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Verfahren zur Herstellung von vorzugsweise in 11 -Stellung oxydierten
Steroiden Die Erfindung bezieht sich auf ein neuartiges Verfahren zur Einführung
von Sauerstoff in ein Steroidmolekül.
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Es ist bereits bekannt, Sauerstoff in die i i-Stellung eines Steroidmoleküls
einzuführen. Diese Oxydation kann jedoch nur durch hochtechnische organische Synthesen
ausgeführt werden, die eine beträchtliche Zahl von Stufen umfassen. Die Gesamtausbeute
an in i i-Stehlung oxydiertem Steroid ist deshalb weit geringer als der gewünschte
Wert, so daß die Produktionskosten außerordentlich h och und sogar untragbar sind.
Diese hohen Produktionskosten und die ungenügende Versorgung mit in i i-Stellung
oxydierten Steroiden, beispielsweise Corticosteron, i i-Dehydrocorticosteron, i
i-Dehydro-i 7-oxycorticosteron (Verbindung E, Cortison) und i7-Oxycorticosteron
(Verbindung F) als Arzneimittel haben ihre allgemeine Verbreitung und Zugänglichkeit
verhindert. Es war deshalb von großer Wichtigkeit, ein befriedigenderes Verfahren
zur Herstellung oxydierter Steroidverbindungen zu finden, insbesondere von in i
i-SteIlung oxydierten Steroidverb'n.dungen, die in der i i-Stellung entweder die
Keto-(Oxo-) Gruppe,
in welcher Form das i i-Sauerstoffatom in zahlreichen
der gewünschten Arzneimittel vorkommt, oder die Oxygruppe (-O H), @d;ie ebenfalls
in vielen wertvollen Steroidverhindungen vorhanden und außerdem durch bekannte Oxydationsmethoden
leicht in die Ketogruppe überführbar ist, erhalten.
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Die Erfindung löst die gestellte Aufgabe dadurch, daß ein Steroid
mit Bakterienkulturen der Gattung Streptomyces (Actinomyces) oder daraus erhältlichen,
oxydierend wirkenden: Bakterienenzymen oxydiert und in bekannter Weise aus dem Reaktionsgemisch
abgetrennt wird. Als Ausgangsmaterial wird vorzugsweise ein i i-Desoxysteroid oder
ein Steroid, welches mindestens eine Methylengruppe oder in i i-Stellung eine Methylengruppe
aufweist, z. B. i i-Desoxy-i 7-oxycorticosteron (Verbindung S) oder i i-Deso.xycorticosteron
verwendet. Als Bakterienstamm werden Streptomyces H-39, StreptomyCes fr:adiae oder
Streptomyces endus, die zweckmäßig .unter aeröben Bedingungen und im Tauchverfahren
hergestellt wurden, verwendet. Das. Reaktionsgemisch wird durchlüftet und- bewegt;
es kann ein Kohlehydrat enthalten.
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Die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens brauchbaren
Steroide,sind nicht auf eine besondere Art und Anzahl von S.ubstituenten beschränkt.
Sie müssen bloß eine nichtoxydierte i i-Stellung aufweisen, also i i-Desoxysteroide
sein. Diese Verbindungen enthaltenden folgenden Kern
| der kernständige Substituenten, beispielsweise in |
| den Stellungen i, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, |
| 16 und 17, insbesondere 10, 13-Dimethylgruppen |
| 3-, 7- oder i2-Keto-, -Oxy- oder Acyloxygruppen, |
| 17-Seitenketten, von denen die Seitenketten des |
| Progesterons und des Corticosterons (Ketol) der be- |
| sonderen Erwähnung wert sind, eine 17-Ketogruppc, |
| eine 17-0x7 gruppe, oder Doppelbindungen in den |
| Stellungen 4., 5, 6, 7, 8, 9 (11), 11 (i2), 16 (17) und |
| in anderen Stellungen des Kernes enthalten kann, |
| oder auch Halogen, additive Gruppen von dienophi- |
| len Verbindungen, wie Maleinsäure, Maleinsäure- |
| anhydrid oder Maleinsäureester, beispielsweise in |
| 5, 7-Stellung, und andere S.ubstituenten. |
| Als Beispiele von Steroiden, die nach dem erfin- |
| dungsgemäßen Verfahren oxydiert werden können, |
| sind zu nennen Progesteron, 9, 11- oder Il, 12-De- |
| hydroprogesteron, 7, 9 (11) -B,is@dehydroprogesteron, |
| 17-Oxyprogesteron, Pregnenolon, Acyloxypregne- |
| nolone, z.B. Pregnenolonacetat, i i-Desoxycorticoste- |
| ron, A9-11- oder d 1l, 1z-Desoxycorticosteron, i i-Des- |
| oxy-17-oxycorticosteron und Acyloxyderivate, z. B. |
| das Acetoxyderiv at, 2 i-Oxypregnenolön und |
dessen 2i Acylderivate, wie z. B. das Acetylderivat, und dessen Ester 17, 2i-Dioxypregrienolon
und dessen i2, 2i-Diacyloxyderivate, z. B. das Diacetoxyderivat, Androstendion,
Androstan-17-o1, 9, 11-oder i i, i2-Dehydroandrostendion, 3-Oxy-4 9# 11_ oder 411,1z-pregnen-2o-one,
3, 2i-Dioxy-49,11- oder d U, 1=-pregnen-2o-one, 3, 17, 2i-Trioxy-4 9'# 11- oder
4ll.12_pregnen 2o-one" 5-Androste,n-3-o1-17-on und 3-Acyles-ber, z. B. Acetylester;
ErgosteTin, Stigmasterin, Stigmastanol und deren 3-Acylester, z. B. die Acetylester
Ergostenon, Stigmastenon, Stigmasta.non, Cholestenon, Cholsäure, Desoxycholsäure,
Lithocholsäure, Cholansäure, Norcholansäure, Bisnorcholansäure, Cholensäure, Norcholensäure,
B'isnorcholensäure und 3-0x7-, 3-Keto-, 3, 7-Dioxy-, 3, 7-Dilzeto, 3, 7, i2-Trioxy-,
3, 7, i2-Trtilceto-, 9, 11- oder i i, 12-Ungesättigte Ester, Thiolester und weitere
Derivate der vorgenannten Säuren.
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Die biochemische Oxydation wird unter Verwendung eines oxydierenden
Bakteriums, das zur Gattung der Streptomyces gehört, oder von daraus erhältlichen
oxydierenden Enzymen ausgeführt. Als Beispiele der Bakterien, die sich für die Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen, seien die folgenden Arten ,angeführt: Streptomyces
frad'iae, endus, H-39, K-93, BC-17, W-4, albus, coelicolor, verne, californicus,
flaveolus, bobi:liae, roseochromogenus, griseolus, erythreus, cellulosae, parvus,
malenconi, diastaticus, fimicarius, flavovirens, olivochromogenus"diastatochro@mogenes,
flavochromogenes, antib,ioticus, viridochromogenes, purpeochromogenue, phaechromogenus,
aureus, erythro^ chromogenes, lavendulae, retiauli, rubrireticu,li, flavus, ruber,
eitreus, fulvissimus, aureofaciens, rimosus, gougeroti, violaceoniger, griseus,
griseoflavus, albidoflavu:s, pooleneis, olivaceus, lieskei, miicroflavus, cacaoi,
novaecaesareae, exfoliatus, gelaticus, rutgersens,is, lipmanii, halstedii, ;hygroscopicus,
alboflavus, albosporeous, flocculus, melanosporeus, melanocyclus, acidoph-ilus.
rubescens, thermophilus, thermofuscus, scabies, ipomoea, fordii. africanus, gallicus,
pelletieri, listeri, upcottii, hortonensis, gibsonii, beddardii, kimberi, somaliensis,
panjae, willmorei. Obwohl die Streptomycesarten sich allgemein als oxydierende Mikroorganismen
für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen, werden aus Gründen
der Wirtschaftlichkeit und zur Erzielung optimaler Ausbeuten des gewünschten, in
i i-Stell:ung oxydierten Steroids vorzugsweise die Arten fr,adiae und H-39 verwendet.
In gewissen Fällen und unter besonderen Bedingungen können jedoch mit Vorteil auch
andere Arten verwendet werden.
