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Verfahren zur Einführung von Sauerstoff in Steroide Es ist bereits
bekannt, mittels Enzymen aus Nebennieren, insbesondere mit deren Homngenaten, oder
auch bei ihrer Durchströmung Hydroxylgruppen, unter anderem in x7 a-Stellung von
Steroiden, einzuführen. So interessant diese Funktion tierischer Enzyme vom theoretischen
Standpunkt aus ist, so vermag sie zur präparativen und speziell industriellen Gewinnung
von 17 a-Oxy-steroiden nicht zu befriedigen. Mit mikrobiologischen Methoden, die
sich auch in größtem Stile anwenden lassen, ist die genannte Reaktion bisher nicht
durchführbar gewesen. Es wurde nun gefunden, daß Sauerstoff in Steroide durch Bebrütung
mit Kulturen oxydierend wirkender Pilze oder den durch diese erzeugten oxydierend
wirkenden Enzymen unter aeroben Bedingungen eingeführt werden kann, wenn man Verbindungen
der Pregnanreihe, die in 17-Stellung ein Wasserstoffatom aufweisen, der biologischen
Oxydation mit Pilzen der Arten Trichothecium roseum, Leptosphaeria maculans, Cucurbitaria
laburni, Acrospeira levis, Lophotrichus hartinii, Melanospora parasitica, Thielavia
terricola in bekannter Weise unterwirft und die erhaltenen 17-Oxyverbindungen
der
Pregnanreihe in bekannter Weise isoliert. Ausgangsstoffe für das neue Verfahren
sind allgemein Verbindungen der Pregnanreihe mit einem `JVasserstoffatom in i7-Stellung,
worunter gesättigte und ungesättigte, beliebig konfigurierte und substituierte Derivate
des 1o,13-Dimethyl-i7-äthyl-cyclopentano-polyhydrophenanthrens sowie seiner hrheren
und niederen Homologen, beispielsweise entsprechende A-Noi-, D-Homo-, ig-Nor-, zi-Nor-
und 2i-Homov erbindungen, verstanden sind. Doppelbindungen befinden sich z. i3.
in 1-, 4-, 5-, 6-, 7-, g-, 14-, 15- und/oder zo-Stellung. Die Konfiguration der
Ausgangsstoffe ist vorzugsweise diejenige des Pregnans, 5a-Pregnans, i-,a-Lregnans
oder entsprechender Racemate, wie sie bei der Totalsynthese erhalten werden. Als
Substitu.enten kommen besonders in Frage freie bzw. funktionell abgewandelte Hydroxyl-,
Oxo- oder Carboxylgruppen, wie Ester-, Äther-, Thioester-, Thioäther-, Thiol- und
Thionester-, Acetal-, Mercaptal-, Ketal-, Hydrazon-, Semicarbazon- und Enolgruppen,
z. B. in 3-, 7-, 11-J 12-. 16-, 18-, ig-, 2o- und 2i-Stellung. Spezifische Ausgangsstoffe
sind unter anderem Cortexon (ii-Desoxycorticosteron), g, 11- oder ii, i2-Dehydrocortexon,
16a-Oxvcortexon, 18-Oxo- und i8-Oxycortexon, Corticosteron, ii-Epi-corticosteron,
ii-Dehydro-corticosteron,18-Oxy-corticosteron, i, q-Pregnadien-3, ii, 2o-trion-2i-ol,
i, 4-Pregnadien-3, 2o-dionii,B, 2i-diol, Progesteron, i7a-Progesteron, ii-Ketoprogesteron,
iia- sowie iiß-Oxyprogesteron, g, 11-oder ii, i2-Dehydroprogesteron, ig-Oxoprogesteron,
ig-Norprogesteron-,Pregnenolon-, zi-Oxypregnenolon, Aldosteron bzw. ihre funktionellen
Derivate.
