichsteins Verbindung S) |
| 0,94 (Acetat von Reichsteins Verbin- |
| dung S) |
| 0,72 (Reichsteins Verbindung S) |
| 0,45 (dl-Dehydro-DerivatvonReichsteins |
| Verbindung S und 14a-Oxy-Deri- |
| vat von Reichsteins VerbindungS) |
| 0,22 (noch nicht identifiziert) |
| *) Hexan-Ather (16:1), |
| **) Äther, |
| ***) mit Wasser gesättigtes Benzol. |
Bei der Abtrennung von insbesondere dem d'-Dehydro-Derivat und dem 14a-Oxy-Derivat
von Reichsteins Verbindung S, die bei Verwendung des Systems V beide den Rf-Wert
0,45 aufwiesen, werden mit einer anderen Chromatographierungsart bessere Ergebnisse
erzielt, und zwar chromatographiert man in diesen Fällen besser nach unten und nicht,
wie zuvor beschrieben, nach oben.
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Das Papier wurde mit einem Gemisch aus 80 Volumteilen Methanol und
20 Volumteilen Wasser imprägniert. Die Atmosphäre im Glasgefäß wurde mit dem Dampf
von Toluol gesättigt, das mit Wasser gesättigt worden war. Die Entwicklung erfolgte
mit einer Mischung aus 100 Volumteilen Toluol und 20 Volumteilen Äthylalkohol.
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Unter Anwendung dieses Systems wurden folgende Ergebnisse erhalten:
RS-Werte 1,00 (Reichsteins Verbindung S) 0,68 (d'-Dehydro-Derivat von Reichsteins
Verbindung S) 0,45 (14a-Oxy-Derivat von Reichsteins VerbindungS) 0,25 (noch nicht
identifiziert).
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Diese RS-Werte wurden dadurch erhalten, daß man der von Reichsteins
Verbindung S zurückgelegten Entfernung den Wert 1,00 und den von den anderen Verbindungen
zurückgelegten Entfernungen jeweils einen Wert gab, der dem Verhältnis der von diesen
Verbindungen zurückgelegten Entfernung zu der von der Verbindung S zurückgelegten
Entfernung entsprach. Sowohl das Lösungsmittel als auch das Acetat von Reichsteins
Verbindung S drangen über die gesamte Länge des Papierbogens vor und über diesen
hinaus.
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Das Gemisch wurde schließlich durch mehrfache Ent-,xrir@rl"na
in TZiacalnrrlarrnl-ilth@nnl_Cß"lon rrci-rcnnl AT-h
beendeter
Gärung wurde die Gärmischung mit Chloroform extrahiert und auf ein Volumen von etwa
20 ccm eingedampft. Dieser konzentrierte Extrakt wurde sodann auf eine Kieselerdegel-Äthanol-Säule
aufgetragen und mit einem Methylenchlorid-Alkohol-Gemisch entwickelt, bis der größte
Teil des dl-Dehydro-Derivats von Reichsteins Verbindung S entfernt war. Danach wurde
die Säule zur Entfernung aller übrigen Steroide mit Methanol gewaschen. Dieses Verfahren
wurde mehrere Male wiederholt, wobei man jedesmal mit dem Extrakt aus der oben beschriebenen
Gärung begann. Danach wurden diese Methanoleluate vereinigt, zur Trockne eingedampft
und in 20 ccm Chloroform gelöst. Diese Chloroformlösung wurde in eine Kieselerdegel-Äthanol-Säule
gebracht und mit dem Methylenchlorid-Alkohol-Gemischausgewaschen.
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Etwa alle 2 Stunden wurden Fraktionen mit einem Volumen von 50 ccm
gesammelt. Sie enthielten folgende Steroide:
| Fraktion 1 bis 8 (nichts) |
| " 9 " 17 (Reichsteins Verbindung S) |
| " 18 " 19 (dl-Dehydro-Derivat von Reich- |
| steins Verbindung S) |
| " 20 " 21 (dl-Dehydro-Derivat von Reich- |
| steins Verbindung S und 14a-Oxy- |
| Derivat von Reichsteins Verbin- |
| dung S) |
| " 22 " 33 (14a-Oxy-Derivat von Reichsteins |
| Verbindung S). |
Die Fraktionen wurden zur Trockne eingedampft und die Kristalle gewonnen. Das d
l-Dehydro-Derivat von Reichsteins Verbindung S wurde zweimal aus Äthylacetat und
das 14a-Oxy-Derivat von Reichsteins Verbindung S zweimal aus Äthylalkohol umkristallisiert.
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Das d l-Dehydro-Derivat von Reichsteins VerbindungS, das auch als
1, 4-Pregnadien-17a, 21-diol-3, 20-dion bezeichnet werden kann, hat die folgenden
physikalischen Konstanten: Schmelzpunkt 235 bis 236°; optische Drehung [a]D-,on
= --71,9'; U.V.-Absorptionsmaximum bei 245 m#t.
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Das 14a-Oxy-Derivat von Reichsteins Verbindung S, das auch als 4-Pregnen-14a,
17a, 21-triol-3, 20-dion bezeichnet werden kann, besitzt die folgenden physikalischen
Konstanten: Schmelzpunkt 226 bis 228°; optische Drehung [a] D1-ton =--129,6°;
Analyse: C = 69,64; H = 8,30; berechnet für C21H3o05: C = 69,57; H = 8,35. Beispiel
III Nach dem im vorhergehenden Beispiel beschriebenen Verfahren wurden 0,25g Desoxycorticosteronacetat
behandelt. Nach viertägiger Bebrütung bei 27° unter sonst gleichen Bedingungen wurde
das Produkt gewonnen und papierchromatographisch analysiert. In der nachstehenden
Tabelle sind die Ergebnisse aufgeführt: Rf-Werte System II*) In
1 IV 1 V
0,39 0;87 1,0 (Desoxycorticosteronacetat) 0,27 0,67 0,97 (Desoxycorticosteron)
0,32 0,72 (d 1-Dehydro-desoxycorticosteron) 0,17 0,44 (im Kern durch - O H substituiertes
Derivat des Desoxy-corticosterons) *) Hexan-Ather (19:1). Wie in allen Fällen wurden
auch in diesem Beispiel im Kern oxydierte Steroide, und zwar ein Steroid, in das
Sauerstoff eingeführt wurde, und ein dehydriertes Steroid erhalten. Die genaue Stellung
der Hydroxylgruppe im erhaltenen Monooxy-Kernsubstitutionsprodukt ist nicht bekannt,
man weiß jedoch, daß sie eine andere Stellung als die Kernhydroxylgruppe des Corticosterons
einnimmt: Beispiel IV 0,25g Progesteron wurden nach dem Verfahren des Beispiels
II behandelt. Man erhielt dl-Dehydroprogesteron und ein monohydroxyliertes Progesteron.
Die physikalischen Konstanten des erhaltenen d 1-Dehydroprogesterons stimmen mit
den in der Literatur angegebenen überein. Die genaue Stellung der eingeführten Hydroxylgruppe
im monohydroxylierten Produkt ist noch nicht bekannt.
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Bei diesem Versuch wurde außer den obengenannten Oxydationsprodukten
auch eine kleine Menge eines Reduktionsproduktes mit gesättigter 4 (5)-Stellung
erhalten. Die für dieses Produkt, Allopregnan-3ß-ol-20-on; gefundenen physikalischen
Konstanten stimmen mit den in der Literatur angegebenen überein.