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Zur Gewinnung der Mikroorganismen aus natürlichen -Quallen, werden
.die üblichen Arbeitsmethoden angewendet. Für die vorliegende Erfindung wird die
Organismenkultur von ihrer natürlichen oder künstlichen Bezugsquelle auf bestimmte
bakteriologische Nährböden, die die Entwicklung der Mikroorganismen fördern, übertragen.
Diese Nährböden enthalten mindestens eine kohlenhydrathalti-ge und eine Stickstoff
liefernde Substanz, 4n den meisten Fällen ein N N eutüalisiermittel, z. B. Calciumcarbonat,
und Substanzen,
die das Wachstum fördern, z. B. Rückstände der Branntweinbrennerei,
Maiseinwedchflüssigkeit und Bierhefe oder anorganische Salze. Das PH des 1\Tährbodens
im Zeitpunkt des Anim.pfens wird gewöhnlich auf etwa 6,5 bis 7,5 eingestellt. Nachdem
die Bakterien 24 bis 28 Stunden auf dem Nährboden gewaschen sind, kann man eine
beträchtliche Erhöhung des PH, gewöhnlich auf etwa 7 bis 8, feststellen. Man kann
jedoch auch in anderen pH-Bereichen, beispielsweise bei einem pH von etwa 5 .bis
7, arbeiten. .Das zu oxydierende Stero@id wird vorzugsweise ungefähr in diesem Stadium-des
Bakterienwachstums zugesetzt. Die Bakteriengärungsflüssigkeit, diie zur fermentativen
Oxydation der Steroide verwendet werden soll, kann auch in diesem Stadium von der
Kultur abgetrennt werden.
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Dias Impfen der Bakteriennährflüssigkeit mit dem gewählten Streptomvces
kann nach einer beliebigen bekannten mikrobiologischen Methode erfolgen, z. B. in
sehr zweckmäßiger Weise mit vegetativen Mycelien der Organismen. Das Impfen mit
Sporen ist gleicherweise wirksam. Das Wachstum der Mikroorganismen wird mit Leichtigkeit
gefördert, indem die Impftemperaturen ungefähr bei Raumtemperatur, beispielsweise
zwischen 20 und 30° gehalten werden. Für das Wachstum der Mikroorganismen haben
sich jedoch auch Temperaturen von etwa 15 bis .Io° als befriedigend erwiesen.
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Die Zeit während des -Bakterienwachstums, bevor das zu oxydierende
Steroid zugefügt wird, ist offenbar nicht kritisch. So kann das in der ii-Stellung
zu oxydierende Steroid beispielsweise entweder im Zeitpunkt des Animpfens des Mediums
mit der gewählten Streptomycesart oder beispielsweise 24. bis 72 Stunden später
zugesetzt werden. Es hat sich gezeigt, daß die zu oxydierende Steroidverbindung
die Bakterienkulturflüssigkeit auch noch nach 4 Tagen nach dem Impfen mit der gewählten
Streptomycesart zugesetzt werden kann, ohne daß sich die Wirkung ändert. DieZugabeeines
i i-Desoxysteroids zur Gärflüssigkeit erfolgt vorzugsweise nach einer Bakterienwachstumsdauer
von etwa q.o bis 48 Stunden, da in diesem Stadium des Bakterienwachstums die Entwicklung
oxydierender Enzyme ihren Höhepunkt erreicht hat. Soll die Oxydation unter Verwendung
der die oxydierenden Enzyme enthaltenden Gärungsflüssigkeit allein durchgeführt
werden, so wird diese gewöhnlich und vorzugsweise mindestens nach diesem Wachstumsstadium
abgetrennt.
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Die Art und Weise, wie das zu oxydierende Ste@roid den oxydierenden
Bakterien, der Bakterienflüssigkeit oder der Gärungsflüssigkeit zugesetzt wird,
ist offenbar nicht kritisch. Die Zugabe kann in geeigneter Weise so angeführt werden,
daß eine innige Berührung des Steroids mit den Bakterien und bzw. oder den Bakterienenzymen
gefördert wird, beispielsweise durch Züchten der Bakterien in Gegenwart feinverteilter
Steroidkristalle, Dispergie.ren des Steroids in der Bakterienflüssigkeit. Zu diesem
Zweck können auch oberflächenaktive Stoffe, Dispergierungsmittel oder Suspendierungsmittel,
z. B. Sorbitanester mit ernulgierender Wirkung, bekannt unter den Handelsnamen Tweene,
Aerosele, Nacconole, verwendet werden. Das Steroid wird der Bakterienflüssigkeit
jedoch vorzugsweise in Form einer Lösung in einem mit Wasser mischbaren organischen
Lösungsmittel, .beispielsweise in Aceton, Alkoholen oder selbst Äther, der mit Wasser
nur wenig mischbar ist, zugesetzt, worauf die Flüssigkeit und das Steroid gründlich
durchgemischt werden, so daß eine Suspension oder Dispersion von feinen Steroidteilchen
entsteht und eine maximale Berührung des zu oxydierenden Steroids mit den oxydierenden
Bakterien oder .den Bakterienenzymen zustande kommt. Man kann entweder eine Methode
mit Tauchkultur oder eine Methode mit Oberflächenkultur anwenden. Bevorzugt werden
jedoch Tauchkulturen. Man kann auch die Gärungsflüssigkeit der Bakterien abtrennen,
mit dem Steroid oder dessen Lösung mischen und das Gemisch aeroben Bedingungen unterwerfen,
um die Oxydation des Steroids herbeizuführen.
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Die während der bakteriellen Oxydation des Steroids verwendete Temperatur
braucht nicht verschieden zu sein von derjenigen bei Abwesenheit des Steroids, d.
h. daß die Temperatur innerhalb solcher Bereiche gehalten werden muß, inner'hal'b
welcher das Leben bzw. das aktive Wachstum der B#a'kterien erhalten .bleibt. Die
Inkubationstemperatur während der bakteriellen Oxydation des Steroids kann somit
beispielsweise zwischen etwa 15 und q.0° gehkalten werden, wobei zur Erzielung einer
optimalen Wirkung der Bakterien oder Bakterienenzyme Raumtemperatur bevorzugt wird.
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Die Bedingungen, unter denen die Bakterien gezüchtet werden, sind
aerob. Der Wachstumsgrad ist von der Durc:hlüftungabhängig. Während an sich jede
Form der aerohen Inkubation befriedigend ist, sorgt man gewöhnlich für eine kräftige
Durchlüftung, beispielsweise durch Rühren und bzw. oder Durchblasen von Luft durch
die Kulturflüssigkeit, um ein maximales Wachstum der Bakterien zu erzielen, wodurch
andererseits die zur Umwandlung des Desoxy steroids in das in i i-Stel)lung oxydierte
Steroid benötigte Zeit verkürzt wird. Diie Geschwindigkeit der Oxydation des Desoxysteroids
hängt somit entweder vom Ausmaß der Durchlüftung oder von dem des Bakterienwachstums
im Zeitpunkt der Zugabe des Steroids ab. Es wurde beobachtet, daß bei Verwendung
entweder der Bakterien oder der Gärungsflüssigkeit allein die Umwandlung rascher
erfolgt, wenn die Durchlüftung stärker ist und ebenso wenn man die Bakterien vor
der Zugabe des zu oxydierenden Steroids 24 bis 72 Stunden wachsen läßt. Daraus kann
geschlossen werden, daß die Oxydationswirkung der Bakterien nach dieser Wachstumsdauer
am größten ist und daß die Durchlüftung entweder die Umwandlung und die Umwandlungsgeschwindigkeiten
durch Steigerung des Wachstums der Bakterien erhöht oder die Oxydation durch Steigerung
der Versorgung mit freiem Sauerstoff bloß erleichtert.