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Die verwendeten Enzyme sind mikrobiologischer Herkunft und durch aerobe
Kulturen von Pilzen der obengenannten Arten produziert. Zur Einführung von Sauerstoff
inkubiert man meist direkt die Ausgangsstoffe mit den unter an sich bekannten aeroben
Bedingungen submerswachsendenKulturen dergenannten Pilze. Diese werden zweckmäßig
bewegt, d. h. geschüttelt oder gerührt, und enthalten assimilierbaren Kohlenstoff,
insbesondere Kohlenhydrate, sowie gegebenenfalls Wuchsstoffe, beispielsweise Maisquellwasser
oder Bierwürze, und anorganische Salze. Es sind somit natürliche, synthetische oder
halbsynthetische Nährlösungen brauchbar. Das praktisch einfachste Verfahren ist
im folgenden geschildert, ohne daß die Erfindung durch diese Angaben beschränkt
sein soll: Man züchtet die Organismen in Apparaturen and unter ähnlichen Bedingungen,
wie sie bei der Antibiotikafabrikation als sogenannte Tieftankverfahren bekannt
sind. Nach Entwicklung der Kulturen gibt man die genannten Ausgangsstoffe in feiner
Dispersion oder Lösung, beispielsweise in Methanol, Aceton oder Äthylenglykol, zu
und inkubiert weiter. Schließlich trennt man vom Mycel ab, extrahiert das Filtrat
undloder die Mycelmasse und isoliert aus dem Extrakt die Reaktionsprodukte in an
sich bekannter Weise, z. B, durch Entmischungsverfahren, Adsorption, Chrömatographie,
Kristallisation, Überführung in funktionelle Derivate, wie Girard-Verbindungen.
Dieselben Umsetzungen lassen sich aber auch durchführen, indem man die wirksamen
Enzyme aus entsprechenden aeroben Kulturen von Pilzen der obengenannten Arten zuerst
abtrennt und unter Ausschluß der wachsenden Kulturen verwendet.
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Die Verfahrensprodukte können als Heilmittel Verwendung finden oder
als Zwischenprodukte zu ihrer Herstellung dienen. Von größtem praktischem Interesse
sind z. B. Cortison, Hydrocortison, i, 2-Dehydrocortison, i, 2-Dehydrohydrocortison,
Reichsteins Substanz S, i7a-Oxy-aldosteron sowie die z. B. aus Progesteron, Pregnenolon
und ii-Ketoprogesteron entstehenden polyoxygenierten Derivate.
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Die Erfindung wird in den nachstehenden Beispielen beschrieben. Zwischen
Gewichtsteil und Volumteil besteht die gleiche Beziehung wie zwischen Gramm und
Kubikzentimeter.
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Daß man durch Pilze oder durch Pilze abgesonderte Enzyme Sauerstoffunktionen
in ein Steroid einführen kann, wurde bereits in der USA.-Patentschrift 2 6o2
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offenbart, welche ein Verfahren zur ii-Hydroxylierung von Steroiden mittels
Pilzen der Ordnung Mucorales beschreibt. Durch die vorliegende Anmeldung wird nun
der Stand der Kenntnisse durch die Lehre bereichert, daß zweckmäßig ausgewählte
Pilzarten, wie die hierin genannten, selektiveOxydation einesSteroides im Sinne
der i7-Hydroxylierung bewirken können. Beispiel i 2ooo Volumteile einer sterilisierten
Czapek-Dox-Nährlösung (proLiter Wasser: z g NaN 03, i g K2 H P 04, 0,59 KCl,
0,59 M9S04' 7 H20, o,ozg FeS04 - 7 H20, 5o g Glukose; pA der Lösung = 7)
werden mit einer Kultur von Trichothecium roseum beimpft und 5 Tage bei z7° geschüttelt.
