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Verfahren zur Herstellung von 11 a,17a-Dihydroxyprogesteron Gegenstand
der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von 11a,17a-Dihydroxyprogesteron
durch Einwirkung von Sepedonium ampullosporum oder deren oxydierend wirkenden Enzymen
auf llcx-Hydroxyprogesteron unter für aerobe mikrobiologische Verfahren üblichen
Bedingungen, z. B. den in der deutschen Patentschrift 936 207 erläuterten. Eine
Sepedonium-ampullosporum-Kultur ist bei der Northern Utilization Research and Development
Division, Peoria, I11., unter der Nummer NRRL 2877 hinterlegt, ferner beim Centralbureau
voor Schimmelkultures, Baarn, Holland.
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Man hat schon 11a,17a-Dihydroxyprogesteron durch Einwirkung eines
oxydierend wirkenden Mikroorganismus auf 11A-Hydroxyprogesteron erhalten, jedoch
nur in sehr geringen Ausbeuten. Insbesondere bei Verwendung von Trichotecien als
oxydierend wirkenden Mikroorganismen schien die Gegenwart der Hydroxylgruppe in
lla-Stellung die Hydroxylierung ungünstig zu beeinflussen. Mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren ist es möglich, lla,l7a-Dihydroxyprogesteron in einer Ausbeute von etwa
2619/o zu erhalten. Dabei muß der Verfahrensablauf als überraschend bezeichnet werden,
nachdem bei Einwirkung von Sepedonium arnpullosporum auf 5ß-Pregnan-3,11,20-trion
nicht das 17a-, sondern das 16(x-Hydroxyderivat erhalten wird.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter Verwendung eines assimilierbaren
Kohlenstoff und Stickstoff sowie Mineralstoffe, z. B. Phosphate und Magnesiumsulfat,
und gegebenenfalls andere bekannte, erwünschte Zusätze enthaltenden Nährmediums
durchgeführt. Vor der Beimpfung mit dem Mikroorganismus kann auf einen pH-Wert zwischen
etwa 4 und 7 und vorzugsweise auf einen PH-Wert zwischen 4 und 5 eingestellt werden.
Für das Wachstum des Mikroorganismus wird eine Temperatur von etwa 20 bis 38° C,
zweckmäßig von etwa 25 bis 35° C angewandt. Der Zeitpunkt, zu dem das zu hydroxylierende
Steroid der Mikroorganismenkultur zugesetzt wird, scheint nicht kritisch zu sein.
Man kann das Steroid vor der Sterilisation des Nährmediums, zum Zeitpunkt der Beimpfung
mit Sepedonium ampullosporum oder zu irgendeinem beliebigen Zeitpunkt, z. B. auch
24 oder 48 Stunden später, zusetzen. Das zu hydroxylierende Steroid kann in jeder
beliebigen Konzentration zugefügt werden. Zweckmäßig wendet man eine Konzentration
von etwa oder bis etwa 0,6 g pro Liter oder sogar 0,8 g pro Liter Medium an. Auch
2 g pro Liter sind anwendbar. Höhere Konzentrationen können die Mycelbildung etwas
behindern. Der Zusatz des Steroids kann in jeder geeigneten Weise erfolgen, jedoch
sollte eine große Kontaktfläche zwischen dem Steroid und dem Mikroorganismus geschaffen
werden, z. B. durch Dispergieren des Steroids, gegebenenfalls unter Verwendung eines
Dispergiermittels, oder durch Zugabe einer Lösung des Steroids in einem organischen
Lösungsmittel und Mischen oder Homogenisieren mit dem Kulturmedium unter Bildung
einer Suspension oder Dispersion des Steroids. Man kann sowohl submerse als auch
Oberflächenkulturen anwenden, doch werden submerse Kulturen bevorzugt. Eine andere
Möglichkeit besteht darin, die Hydroxylierung mit dem oxydierend wirkenden Enzym
des Mikroorganismus zu bewirken.
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Während der Hydroxylierung kann die gleiche Temperatur angewendet
werden wie für das Wachstum des Mikroorganismus. Die Wirksamkeit der Hydroxylierung
ist von der Belüftung abhängig. Bei Verwendung von Luft als Belüftungsmedium für
submerse Kulturen sollte die Belüftungsgeschwindigkeit etwa 4 bis 20 Millimol und
insbesondere etwa 6 Millimol Sauerstoff pro Stunde pro Liter entsprechen (vgl. Cooper,
Fernstrom und Miller, Ind. Eng. Chem., Bd. 36, S. 504 [1944)). Die Sauer-Stoffaufnahme
kann durch verschiedene Substanzen, wie Ascorbinsäure, Glutaminsäure, Zitronensäure,
Milchsäure,
Tyrosin oder Tryptophan, gefördert werden.