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Der Oxydationsgrad des Desoxysteroids mit oxydierend wirkenden Bakterien
oder den daraus erhältlichen oxydierenden Enzymen kann nicht mit Genauigkeit angegeben
werden, da verschiedene
Faktoren berücksichtigt werden müssen. Zur
Umwandlung .des Desoxy steroids in das in i i=Stellung oxydierte Steroid sind etwa
i bis 72 Stunden notwendig. Es wurde jedoch beobachtet, daß :die Oxydation des Steroids
praktisch unmittelbar nach dem Zusammenbringen mit ,der Gärungsflüssigkeit völlig
ausgewachsener Bakterien oder .deren Enzymen einsetzt. Es wird angenommen, :daß
die Bakterien in 24 bis 72 Stunden völlig ausgewachsen sind; diese Zeit hängt bis
zu einem gewissen Grad von der Durchlüftung ab. Wird das, Steroid der Nährflüssigkeit
im Zeitpunkt, in welchem der Nährboden mit den Bakterien geimpft wird, zugesetzt,
so ist es zur Erzielung hoher Ausbeuten an oxydiertem Steroid angezeigt, längere
Zeiten zu verwenden. Wie bereits erwähnt wurde, beruht dies wahrscheinlich auf der
Tatsache, d,aß die Oxydationswirkung der Bakterien erst nach einer gewissen Dauer
des Bakterienwachstums völlig entwickelt ist. Wird das Steroid im Zeitpunkt des
Impfeis des Nährbodens zugesetzt, so sind gewöhnlich S bis 72 Stunden erforderlich,
wobei die Länge dieser Zeit umgekehrt proportional dem Durchlüftungsgrad ist. Wird
andererseits das Steroid den Bakterien oder den Bakterienenzymen erst dann zugesetzt,
wenn das Wachstum der Bakterien bereits erheblich fortgeschritten ist, beispielsweise
nach etwa 24 Stunden, so setzt die Oxydation .des Desoxysteroids sofort ein, wobei
hohe Ausbeuten in i bis 72 Stunden oder auch schon :in kürzeren Zeiten. erhalten
werden. Auch diese Zeiten sind wieder vom Durchlüftungsgrad abhängig.
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Nach der Beendung der Oxydation wird das in ii-Stellung oxydierte,
Steroid in geeigneter Weise aus der Nährflüssigkeit abgetrennt. Eine besonders zweckmäßige
Methode zur Abtrennung des oxydierten Steroids .besteht darin., das Reaktionsgemisch,
welches insbesondere die Nährflüssigkeit und die Mycelien enthält, wenn das Steroid
der Kultur direkt zugesetzt wird, mit einem organischen Lösungsmittel, z. B. 8oo/oigem
Aceton, einem halogenierten Kohlenwasserstoff, z. B. Methylenchlorid, Äthy lenchlorid
oder Chloroform, Äthern u. dgl., entweder direkt oder nach Ansäuerung auf ein niedriges
pH, beispielsweise von i, mit Mineralsäure zu extrahieren. Die Mycellien werden
erneut mit Lösungsmittel extrahiert und verworfen. Die vereinigten Filtrate werden
im Vakuum destilliert. Aus dem Rückstand wird eine 2o°%ige Acetonlösung hergestellt,
die mit Petroläther öder Hexan extrahiert wird. Der Extrakt wird mit 2oo/oigem Aceton
ausgezogen, worauf die :2o'/&i,-en Aceto:nilösungen vereinigt und mit Äthylendiehlor@i-d
extrahiert werden. Der wäßrige Rückstand wird verworfen, während die Äthylendichloridfraktion
im Vakuum destilliert und der Rückstand in Essigsäureäthylester übergeführt wird.
Die Essigsäureäthylesterlösung -wird hierauf nacheinander mit verdünntem Alkali,
verdünnter Säure und Wasser gewaschen, bis ein pH von etwa 7 erreicht wird. Dieses
neutrale Konzentrat kann chromatographiertwerden. Die die Umwandlun.gsprodukte enthaltenden
Fraktionen können zur Kristallisation des in i i-Stell.ung oxydierten Steroids verwendet
werden. Es können auch andere bekannte Extraktionsverfahren angewendet werden. Das
kristalline Material kann nach bekannten Methoden identifiziert werden, beispielsweise
durch Elementaranalysen, durch den Schmelzpunkt, durch Infrarotspektren, Röntgenstrahlen.beugung,
Ultraviolettspektren und andere Bestimmungsmethoden. Das kristalline Material oder
die Extrakte-des nicht kristallinen Materials, die bei der Oxydation erhalten werden,
können auch mittels des Papierchromatogramms von Z af f a r an i identifiziert bzw.
charakterisiert werden.
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Besonders günstig erfolgt die Abtrennung der nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren hergestellten Oxydation.sprodukte@durch Chromatographie der Extrakte oder
festen Materialien in einer mit Äthylenglykol überschichteten Siliciumdioxydsäule.
Diese Methode besteht darin, daß man den neutralen Extrakt bzw. die festen Stoffe
zuerst in Aceton, Methylenchlorid oder in einem anderen geeigneten Lös@ungsmittel
löst, die Lösung an Filtrierpapierscheiben adsorbieren läßt, das Lösungsmittel durch
Vakuumdestillation entfernt, um die festen Stoffe in trockenem Zustand auf den Scheiben
zu erhalten, die Scheiben auf das obere Ende der Säule legt und das Chromatogramm
mit Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, dlie, sofern eine mit Äthylenglyko@l
überschichtete Siliciu,md@ioxydsä.ule verwendet wird, mit Äthylenglynkol gesättigt
sind, entwickelt. Diese Methode eignet sich besonders gut zur Identifizierung der
durch Oxydation hergestellten Verbindungen, da jede aus der Säule erhaltene Fraktion
nach der Methode von Z a f f a r an i geprüft werden kann. Man kann mittels des
Papierchromatogramms von Z a f f a r an i kleinste Mengen von nur 10 :bis 40 y .prüfen.
Diese analytische Methode beruht zum Teil auf der verschiedenen Polarität der zu
prüfenden Verbindung (vgl. B u rton, Zaffaro-ni un:d Ke-utmann, »A New Analytical
Method for Adrenial Cortical Horrnones«, Science Bd. iio, S.q.q.2 [19.I9], und Zaffaroni,
Burton und Keutmann, Science Bd. iii, S.6 [19500. Es ist zwar seit langem bekannt,
daß verschiedene Verbindungen verschieden polar sind. Die Methode von. Z af f ar
an i ist jedoch gegenwärtig d,ie einzige praktisch durchführbare Methode, mittels
welcher durch Auswertung der Polaritätsunterschiede kleins:te Mengen von Steroidverbindungen
identifiziert werden können. Diese Methode hat sich b"--i der Untersuchung der biologisch
oxydierten Steroide und bei der Identifizierung verschiedener neuer und bisher unbekannter
oxydierter Steroide als äußerst -wertvolles Hilfsmittel erwiesen.
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Diese Methode von Z a f f a r o n i ist eine Abart der bekannten Papierstreifenchromatograph
ie.
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Es wird im wesentlichen wie folgt gearbeitet: Zuerst -vird ein Filterpapier
geeigneter Qualität von 7,6 bis 1o,2 cm Breite und 55,9 cm Länge an einer um etwa
7,6 cm vom einen Ende entfernten Stelle gefaltet. An einer 3,8 cm unter dem Falz
befindlichen Stelle wird über das Papier eine Linie gezogen, um die Stell; zu markieren,
an welcher das
zu prüfende Steroid auf das Papier aufgebracht werden
soll. Das Papier wird hierauf der Länge nach in Streifen von etwa 0,95 cm
Breite geschnitten, .indem an jenem Ende mit Schneiden begonnen wird, das dem Ende,
auf welches das zu prüfende Steroid aufgebracht werden soll, entgegengesetzt ist.
Dadurch werden mehrere Papierbänder erhalten, die alle an einem gemeinsamen Ende
befestigt sind und die an beiden Enden befestigt gelassen werden können. Jedes dieser
Bänder bildet eine gesonderte Spur für jeden Tüpfel der zu prüfenden Verbindung,
wie man aus dem Folgenden leicht ersehen kann. Man kann aber auch das Zerschneiden
des Papiers in getrennte Bahnen unterlassen und einen einzigen Streifen verwenden.