Dann gibt man zur gut entwickelten Kultur unter sterilen Bedingungen eine Lösung
von 0,5 Gewichtsteilen Cortexon in 15 Volumteilen Aceton zu und schüttelt bei z7°
weiter. Nach 4 Tagen nutscht man ab, wäscht den Rückstand einige Male mit Wasser
und extrahiert das Kulturfiltrat dreimal mit je i2oo Volumteilen Essigester. Die
Essigester-Lösungen werden mit in-Salzsäure, Wasser, i n-Natriumbicarbonatlösung
und Wasser gewaschen, getrocknet und bei 4o bis 50° im Vakuum eingedampft. Der o,62
Gewichtsteile betragende Rückstand wird an io Gewichtsteilen Silicagel chromatographiert,
wobei zuerst mit Chloroform allein, dann mit Chloroform-Aceton-Gemischen, mit steigendem
Acetongehalt eluiert wird. Mit Chloroform und Chloroform-Aceton. (95:5) werden wenig
Cortexon enthaltende Verunreinigungen eluiert. Die ersten Chloroform-Fraktionen
mit io °% Aceton geben beim Eindampfen einen Rückstand, der mit konzentrierter Schwefelsäure
die für Substanz S (i7a-Oxy-cortexon) charakteristische karminrote Färbung gibt.
Dieser Rückstand wird aus Aceton-Äther-Gemischen umkristallisiert, wobei reine Substanz
S vom F. = 2o2 bis 2i3° und der spezifischen Drehung [a]D = --E-132° (in Äthanol)
erhalten wird. Zur Acetylierung werden o,o2 Gewichtsteile der reinen Substanz mit
o,z Volumteilen Pyridin und 0,4 Volumteilen Acetanhydrid 15 Stunden bei 2o° stehengelassen.
Das Gemisch versetzt man mit Wasser, dampft im Vakuum ein und kristallisiert den
Rückstand aus Aceton um, wobei 4-Pregnen-i7a, 21-diol-3, 2o-dion (Reichsteins Substanz
S-acetat) vom F. = 239 bis 241° erhalten wird.
Die weiteren
Chloroformeluate mit io °/o Aceton geben beim Eindampfen eine etwas stärker polare
Verbindung, die mit konzentrierter Schwefelsäure zuerst eine rötliche, dann braungelbe
Färbung mit grüner Fluoreszenz zeigt. Diese Substanz kristallisiert aus Aceton in
klaren Prismen, die beim Erwärmen ab etwa 13o° verwittern und bei 2o2 bis 2z2° schmelzen
und im Gemisch mit Substanz S eine starke Depression des Schmelzpunktes ergeben.
Die bei z35° im Hochvakuum getrockneten Kristalle geben Analysen-Werte, die mit
der Bruttoformel C, H" 04 gut übereinstimmen. Da die Substanz im Ultraviolett absorbiert
und alkoholische Silberdiamin-Lösung reduziert, handelt es sich hier um ein neues
Oxycortexon, das von Substanz S verschieden ist.
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An Stelle der im obigen Beispiel verwendeten Czapek-Dox-Nährlösung
können auch mit Wasser verdünnte oder unverdünnte Bierwürze oder andere Nährmedien
verwendet werden, die auf je 2ooo Volumteile Wasser die folgenden Zusätze enthalten:
Lösung A: 2o Gewichtsteile Glukose, 8 Gewichtsteile sekundäres Ammoniumphosphat,
io Gewichtsteile Natriumchlorid, q. Gewichtsteile sekundäres Kaliumphosphat, 2 Gewichtsteile
kristallisiertes Magnesiumsulfat, o,8 Gewichtsteile Calciumchlorid, 0,04 Gewichtsteile
kristallisiertes Eisen (II)-sulfat, o,o2 Gewichtsteile kristallisiertes Mangan (II)-sulfat.
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Lösung B : 4oVolumteile Maisquellwasser (Cornsteepliquor), 2o Gewichtsteile
Rohglukose, q. Gewichtsteile sekundäres Kaliumphosphat.
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Lösung C : 2o Gewichtsteile Pepton, Zoo Gewichtsteile Glukose,q. Gewichtsteile
primäresAmmoniumphosphat, q. Gewichtsteile Kaliumnitrat, i Gewichtsteil kristallisiertes
Magnesiumsulfat, o,2 Gewichtsteile Calciumchlorid.