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Die für die Hydroxylierung des Steroids erforderliche Zeit hängt vom
Zeitpunkt der Steroidzugabe ab. Ist das Steroid schon zum Zeitpunkt der Beimpfung
im Nährmedium anwesend, so können 8 bis 72 Stunden erforderlich sein. Wird das Steroid
jedoch erst nach beträchtlichem aerobem Wachstum des Mikroorganismus, z. B. nach
16 bis 24 Stunden, bei optimaler Temperatur zugesetzt, so beginnt die Umwandlung
des Steroids sofort, und hohe Ausbeuten können schon in 48 Stunden erreicht sein.
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Nach beendigter Hydroxylierung wird das Steroid aus dem Reaktionsgemisch
gewonnen. Ein besonders vorteilhaftes Verfahren besteht in der Extraktion des Reaktionsgemisches
mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. Methylenchlorid,
Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylenchlorid, Trichloräthylen, Äther, Amylacetat
oder Benzol. Hierbei kann man zuvor die Gärflüssigkeit vom Mycel trennen und beide
getrennt extrahieren. Das Mycel kann mit mit Wasser mischbaren oder mitWasser nicht
mischbaren Lösungsmitteln extrahiert werden. Die von Mycel befreite Gärflüssigkeit
wird mit mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln extrahiert. Die Extrakte werden
vor oder nach dem Waschen mit einer alkalischen Lösung, z. B. einer Natriumbicarbonatlösung,
vereinigt, getrocknet, z. B. über wasserfreiem Natriumsulfat, und vom Lösungsmittel
befreit. Das so gewonnene Steroid kann dann durch Umkristallisieren aus organischen
Lösungsmitteln oder chromatographisch gereinigt werden. Die Hydroxylierung des 11a-Hydroxyprogesterons
kann auch in der Weise erreicht werden, daß man es mit den Hyphen oder den Sporen
von Sepedonium ampullosporum in Berührung bringt. Man geht dabei so vor, daß man
die Hyphen oder Sporen in Leitungswasser, mit Puffersubstanzen versetztem destilliertem
Wasser oder in einem anderen geeigneten Medium suspendiert und unter aeroben Bedingungen
auf 11,-Hydroxyprogesteron einwirken läßt.
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Das folgende Beispiel erläutert das erfindungsgemäße Verfahren: Beispiel
11 x,17a-Dihydroxyprogesteron Ein Nährmedium aus 20 g Maisquellwasser (60% Feststoffe)
und 10 g handelsüblichem Traubenzucker in
1 1 Wasser wurde auf einen pj,-Wert
zwischen 4,8 und 5 eingestellt und mit 10 ccm Specköl als Antischaummittel versetzt.
101 des sterilisierten Mediums wurden mit einem vegetativen 72 Stunden alten Wachstum
von Sepedonium ampullosporum (D a m o n, Mycologia, Bd. 44, S. 86 bis 96, 1952)
geimpft und 48 Stunden unter Rühren (300 UpM) und Belüftung (0,31 pro Minute) auf
etwa 28° C gehalten. Dann wurde eine Lösung von 2,0 g llx-Hydroxyprogesteron in
20 ccm Dimethylformamid zugesetzt. Nach weiteren 48 Stunden wurde das Mycel abfiltriert.
Das Mycel wurde mit Wasser gewaschen und das Waschwasser mit dem Filtrat vereinigt.
Filtrat und Waschwasser wurden viermal mit '/4 Volumen ihres Volumens an Methylenchlorid
extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit einem Viertel ihres Volumens an
destilliertem Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wurde abdestilliert. Der erhaltene
rohe Rückstand wurde in etwa 25 ccm Methylenchlorid gelöst und über eine Säule aus
synthetischem Magnesiumsilikat mit einem Durchmesser von 3,3 cm und einer Höhe von
35 cm chromatographiert. Die Säule wurde mit jeweils 335 ccm der nachstehend angegebenen
Lösungsmittel eluiert. Die Eluatfraktionen wurden zur Trockne eingedampft. Das Gewicht
des Rückstandes von jeder Fraktion ist in der Tabelle angegeben:
Die Fraktionen 12, 13 und 14 wurden vereinigt und aus Aceton und handelsüblichen
Hexankohlenwasserstoffen kristallisiert. Man erhielt 0,56 g 11,t,17*-Dihydroxyprogesteron
vom Schmelzpunkt 210 bis 2l4° C; @,mä = 242 mit; E=15 700. Das Infrarotspektrum
entsprach einer auf anderem Wege hergestellten Probe von 111,17x-Dihydroxyprogesteron.