In diesem Fall muß jedoch dafür Sorge getragen werden, daß die verschiedenen zu
prüfenden Verbindungen auf dem einzelnen Papierstreifen nicht zu nahe beieinander,
d. h. nicht näher als etwa 2,5 cm, aufgebracht werden. Hierauf wird ein Lösungsmittelgemnisch
gewählt, das aus einem nicht polaren Lösungsmittel (Benzol) für die bewegliche Phase
und einem polaren Lösungsmittel (Formamid) für die ortsfeste Phase besteht. Ein
anderes Lösun.gsmittelgemisch besteht aus dem nicht polaren Toluol und dem polaren
Propyle,nglykol. Beide Lösungsmittelgemische wurden mit Erfolg verwendet.
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Das Filterpapier wird hierauf mit dem polaren Lösungsmittel (Propylenglykol)
gesättigt. Das überschüssige Lösungsmittel wird mittels zusätzlichen Filterpapiers,
einer Abquetschvorrichtung, einer gewöhnlichen Wringmaschine oder auf andere geeignete
Weise vom Filterpapier entfernt. Hierauf wird das nicht polare Lösungsmittel (Toluol)
für die bewegliche Phase, auch Entwicklurngslösungsmittel genannt, mit dem polaren
Lösungsmittel gesättigt.
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Ein Batterieglas geeigneter Abmessungen, z. B. von 30,5 X 45,7
cm, das ioo cm3 des nicht polaren Lösungsmittels enthält, wird mit einem großen
Filtrierpapierblatt, das in dem ,für die ortsfeste Phase zu verwendenden polaren
Lösungsmittel (Propylenglykol) eingeweicht wird, ausgelegt. Ein im Innern der Kammer
angeordneter ringförmiger Ständer trägt einen Behälter, der 350 cm3 des Lösungsmittels
für die bewegliche Phase (Tolual), welches, wie bereits oben erwähnt, mit denn Lösungsmittel
für die ortsfeste Phase (Propylengiykol) gesättigt ist, enthält. Das kurze, umgefaltete
Stück oder das gemeinsame Ende des Papiers wird in den Vorratsbehälter des Entwicklungslösungsmittels,
z. B. des für die bewegliche Phase bestimmten nicht polaren Lösungsmittels Toluol,
das mit Propylenglykol gesättigt worden ist, eingeführt.
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Das zu prüfende Sroeroid, in Aceton, Methylench:lorid, Methanol oder
Chloroform, wird. mittels einer Mikropipette .in einer Menge von etwa io bis
300 y an der etwa 3,8 cm unter dem Falz befindlichen Zufuhrstelle aufgebracht,
nach dem der Streifen zugeschnitten und mit der ortsfesten Phase, z. B. Propylenglykol,
gesättigt worden ist, jedoch bevor das gemeinsame Ende in den Vorratsbehälter eingeführt
wird. Die Kammer wird hierauf mit einem Glasdeckel geschlossen und mit einer Stärke-Glycerin-Paste
abgedichtet.
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Die Flüssigkeit der beweglichen Phase fließt dann infolge Adsorption
über das nach unten hängende Filterpapier, wodurch die Streifen entwickelt werden;
dies dauert 3 bis 72 Stunden oder länger, je nach dem Lösungsmittelgemisch .und
den Steroiden. Nach beendeter Entwicklung werden die Papierstreifen mittels eines
Ventilators bei Raumtemperatur getrocknet. Die Tüpfel des .ungesättigten Steroids
können sichtbar gemacht werden, indem man sie mit ultraviolettem Licht bestrahlt
(Haine s und Drake, Fed. Proc. Am. Soc. Exp. Biol., Bd. 9 . [195o], S. iSo). Diese
Entwicklung ist auf Steroide mit .konjugierten Doppelbindungen, z. B. Progesteron,
Corticosteron, i i-Desoxycorticosteron, i i - Dehyd,rocorti cos,t#--ron, i i - Dehydro
- 17 - oxycorticosteron, 17-Oxycorticosteron, i i=Desoxy-17-oxycorticosteron,
anwendbar. Der Steroidtüpfel, der sich anfänglich an der Zuführstelle befindet,
hat sich zusammen mit der beweglichen Phase um den Weg, der seiner Anziehung durch
die ortsfeste Phase umgekehrt proportional List und- ferner vom Verteilungskoeffizienten
zwischen den beiden Lösungsmitteln und dem zwischen dem Filtrierpapier und dem Lösungsmittelgemisch
bestehenden Adso,rptions-El.uierungs-Koeffizienten abhängig ist, weiterbewegt. Die
Affinität gegenüber der ortsfesten Phase (Propylenglykol) ist am größten für Steroidverbindungen
mit der größten Anzahl Oxygruppen. Somit bewegen sich diese Verbindungen langsamer
von der Zwfuhrstelle hinweg als die Steroide, die weniger Oxygruppen enthalten.
Desoxy.cortieos,teron., das 3 Sauerstoffatome aufweist, bewegt sich am schnellsten
von den bekannten Rindensteroiden, während die Corticosteraide, die 4 Sauerstoffatome
enthalten, sich langsamer .und die Corticosteroide mit 5 Sauerstoffatomen sich am
langsamsten von den bekannten Corticosteroiden bewegen. Tabelle i zeigt die Anordnung
einiger bekannter Corticosteroide auf Grund der Anzahl der Sauerstoffatome und der
Beweglichkeiten dieser Verbindungen.
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In Tabelle 2 sind die relativen Beweglichkeiten gewisser Steroide
bei Verwendung des Chromatographiedösungsmittelgemisches Propylenglykol-Toluo1 angegeben.
| Tabelle i |
| Name |
| 02 ........ Progesteron |
| 03 . . . . . . . . i i-Desoxycorticosteron |
| 17-0xyprogesteron |
| . . . . . . . i i-Dehyd-rocorticosteron |
| 17-Oxy-i i-desexycorticosteran (S) |
| Corticosteron |
| 05 . . . . . . . . 17-Oxy-i i-dehydrocortieosteron (E) |
| 17-Oxycorticosteron (F) |
(von oben nach unten mit fallender Beweglichkeit)
| Tabelle 2 |
| Bei Papierch.romatogrammuntersuchungen erhaltene |
| relative Beweglichkeiten mehrerer Steroide |
| (mit fallender Beweglichkeit von oben nach unten |
| angeordnet) |
| Propylenglykol-Toluol |
| i i-Desoxycorticosteron |
| 17-Oxyprogesteron |
| i i-a-Oxyprogesteron (U-III) |
| Corticosteron |
| 17-Oxy-i i-desoxycorticos:teron (S) *) |
| 20 u, 21-Dioxy-4-pregnen-3-on *) |
| 20 ß, 2i Dioxy-4-pregnen-3-on |
| 17-Oxy-1 i-dehydrocorticosteron (E) |
| Dioxyprogesteron (U-1) |
| 17-Oxycorticosteron (F) |
| (Die rascher beweglichen Steroide befinden -sich in |
| der Tabelle oben) |
| *) Unterscheiden sich in diesem System nicht. |
Reihenfolge der Beweglichkeit HO i Ester J Ketone in einer gegebenen Stellung in
gegebenen Verbindungen.
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Bei einer sörgfältigen Betrachtung der den folgenden Beispielen beigeordneten
Papierchromatogrammphotographien ist ersichtlich, daß jeder Tüpfel auf dem Papierchromatogramm
zu einer einzelnen Verbindung gehört, wobei die weniger stark polaren die sich rascher
bewegen, bis zu einer Stelle wandern, die vom Ausgangspunkt weiter entfernt ist
als jene der stärker polaren, stärker oxydierten Verbindungen, die im gleichen Versuch
geprüft@werden. Auf diese Weise ist es möglich, .die Steroidverbindung nicht nur
qualitativ zu identifizieren, sondern auch ungefähr die Menge dieser bestimmten
Verbindung durch Vergleich .mit einer Kontrollsubstanz von bekannter Menge zu bestimmen.
Man kann aber auch diejenige Zone des Fapierchromatogramms; die das zu bestimmende
Steroid enthält, ausschneiden, dieses Teilstück mit einem organischen Lösungsmittel,
z. B. Alkohol oder Aceton, extrahieren und die Ultraviolettabsorption messen. Es
ist somit .möglich, den ungefähren Oxydiationsgrad des S'teroids zu bestimmen, da
man auf Grund der anfänglich auf den Streifen aufgebrachten bekannten Steroidmenge
die bloße Zahl der Tüpfeil der verschieden hoch oxydierten Steroidverhindungen feststellen
und die relative Helligkeit, Dichte oder Ultraviolettabsorption angenähert vergleichen
kann.