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Lösung D : 2o Gewichtsteile Pepton, 7 Gewichtsteile Fleischextrakt,
8o Gewichtsteile Glukose, 15 Gewichtsteile Natriumchlorid. Beispiel 2 5o Volumteile
einer sterilisierten Czapek-Dox-Nährlösung werden mit Trichothecium roseum beimpft
und 5 Tage bei 27° geschüttelt. Die gut entwickelte Kultur versetzt man unter sterilen
Bedingungen mit einer Lösung von o,oi Gewichtsteil ii-Dehydrocorticosteron (ii-Ketocortexon)
in 0,5 Volumteilen Aceton und schüttelt bei 27° weiter. Nach 3 Tagen wird,
wie im Beispiel i beschrieben, abgenutscht und extrahiert. Der Extraktionsrückstand
enthält auf Grund der papierchromatographischen Untersuchung neben wenig Ausgangsmaterial
zur Hauptsache Cortison (ii-Ketoi7a-oxycortexon), das sich nach an sich bekannten
Methoden isolieren und reinigen läßt. Eine analoge Umsetzung erhält man nach 6-tägiger
Inkubation des ii-Dehydrocorticosterons.
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Beispiel 3 Eine wie im Beispiel e bereitete Trichotheciumroseum-Kultur
wird mit einer Lösung von o,oi Gewichtsteil Corticosteron in 0,5 Volumteilen
Aceton versetzt und 3 Tage bei 27° inkubiert und analog den Angaben des Beispiels?,
aufgearbeitet. Die papierchromatographische Untersuchung des Extraktes zeigt, daß
der Ausgangsstoff größtenteils in Reichsteins Substanz M (17a-Oxy-corticosteron)
ungewandelt ist.
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Werden analog den obigen Angaben an Stelle von Corticosteron, Progesteron,
ii-Ketoprogesteron oder Pregnenolon inkubiert, so erhält man nach der Aufarbeitung
ebenfalls größtenteils höherpolare Verbindungen.
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Beispiel q.
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Eine wie im Beispiel 2 bereitete Kultur von Trichothecium roseum wird
mit einer Lösung von o,oi Gewichtsteil I, q.-Pregnadien-2r-o1-3, ii. 2o-trion in
o,5 Volumteilen Aceton versetzt und 3 Tage bei 27° inkubiert. Die Aufarbeitung erfolgt
analog den Angaben im Beispiel 2. Die Untersuchung des Extraktes mittels Papierchromatographie
zeigt, daß der Ausgangsstoff größtenteils in 1, 4-Pregnadien-17a, 2i-diol-3, 11,
20-trion (i-Dehydro-cortison) umgewandelt worden ist.
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Wird analog den obigen Angaben an Stelle von I, q.-Pregnadien-2l-o1-3,
1I, 2o-trion das I, q.-Pregnadien-iiß, 2i-diol-3, 2o-dion inkubiert, so erhält man
nach der Aufarbeitung zur Hauptsache das i, 4.-Pregnadien-iiß, i7a, 21-triol-3,
2o-dion (i-Debydrohydrocortison).
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Wird im obigen Beispiel an Stelle der Kultur von Trichotehecium roseum
eine solche von Leptosphaeria maculans verwendet, so enthält der Extrakt des Kulturfiltrates
ebenfalls das I, 4-Pregnadien-17 a, 2idiol-3, iz, 2o-trion (i-Dehydrocortison) bzw.
das i,ä.-Pregnadien-iiß, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion (i-Dehydrohydrocortison).