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Da die i i-Desoxysteroide beim Glykogeneinlagerungsprifversuch von
P abs t und Mitarbeitern (Endocrinology Bd. 41 [19q.7], S. 55) keine bedeutsame
Wirksamkeit aufweisen, wurde der Glykogeneinlagerungsversuch von P a b s t dazu
verwendet, um die Umwandlung der i i-Desoxysteroide in die entsprechenden in i i-Stellung
oxydierten Steroide nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zu bestimmen. Die in i
i-Stellung oxydierten Steroide sind bekanntlich erheblich wirksam bei der Glykogeneinlagerungsprüfung.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.
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Beispiel i Es wurde eine, vegetative Saat aus einer Neomycinkudtur
(Strepytomyces f.radiae, Stamm 3535) hergestellt, indem die Kultur 3 Tage bei 24°
in bewegten Schüttelkolben .in einer Flüssigkeit der folgenden Zusammensetzung gezüchtet
wurde: Rohdextrose (Cerelo,se) . . . . . . . . . io g Branntweinbrenrnereirückstände
... 5 g Kaliumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 Bierhefe ........................
io g Calciumcarbornat . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 g Leitungswasser ... ..
.. .. .. .. .. .. . 1 1 Diese Nährflüssigkeit wurde vor dem Impfen sterilisiert.
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Die er altene Saat wurde zum Impfen einer Nährflüssigkeit der folgenden
Zusammensetzung verwendet.
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Rohdextrose . .. . . . . . . . . .. .. . . . . . 25 g Soj abohnenmehl
. . . . . . . . . . . . . . . . . 259
Natri.umchlorid . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 59
Calciumcarbonat . . . . . .. . . . . . . . . . .
59
Branntweinbrennereirückstände ... 59
Cabaltochlorid-hexahydrat
....... i mg Leitungswasser . .. .... ........... 1 1 Das Saatverhältnis
betrug 5 ,eins flüssige vegetative Saat je Zoo ciri3 Nährflüssigkeit, je Kolben
wurden ioo cm3 Flüssigkeit verwendet. Zuerst wurden die benötigten i5o Kolben mit
Nährflüssigkeit gefüllt.
-
Die Kultur wurde unter Schütteln auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung
41 Stunden bei 2q.° wachsengelassen, worauf eine sterile Äthanollösung von 5 g i
i-Desoxy-l7-oxycorticosteron (Verbindung S) in einer Konzentration von 33,3 mg in
3 cm3 Äthanol je ioocm3 Gärungsflüssigkeit zugesetzt wurde. Die Kultur -wurde hierauf
weitere 7 Stunden bebrütet, worauf die Kolbeninhalte (15 1) vereinigt und mit einem
gleichen Volumen Aceton versetzt wurden.
-
Dann gibt man zusätzlich 45 1 Aceton zu, um ein 8oo/oi.ges Aceton
zu erhalten. Das Gemisch wurde 2 Stundengerührt und filtriert, worauf der Niederschlag
mit 25 1 8oo/oigem Aceton 2 Stunden gerührt, filtriert, der Filterkuchen verworfen
und das Acetonfiltrat mit dem bei der ersten Filtration erhaltenen Acetonfiltrat
vereinigt wurde. Das Filtrat wurde im Vakuum bei einer unter 5o° liegenden Temperatur
eingedampft; der erhaltene wäßrigeRückstand durch Zugabe von 41 Aceton auf eine
2oo/oige Acetonlösung eingestellt, die Lösung fünfmal mit 1/s der Volumenmenge gemischter
Hexane gewaschen, die Hexanfraktion zweimal mit 1/1o Volumen 2oo/aigem Aceton extrahiert,
der Hexanrückstand beiseite gestellt, der 2oo/oige Acetonextrakt mit der vor-gängig
erhaltenen 2o1/eigen Acetonhauptfraktion vereinigt und der 2oo/oire Gesamtacetonextrakt
sechsmal mit
1/a seines Volumens Äthylendichlorid extrahiert. Der
erhaltene wäßrige Rückstand wurde beiseite gestellt. Die vereinigten Äthylendichloridfraktionen
wurden hierauf mit 1/1o Volumen destilliertem Wasser gewaschen, worauf das Äthylendichlorid
im Vallcuum bei einer unter 5o° liegenden Temperatur abdestilliert wurde. Der Rückstand
wurde in Essigsäureäthylester gelöst und die Lösung mit folgenden Waschflüssigkeiten
gewaschen: zweimal mit 1/s Volumen wäßrigem Natriurnbicarbonat, einmal mit 1/1o
Volumen Wasser, dreimal mit 1/1o Volumen 2%igem wäßrigem Natriumcarbonat, einmal
mit 1/1o Volumen Wasser, dreimal mit 1/1o Volumen o,5 n Salzsäure, einmal mit 1/1o
Volumen Wasser, dreimal mit 1/1o Volumen 3%igem wäßrigem Natriumbicarbonat, viermal
mit 1/1o Volumen destilliertem Wasser oder so viel wie zur Erzielung einer neutralen
Reaktion erforderlich ist. Jede wäßrige Waschflüssigkeit wurde mit Essigsäureäthylester
angezogen. Die Essigsäureäthylesterfraktionen wurden vereinigt.
-
Glykogeneinlagerungsprüfungen nach der Methode von P ab s t ergaben
eine Ausbeute von 0,28 Glykogeneintheiten je :@Zi@.lligr:amm Essigsäureäthylesterextrakt.
Die theoretische Umwandlung in die Verbindung F (17-Oxvcorticosteron) betrug somit
2,8%, wobei die Glykogeneinheit jener Betrag der Bioaktivität ist, der i :mg 17-Oxycorticosteron
(Verbindung F) entspricht.
-
2,425 g des Hormonkonzentrates wurden chromatographiert. Das Ausgangsmaterial
wurde in wenig Methylenchlorid gelöst und an drei Filtrierpapierscheiben, die vorgewaschen
wordenwaren, adsorbiert. Das chromatographischeAdsorptionsmittel bestand aus 400
g Siliciumdioxydgel und 26o cm3 Äthylenglykol. Die Größe der Säule betrug 5,1 cm
im Durchmesser bei einer Höhe von 45,7 cm. Für den Abfluß von 6o cm3 wurden etwa
16 Minuten benötigt. Es wurden fünf Entwicklungslösungsmittel verwendet: Cyclahexan,
Cyclahexan-Methylenchlorid (4: i), Cyclohexan-@'Iethylenchlorid (i : i), Cyclohexan-Methylenchlori@d
(i : 4) und Methylenchlorid.
-
Eine zusätzliche Menge an kristallisiertem Material wurde aus den
Mutterlaugen erhalten. Dieses Material wurde ebenfalls als i7-Oxycorticosteron identifiziert.
Beispiel 2 Bei diesem Versuch wurden Zoo .mg der Verbindung S mit Neomycin (Streptomyces
frag iae, Stamm 3535) 7 Stunden in der im Beispiel i beschriebenen Weise oxydiert.
Es wurden insgesamt sechs Kalben bzw. 6oo cm3 Gärungsflüssigkeit verwendet. Glykogeneinlagerungsprüfungen
ergaben einen Wert von 0,22 Einheiten je Mill-igram-m Substrat. Dieser Wert entspricht
einer theoretischen Umwandlung in die Verbindung F von 2,2 0/0. Nach Herstellung
des neutralen Hormonextraktes in der im Beispiel i beschriebenen Weise, wurden 165
mg des neutralen Hormonkonzentrates der Papierchromatographie unterworfen. Beispiel
3 Kultur: Streptomyces H-39. Nährflüssigkeit: Dextrin .........................
io g Maiseinweichflüssigkeit .......... 8o g Calciumoarbon.at . .. . . . . . . .
. . .. .. . i g Natriu.mchlorid . . . .. . . . . . . .. . . . . . 59
Leitungswasser
. .. . . .. .. . . .. . . .. . t 1 Das pli wurde mit Kaliumhydroxyd auf 6,6 eingestellt.
-
Gärungsflüssigkeit: Gleiche Zusammensetzung wie Nährflüssigkeit.
-
Bei diesem Versuch wurden Zoo mg der Verbindung S mit Streptomyces
(H-39) 7 Stunden in der -im Beispiel i beschriebenen Weise oxydiert. Die Gärungsflüssigkeit
wurde hierauf in zwei Hälften geteilt. Ein Teil wurde gemäß der im Beispiel i beschriebenen
Arbeitsweise direktextrahiert, während ,der andere Teil vor der Extraktion auf pli
i eingestellt wurde. Die aus diesen beiden. Teilen erhaltenen neutralen Hormonkonzentrate
wurden mittels des Gly kogeneinlagerungsprüfve.rsuches geprüft. Der Versuch mit
der direkten Extraktion lieferte 0,35 Glykogeneinheiten je Milligramm Substrat.
Dieser Wert entspricht einer theoretischen Umwandlung von 3,5'/o in die Verbindung
F. Die Analyse des Teiles mit PH i ergab 0,30 Einheiten je Milligramm Substrat.
Dieser Wert entspricht einer theoretischen Umwandlung von 3'/o in die Verbindung
F. Die neutralen Hormonkonzentrate wurden außerdem durch P.apierchromatographie
analysiert. Beispiel 4 Bei diesem Versuch wurden 200 mg der Verbindung S mit einer
Neomycinkultu,r .in der im Beispiel i beschriebenen Weise oxydiert. Das nach der
in Beispiel i beschriebenen Weise erhaltene neutrale Hormonkonzentrat von igo mg
wurde in einer möglichst kleinen Menge Aceton, gelöst und auf Filterpapierscheiben
übergeführt. Das Adsorptionsmittel bestand aus 30 g von mit 2 i cm3 Äthylenglykol
versetztem Siliciumdioxyd. In etwa 35 Minuten wurden 6o cm3 Flüssigkeit durchgelassen.
Die Säule wurde mit vier verschiedenen Lösungsmitteln entwickelt, nämlich mit Cyclohexan,
Cyclohexa.n-MethylendichIorid (4: i), Cyclohexan-Methylenchlorid (i: i) und Cyalohexan-Methylenchlorid
(1:4). Beispiel 5 Die zur Herstellung der vegetativen Ne'omycinsaat verwendete Nährflüssigkeit
enthielt je Liter io g Rohdextrose, io g Bierhefe, 5 g Br:anntweinbrennereirückstände,
49 Kaliumchlorid. ioo cm3 dieser Flüssigkeit wurden in einem Erlenmeyerkol@ben von
50o cm3 3o Minuten sterilisiert. Nach erfolgter Abkühlung wurden vier Kolben mit
einer Agarkultur von Streptomyces fradiae, Stamm 3535 geimpft und dann 3 Tage in
einem auf 24° gehaltenen Brutschrank auf einer bewegten Schüttelvorrichtung sich
selbst überlassen. Die erhaltene Kultur war stark entwickelt und wurde verwendet,
um die
Gärung in den fünf unten beschriebenen Kolben von 18,9 1
durchzuführen.
-
8 1 einer aus 25 g Rohdextrose, 25 g Soj abohnenmehl, 5 g Natriumchlorid,
5 g Calciumcarbonat, 5 g Branntweinbrennereirückstände, i mg Kobaltdichlorid-hexahyd,rat
und i 1 Leitungswasser bestehenden Nährflüssigkeit wurden in einem Kolben von i8891
6o Minuten sterilisiert. Der Kolben war mit einem Rührer, einem Rohr zum Einleiten
von Luft am Bodendes Kolbens, einem Wattefilter zur Sterilisierung der Luft, einer
Vorrichtung zur Entnahme von Proben und einem mit einem Filter versehenen Luftauslaß
ausgerüstet. Nach erfolgter Abkühlung wurden die 81 sterile Flüssigkeit .mit 40o
cm3 der oben beschriebenen vegetativen Saat geimpft, in ein auf 24 bis 26° gehaltenes
Wasserbad gestellt, bei 270 Umdrehungen je Minute gerührt und je Minute mit 61 Luft
belüftet. Ferner wurde ein Schaumverhinderungsmittel in genügender Menge zugegeben.
-
47 Stunden nach dem Impfen wurden dem Gemisch 2,7 g der Verbindung
S in 270 cm3 Äthylalkohol zugegeben. Diese Lösung wurde durch ein Ultrafilter
aus gesintertem Glas filtriert. Die Oxydation wurde 7 Stunden fortgesetzt, der Kolben
aus dem Wasserbad genommen, dann wurden 8 1 Aceton zugesetzt und das Gemisch in
einem kalten Raum aufbewahrt, bevor es extrahiert wurde. Glykogenprüfungen ergaben
eine Ausbeute von 0,58 Einheiten je Milligramm Substrat, entsprechend einer
Umwandlung von 5,8'% in die Verbindung F.
-
Beispiel 6 Nährflüssigkeit für Neomycin (Streptomyces fradiae, Stamm
3535) Rohdextrose ... .. .. .. ........... io g Branntweinbrennereirückstände
... 59
Kaliumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 g Calciumcarbonat
. . . . . . . . . . . . . . . . . i g Leitungswasser . .. . . .. . . . . . . . .
.. . i 1 Bierhefe ... ..................... io g Das vegetative Impfmaterial wurde
durch Züchten der Kultur während 3 Tagen. bei 24° in Schüttelkolben hergestellt.
-
Gärungsflüssigkeit: Rohdextrose .................... 25 g Sojabohnenmehl
. .. . . .. . .. .. .. .. . 25 g Natriumchlorid . . . .. . . .. . . .. . . . . .
59
Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
Branntweinbrennereirückstände
... 59
Kobaltdichlorid-hexahydrat . .. . .. . i mg Leitungswasser . .. . .
.. .. . . . . . . . . . i 1 Diese Kultur wurde 24 Stunden auf einer rotierenden
Schüttelvorrichtung bei 24° wachsen gelassen, worauf eine sterile Lösung von i i
i mg i i-Desoxycorticosteron in einer Konzentration von 37 mg (in 3 cm3 Äthanol)
je ioo cm3 Gärungsflüssigkeit zugesetzt wurde. Die Kultur wurde hierauf weitere
16 Stunden wachsen gelassen; den vereinigten Kolbeninhalten, insgesamt
300 cm3, wurde eine gleiche Volumenmenge Aceton zugesetzt. Glykogenprüfungen
des in der im Beispiel i beschriebenen Weise erhaltenen, neutralen Hormonextraktes
ergaben eine Ausbeute von 0,i35 Einheiten je Milligramm Substrat, entsprechend einer
3,8%igen theoretischen Umwandlung in Corticosteron (Verbindung B).
-
Beispiel Bei diesem Versuch wurden Zoo mg ii-Desoxycorticosteron mit
einer Neomycinkultur in der im Beispiel i beschriebenen Weise 7 Stunden oxydiert.
Der neutrale Hormonextrakt wurde gemäß der im Beispiel i beschriebenen Arbeitsweise
erhalten.
-
Weitere 43,6 mg des neutralen Hormonkonzentrates wurden in einer Säule
cbromatographiert. Dieser Teil des Konzentrates wurde in der bereits beschriebenen
Weise auf Filterpapierscheiben übergeführt. Das Adsorptionsmittel bestand aus 25
g von mit 17 em3 Äthylenglykol versetztem Siliciumdioxyd. In etwa 40 Minuten
wurden 6o em3 Flüssigkeit abfließen gelassen.
-
Beispiel 8 Nährflüssigkeit für Streptomyces H-39: Dextrin .........................
io g Maiseinweichflüssigkeit ....... ... 8o g Calciumcarbonat . . . . . .
. . . . . . . . . . . i g Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . .
59
Leitungswasser . .. . . .. . . . . . . . . . . . i 1 Die Flüssigkeit
hatte ein pH von 6,5 bis 6,7. Die vegetative Saat dieser Kultur wurde 3 Tage bei
24° in einem hin und her bewegten Schüttelbehälter wachsen gelassen.
-
Gärungsflüssigkeitvon gleicher Zusammensetzung wie die Saatflüssigkeit.