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Das Ausgangsmaterial, für dessen Herstellung im Rahmen vorliegender
Erfindung Schutz nicht begehrt wird, kann folgendermaßen gewonnen werden: i, 4-Pregnadien-2l-o1-3,
ii, 2o-trion 2ooo Volumteile sterilisierte Bierwürze werden mit einer Kultur von
Calonectria decora geimpft und bei 27° geschüttelt. Nach 3 Tagen werden unter sterilen
Bedingungen zu der gut entwickelten Kultur 0,5 Gewichtsteile ii-Dehydrocorticosteron
(Verbindung A) in 15 Volumteilen Aceton zugegeben; sodann wird das Gemisch bei derselben
Temperatur für 3 weitere Tage geschüttelt. Das Mycel wird abfiltriert, und das Kulturfiltrat
wird wie im Beispiel i extrahiert. Der Extraktionsrückstand wird an,einer Säule
von 15 Gewichtsteilen Kieselsäuregel (bekannt unter dem Handelsnamen vSilicagelcc)
chromatographiert, wobei zuerst mit Chloroform, sodann mit Chloroform-Aceton-Mischungen
mit steigendem Acetongehalt eluiert wird. Jede Fraktion (5o Volumteile) wird papierchromatographisch
untersucht. Mit Chloroform und Chloroform-Aceton (95: 5) werden einige Verunreinigungen
und etwas Ausgangsmaterial eluiert. Die Chloroform-Aceton-(9o : io) Fraktionen enthalten
jedoch hauptsächlich eine Substanz, welche im Papierchromatogramm etwas langsamer
läuft als das Ausgangsmaterial. Es handelt sich um das I, q.-Pregnadien-2l-o1-3,
ii, 2o-trion. Es wird aus Aceton--Äther umkristallisiert und schmilzt dann bei Zoo
bis 215°, je nach Heizgeschwindigkeit. Im Ultraviolett zeigt die Verbindung eine
Absorptionsbande mit Maximum bei 244 m,li und im Infrarot-
Spektrum
Banden bei 5,99, 6,14 und 6,23 ,u, welche charakteristisch für in r, 4-Stellung
ungesättigte 3-Ketone sind.
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i, 4-Pregnadien-iiß, 2i-diol-3, 2o-dion Zu 2ooo Volumteile einer Kultur
von Calonectria decora, welche wie oben dargestellt ist, werden unter sterilen Bedingungen
o,5 Gewichtsteile Corticosteron in 15 Volumteilen Aceton gegeben. Die Züchtung,
Extraktion und Chromatographie an vSilicagelcc werden, wie oben angegeben, ausgeführt.
Die Chloroform und Chloroform-Aceton- (go : zo) Fraktionen enthalten Verunreinigungen
und etwas Ausgangsmaterial. Die Hauptverbindung, welche in den Chloroform-Aceton-
(go : io und 8o: 2o) Fraktionen enthalten ist, läuft im Papierchromatogramm etwas
langsamer als das Ausgangsmaterial. Es handelt sich um i, 4-Pregnadien-iiß, 2i-diol-3,
2o-dion, das ausAceton umkristallisiert wird. Es schmilzt bei 216 bis 22o° (unter
Zersetzung) und besitzt die optische Drehung -j-158° (Äthanol) ; im Ultraviolettabsorptionsspektrum
weist es ein Maximum bei 244 in p (e 15300) und im Infrarotabsorptionsspektrum Banden
bei 2,76, 2,86, 5,84, 5,99. 614, 6,22, 7,44, 8,73, 9,22, 9,38 und 963 ß auf.
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Beispiel 5 50 Volumteile sterilisierte 7o°/°ige Bierwürze werden
mit Leptosphaeria maculans geimpft und 4 Tage bei 27° geschüttelt. Zur gut entwickelten
Kultur wird eine Lösung von o,oi Gewichtsteilen Cortexon in 0,5 Volumteilen
Aceton unter sterilen Bedingungen gegeben, und das Gemisch wird weiter bei 27° geschüttelt.
Nach 3 Tagen wird das Mycel abfiltriert und das Kulturfiltrat, wie im Beispiel i
beschrieben, extrahiert. Der Extraktionsrückstand enthält, wie diepapierchromatographische
Untersuchung zeigt, zusammen mit etwas Ausgangsmaterial hauptsächlich 17a-Oxycortexon
(Substanz S von Reichstein), welches wie im Beispiel i isoliert- und kristallisiert
wird.
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Beispiel 6 5o Volumteile sterilisierte 7o0 j°ige Bierwürze werden
mit Cucurbitaria. laburni geimpft und 5 Tage bei 27° geschüttelt. Zur gut entwickelten
Kultur wird eine Lösung von o,oi Gewichtsteilen Cortexon in o,5 Volumteilen Aceton
unter sterilen Bedingungen gegeben, und das Gemisch wird weiter bei 27° geschüttelt.