-
DieseKultur wurde 24Stunden auf einer rotierenden-Schüttelvorrichtung
bei 24° wachsen gelassen, worauf eine sterile, äthanolische Lösung von ioo mg i
i-Desoxycorticosteron in einer Konzentration von 33,3 mg (in 3 cm3 Äthanol) je ioo
cm3 Gärungsflüssigkeit zugesetzt wurde. Die Kultur wurde hierauf weitere 16 Stunden
wachsen gelassen, worauf den vereinigten Kolbeninhalten, insgesamt 300 cm3,
eine -gleiche Volumenmenge Aceton zugesetzt wurde. Der neutrale Hormonextrakt wurde
in der .im Beispiel i beschriebenen Weise erhalten.
-
Die Glykogenprüfung mit dem neutralen Hormonkonzentrat ergab eine
Ausbeute von 0,075 Einheiten je Milligramm Substrat, entsprechend einer 2,i%igen
theoretischen Umwandlung in Corticosteron.
-
Beispiel 9 Nährflüssigkeit für Streptomyces K93 von der gleichen Zusammensetzung
wie die des Beispiels 6. Gärungsflüssigkeit: Rohdextrose . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 25,0 g Bierhefe ....................... 2,5 g Ammoniumsulfat . . .
. . . . . . . . . . . 5109 Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . 8,o g Kaliumchlorid
. . . . . . . . . . . . . . . . . 4,0 g Saures Kaliumphosphat . . . . . . . . 0,49
Sojabohnenmehl . .. ... .. . . . . . . . 7,09
Leitungswasser . . . . . . .
. . . . . . . . . 1,0 1
Diese Kultur wurde 48 Stunden bei
24° in Kolben auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung wachsen gelassen, worauf
eine sterile, äthanolische Lösung von ioo mg i i-Desoxycorticosteron in einer Konzentration
von 33,3 mg (in 3 cm3 Äthanol) je ioo cm3 Gärungsflüssigkeit zugesetzt wurde. Die
Kultur wurde hierauf 16 Stunden weiter wachsen gelassen, worauf den vereinigten
Kolbeninhalten, insgesamt 300 cm 3, eine .gleiche Volumenmenge Aceton zugesetzt
wurde. Die neutrale Hormonfraktion wurde in der sm Beispiel i beschriebenen Weise
erhalten. Glykogenprüfungen ergaben eine Ausbeute von etwas mehr als 0,07
Einheiten je Milligramm Substrat, entsprechend einer theoretischen Umwandlung in
Corticosteron von etwas mehr als i,90/0.
-
Beispiel io Nährflüssigkeit für Streptomyces endus von der gleichen
Zusammensetzung wie die des Beispiels 9. Gärungsflüssigkeit von der gleichen Zusammensetzung
wie die des Beispiels 9.
-
ioo mg i i-Desoxycorticosteron wurden mit Streptomyces endus (9-2o)
i6 Stunden oxydiert. Der neutrale Hormonextrakt wurde 'in der .irn Beispiel i ,beschriebenen
Weise erhalten. Es wurden etwas mehr als o,075 Glykogeneinheiten je Milligramm Substrat
erhalten, entsprechend einer theoretischen Umwandlung von etwas mehr als 2,i% in
die Verbindung B (Corticosteron).
-
Beispiel ii Nährflüssigkeit für Streptomyces W-4 von der gleichen
Zusammensetzung wie die des Beispiels 9. Gärungsflüssigkeit von der .gleichen Zusammensetzung
wie die des Beispiels 9.
-
ioo mg Desoxycorticosteron wurden mit Streptomyces (W-4) 17 Stunden
oxydiert. Der neutrale Hormonextrakt wurde in der im Beispiel i besch.riebenen Weise
erhalten. Die Glykogenprüfung ergab eine Ausbeute von etwas mehr als o,o65 Einheiten
je Milligramm Substrat, entsprechend einer theoretischen Umwandlung von etwas mehr
als i,8% in Corticosteron.
-
Beispiel 12 Nährflüssigkeit für Streptomyces BC 17: Dextrin . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2o,o g Ammoni.umsulfat . . . . . . . . .
.. . . . io,o g Calciumcar'bonat . . . . . . . . . . . . . . . 16,o g Bierhefe .......................
2o,o g Kaläumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . 4109 Saures Kaliu.mphosphat
. . . . . . . . 0,29 Leitungswasser . . . . . . . . . . . . . . . . I,01 Die vegetative
Saat wurde durch Züchten der Kultur während 3 Tagen bei 24° in Schüttelkolben hergestellt.
-
Gärungsflüssigkeit: Rohdextrose . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . 25,0 g Bierhefe ....................... 5,o g Ammoniumsulfat . . . .
. . . . . . . . . . 5,09
Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . 8,o
g Natriumchlorid ................ 4,09 Saures Kaliumphosphat . . . . . . . . 0,49
Sojabohnenmehl . . . . . . . . . . . . . . . 7,09
Leitungswasser . . . . .
. . . . . . . . . . . I,01 Kobaltdichlori-d-hexahydrat .... i,o mg Diese
Kultur wurde 72 Stunden bei 24° in Kolben auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung
wachsen gelassen, worauf eine sterile, äthanolische Lösung von ioo mg i i-Desoxycorticosteron
in einer Konzentration von 33,3 mg (in 3 cmg Äthanol) je ioo cm3 Gärungsflüssigkeit
zugesetzt wurde. Die Kultur wurde hierauf weitere 16 Stunden wachsen gelassen, worauf
den vereinigten Kolbeninhalten, 300 cm3, eine gleiche Volumenmenge Aceton
zugesetzt wurde. Ein neutraler Hormonextrakt wurde in der im Beispiel i beschriebenen
Weise erhalten.
-
Die Glykogenprüfung ergab eine Ausbeute von o,o6Einheiten
je Milligramm Substrat, entsprechend einer theoretischen Umwandlung von 1,6%
in Corticosüeron.
-
Beispiel 13 Nährflüssigkeit für Saccharomyces pastorianus (ATCC 2366)
Rohdextrose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . io,o g Branntweinbrennereirückstände
. 5109 Kaliumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . 4,09 Bierhefe 2019 . . .
. . . . . . . ..... ... io,o g Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . .
. . i,0 g Leitungswasser . . . . . . . . . . . . . . . . I,01 Gärungsflüssigkeit:
Rohdextrose . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 2o,o g Bierhefe .......................
2o,o g Ammoniumsulfat . . . . . . . . . . . . . . io,o g Kaliumchlorid . . . . .
. . . . . . . . . . . . 4,09 Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . 16,o
g Saures Kaliumphosphat . . . . . . . . 0,2 g Leitungswasser . . . . . . . . . .
. . . . . . I,01 Dieses Medium wurde 30 Minuten sterilisiert.
-
Die vegetative Saat der Kultur wurde durch Züchten der Kultur während
3 Tagen bei 24° in Schüttelkolben hergestellt. Im Zeitpunkt des Impfens der Gärungsflüssigkeit
im Verhältnis von 5 cm3 vegetativer Saat je ioo cms Gärungsflüssigkeit wurde eine
sterile äthanolische Lösung von ioo mg i i-Desoxycorticosteron in einer Konzentration
von 33,3 mg (in 3 cm3 Äthanol) je ioo cm3 Gärungsflüssigkeit zugesetzt. Die Kultur
wurde hierauf bei 24° 9o Stunden in Schüttelkolben auf einer bewegten Schüttelvorrichtung
wachsen gelassen, worauf den vereinigten Kolbeninhalten, insgesamt 300 cm3,
eine gleiche Volumenmenge Aceton zugesetzt wurde. Eine neutrale Hormonfraktion wurde
in der :im Beispiel i beschriebenen Weise erhalten.
-
Glykogenprüfungen mit der neutralen Hormonfraktion ergaben eine Ausbeute
von o,o65 Einheiten je Milligramm Substrat, entsprechend einer theoretischen Umwandlung
von o,8% :in Corticosteron.
Beispiel 14 Aspergillus fumigatus H-3
Die Nährflüssigkeit hatte die gleiche Zusammensetzung wie die des Beispiels 13.
In diesem Falle wurde die Saat 2 Tage bei 24° in Schüttelflaschen wachsen gelassen.
-
Gärungsflüssigkeit: Rohdextrose ....... . . . . . . . . . .