Nach 3 Tagen wird das Mycel abfiltriert und das Kulturfiltrat, wie im Beispiel i
beschrieben, extrahiert. Der Extraktionsrückstand enthält, wie die papierchromatographische
Untersuchung zeigt, zusammen mit etwas Ausgangsmaterial hauptsächlich 17a-Oxycortexon
(Substanz S von Reichstem), welches wie im Beispiel i isoliert und kristalhsiert
wird.
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Beispiel 7 3o Volumteile sterilisierte 7o°j°ige Bierwürze werden mit
Acrospeira levis geimpft und 3 Tage bei 27° geschüttelt. Zur gut entwickelten Kultur
wird eine Lösung von o,oi Gewichtsteilen Cortexon in o,5 Volumteilen Aceton unter
sterilen Bedingungen gegeben, und das Gemisch wird weiter bei 27° geschüttelt. Nach
3 Tagen wird dasMycel abfiltriert und das Kulturfiltrat, wie im Beispiel i beschrieben,
extrahiert. Der Extraktionsrückstand enthält, wie die papierchromatographische Untersuchung
zeigt, zusammen mit etwas Ausgangsmaterial hauptsächlich 17a-Oxycortexon (Substanz
S von Reichstein), welches wie im Beispiel i isoliert und kristallisiert wird.
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Beispiel 8 50 Volumteile sterilisierte 700%ige Bierwürze werden
mit Lophotrichus hartinii geimpft und 3 Tage bei 27° geschüttelt. Zur gut entwickelten
Kultur wird eine Lösung von 0,o1 Gewichtsteilen Cortexon in o,5 Volumteilen Aceton
unter sterilen Bedingungen gegeben, und das Gemisch wird weiter bei 27° geschüttelt.
Nach 2 Tagen wird das -Mycel abfiltriert und das Kulturfiltrat, wie im Beispiel
i beschrieben, extrahiert. Der Extraktionsrückstand enthält, wie diepapierchromatographische
Untersuchung zeigt, zusammen mit etwas Ausgangsmaterial hauptsächlich i7a-Oxycortexon
(Substanz S von Reichstein), welches wie im Beispiel i isoliert und kristallisiert
wird.
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Beispiel 9 50 Volumteile sterilisierte 7o°/°ige Bierwürze werden
mit Melanospora parasitica geimpft und 3 Tage bei 27° geschüttelt. Zur gut entwickelten
Kultur wird eine Lösung von o,oi Gewichtsteilen Cortexon in o,5 Volumteilen Aceton
unter sterilen Bedingungen gegeben, und das Gemisch wird weiter bei 27° geschüttelt.
Nach 2 Tagen wird das Mycel abfiltriert und das Kulturfiltrat, wie im Beispiel i
beschrieben, extrahiert. Der Extraktionsrückstand enthält, wie die papierchromatographische
Untersucl-ung zeigt, zusammen mit etwas Ausgangsmaterial hauptsächlich i7a-Oxycortexon
(Substanz S von Reichstein), welches wie im Beispiel i isoliert und kristallisiert
wird.
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Beispiel io 50 Volumteile sterilisierte 7o°%ige Bierwürze werden
mit Thielavia terricola geimpft und 3 Tage bei 27° geschüttelt. Zur gut entwickelten
Kultur wird eine Lösung von o,oi Gewichtsteilen Cortexon in o,5 Volumteilen Aceton
unter sterilen Bedingungen gegeben, und das Gemisch wird weiter bei 27° geschüttelt.
Nach 3 Tagen wird das Mycel abfiltriert und das Kulturfiltrat, wie im Beispiel i
beschrieben, extrahiert. Der Extraktionsrückstand enthält, wie diepapierchromatographische
Untersuchung zeigt, zusammen mit etwas Ausgangsmaterial hauptsächlich i7a-Oxycortexon
(Substanz S von Reichstein), welches wie im Beispiel i isoliert und kristallisiert
wird.