. . 25,o g Bierhefe ....................... 2,59
Ammoniumsulfat . . . . .
. . . . . . . . . 5109 Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . 8,o g Natriumchlorid
. . . . . . . . . . . . . . . . 4,09 Saures Kaliump:hosphat . . . . . . . . 0,49
Sojabohnenmehl . .. ... .. .. . . . . . 7,o g Leitungswasser . . . . . . . . . .
. . . . . . i,o 1 Diesem Gärungsmedium wurde eine sterile, äthanolische Lösung von
ioo mg i i-Desoxycorticosteron in einer Konzentration von 33,3 mg (in 3 cm3 Äthanol)
zugesetzt. Die Kultur wurde hierauf in Kolben auf einer hin und her bewegten Schüttelvorrichtung
114 Stunden wachsen: gelassen, worauf den vereinigten Kolbeninhalten"insges@amt
300 cm3, eine gleiche Volumenmenge Aceton zugesetzt wurde. Die Glykogenprüfung
mit dem neutralen Hormonkonzentrat, das in der im Beispiel i beschriebenen Weise
erhalten wurde, ergab eine Ausbeute von 0,05 Einheiten je Milligramm Substrat,
entsprechend einer theoretischen Umwandlung von 1,4'/o in Corticosteron.
-
Beispiel 15 Penicillium ch.ry sogenum, Wisconsin-Stamm 48-7o1 Nährflüssigkeit:
Lactose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2o,oo g Dextrose .....................
5,009
Branntweinbrennereirückstände 2o,oo g Harnstoff . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . 1'009 Saures Kaliumphosphat ....... 0,509
Magnesiumsulfat
. ... .. .. .. . . . 0,25 g Leitungswasser ............... 1,001 Die vegetative
Saat wurde. durch Wachsenlassen der Kultur während 3 Tagen bei 24° in Schüttelkolben
hergestellt.
-
Gärungsflüssigkeit: Lactose ......... ............... 309
Maiseinweichflüs.sigkeit
. . . . . . . . . . 4o g Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . log Gärfett
. . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iö cm3 Leitungswasser . .. ....
.. .. .. .. .. . 1 1 Die Kultur wurde 40 Stunden bei 24° in Kolben auf einer rotierenden
Schüttelvorrichtung wachsen gelassen, worauf eine sterile, äthanolische Lösung von
ioo mg ii-Desoxycorticosteron in einer Konzentration von 33,3 cm3 (in 3 cm3 Äthanol)
je ioo cmg Gärungsflüssigkeit zugesetzt wurde. Die Kultur -wurde hierauf weitere
7 Stunden wachsen gelassen, worauf den vereinigten Kolbeninhalten, insgesamt 3oo
em3, eine gleiche Volumenmenge Aceton zugesetzt -wurde. Die Glykogenprüfung mit
dem neutralen Hormonkonzentrat, das in der im Beispiel i beschriebenen Weise erhalten
-wurde, ergab eine Ausbeute von 0,075 Einheiten je Milligramm Substrat, entsprechend
einer theoretischen Umwandlung von 2,1% in Corticosteron.
-
Beispiel 16 Die Nährflüssigkeit der Saat hatte folgende Zusammensetzung
Dextrin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20,09 Ammoniumsulfat .. .
. . . . . . . . . . . io,o g Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . 16,o
g Bierhefe ....................... 2o,o g Kal,iumchlori.d . . . . . . . . . . .
. . . . . . 4,09 Saures Kal:iu.mphosphat . . . . . . . . o,2 g Leitungswasser ................
1,01 Das pH wurde mit Kaliumhydroxyd auf 7,5 eingestellt.
-
ioo cm3 der Flüssigkeit wurden in Kolben von 500 cm3 Inhalt
30 Minuten mit Wasserdampf sterilisiert und nach dem Abkühlen mit einer Agarkultur
von Streptomyces sp. B.D-17 geimpft; dann wurde der Kolben 3 Tage auf einer hin
und her bewegten Schüttelvorrichtung geschüttelt. Die Wachstumstemperatur lag bei
24°. Je 5 cm3 der erhaltenen, stark entwickelten. vegetativen Kultur wurden zum
Impffen von drei Kolben, die ioo cm3 der folgenden Nährflüssigkeit enthielten, verwendet:
Rohdextrose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25,09 Bierhefe . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . 5,0 g Ammoniumsulfat . . . . . . . . . . .
. . . 5109 Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . 8,0 g Natriumchlorid .
. . . . . . . . . . . . . . . 4,0 g Sojabohnenmehl . .. . . . .. . . . . . . .
7,09
Saures Kaliumphosphat . . . . . . . . 0149 Leitungswasser ................
1,01 Die Kolben wurden 41 Stunden auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung in einem
auf 24° gehaltenen Brutraum geschüttelt. In diesem Stadium der Gärung wurden jedem
Kalbern 33,3 mg ii-Desoxycorticosteron in 3 cm3 Alkohol :bzw. den drei Kolben eine
Gesamtmenge von ioo mg zugesetzt. Die äthanolische Lösung des i i-Desoxycorticosterons
wurde durch ein Ulitraglasfilter filtriert. Die Kolben wurden weitere 7 Stunden
nach der Zugabe des Steroids geschüttelt. Den vereinigten Kolbeninhalten, insgesamt
300 cm3, -wurden 300 cm3 Aceton zugesetzt. Das Gemisch -wurde in einem
kalten Raum aufbewahrt und in der im Beispiel i beschriebenen Weise extrahiert.
-
Das neutrale Hormonkonzentrat wurde mittels der Glykogenprüfung untersucht.
Es wurde eine toxische Wirkung festgestellt, die gewöhnlich zur Folge hat, daß die
Aktivität gegenüber dein wahren Wert eine Verkleinerung erfährt.
-
Beispiel 17 Zur Herstellung der vegetativen Saat wurde die folgende
Nährflüssigkeit verwendet: ' Dextrin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . log
Maiseinweichflüssigkelt . . . . . . . . . . 8o g Natriumchlorid
. . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
Calciumcarbonat . . . . . .
. . . . . . . . . . . 1 g Leitungswasser . .... .. .. .. .. .. ... 1 1
Das
pH wurde mit Kaliumhydroxyd auf 6,7 eingestellt. ioo cm3 Flüssigkeit wurden in einem
Erlenmeyerkol'ben mit Wasserdampf 3o Minuten sterilisiert und nach dem Abkühlen
mit einer Agarkultur von Aspergillus fumigatus, Stamm H-3, geimpft. Der Kolben wurde
3 Tage auf einer bewegten Schüttelvorrichtung in einem auf 24° gehaltenen Brutschr.aek
geschüttelt.
-
Je 5 cm3 der erhaltenen, stark entwickelten Kultur wurden zum Impfen
von sechs Kolben verwendet, die je ioo cm3 Flüssigkeit der gleichen Zusammensetzung,
wie die für die Herstellung der Saat verwendete, enthielten. Nach dem Impfen wurden
die Kolben 41 Stunden geschüttelt. In diesem Stadium wurden jedem Kolben 33,3 mg
ii-Desoxycorticosteron in 3 cm3 Äthanol zugesetzt. Die äthanolische Lösung des ii@Desoxycorticosterons
wurde durch ein Ultrafilter aus gesintertem Glas filtriert. Nach weiteren 7 Stunden
wurden die Kolbeninhalte, insgesamt 60o am3, vereinigt und mit einer gleichen Volumenmenge
Aceton versetzt. Das Gemisch wurde in einem kalten Raum aufbewahrt und in der im
Beispiel i beschriebenen Weise extrahiert.
-
Von den anderen Mikroorganismen, die sich außer den Bakterien der
Gattung Streptomyces für die Oxydation von Steroiden einschließlich ii-Desoxysteroiden
geeignet erwiesen .haben, wenn auch nicht notwendigerweise mit den gleichen Ergebnissen
wie bei Verwendung der Bakterien der Gattung Streptomyoes, können verschiedene Penicillinstämme,
beispielsweise Penicillin ch.ry sogenum, der Wisconsin-Stannm 48-70i, ferner Aspergilli,
beispielsweise Aspergillus fumigatus H-3, und Saccharomyces, beispielsweise Saccharomyces
pastorianus, und ähnliche Arten verwendet werden.