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Verfahren zur Herstellung von 5-Pregnen-3p, 7a,11a-triol-20-on Zusatz
zum Patent 936,207
Gegenstand des Patents 936 207 ist ein Verfahren
zur Herstellung von oxydierten Steroiden, nach welchem man Steroide mit einem oxydierend
wirkenden Stamm einer Pilzart der Ordnung Mucorales oder von aus derartigen Pilzen
erhältlichen, oxydierend wirkenden Enzymen behandelt und gegebenenfalls die erhaltenen
oxydierten Steroide in bekannter Weise, z, B. durch Extraktion, abtrennt. Auf diese
Weise können mit einfachen Mitteln aus Steroiden in hoher Ausbeute die entsprechenden
oxydierten Steroide hergestellt werden, die vielfach als Heilmittel bekanntgeworden
sind. Außerdem können nach dem Verfahren des Patents 936 207 neue Verbindungen hergestellt
werden, welche bisher durch kein anderes Verfahren hergestellt werden konnten.
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine bevorzugte Ausführungsform
des Verfahrens nach Patent 936 2o7, und das erfindungsgemäße Verfahren besteht im
wesentlichen darin, daß das bisher noch nicht beschriebene 5-Pregnen-3ß, 7, iia-triol-2o-on
durch Oxydation von Pregnenolon mit einer Kultur einer Pilzart der Gattung Rhizopus
oder den aus einer solchen erhältlichen oxydierenden Enzymen hergestellt wird. Das
5-Pregnen-3ß, 7, iia-triol-2o-on ist hitzebeständig und findet unter anderem vor
allem als wertvolles Zwischenprodukt bei der Herstellung
anderer
wichtiger Wirkstoffe Verwendung. So kann es z. B. mit Lithiumaluminiumhydrid in
Tetrahydrofuran zum 5-Pregnen-3ß, 7, iia, 2o-tetraol hydriert werden, welches sich
bei Raumtemperatur mit Mn 02 in Chloroform zum 5-Pregnen-3ß, iia, 2o-tr101-7-on
oxydieren läßt. Durch Reclüktion nach Wolff-Kishner erhält man aus diesem das 5-Pregnen-3ß,
iia, 2o-triol, welches seinerseits durch Chromsäureoxydation in Eisessig in das
ii-Ketoprogesteron übergeführt werden kann.
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Wenn die das 5-Pregnen-3ß, 7, ria-triol-2o-on enthaltende Nährlösung
auch bereits als solche verwendet werden kann, so wird man in den meisten Fällen
vorteilhafterweise das Steroid zunächst abtrennen. Von den Pilzen der Gattung Rhizopus
haben sich gewisse Arten, z. B. Rhizopus nigricans oder Rhizopus arrhizus, zur Herstellung
des 5-Pregnen-3 ß, 7, ii a-triol-2o-ons aus Pregnenolon als besonders geeignet erwiesen.
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Es ist zwar schon versucht worden, Steroide mit Nebennierenrindenhomogenaten
bzw. im Wege der Perfusion enzymatisch zu oxydieren, jedoch verläuft dabei die Oxydation
in anderer Richtung als bei dem erfindungsgemäßen Verfahren. Zudem sind die verwendeten
enzymatischen Rohstoffe im Gegensatz zu den nur als Schlachthausabfall in sehr begrenzten
Mengen zur Verfügung stehenden Nebennieren industriell herstellbar, so daß es daher
auch in großem Maßstab ausgeführt werden kann und hierdurch gegenüber den bekannten
Verfahren Vorteile besitzt.
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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird. vorzugsweise ein Steroid
mit einem lebensfähigen Pilz unter Fermentationsbedingungen in Gegenwart eines für
den Pilz geeigneten Nährbodens oxydiert. Das folgende Beispiel erläutert das erfindungsgemäße
Verfahren. Beispiel Aus 2o g Lactalbuminauszug, 3 g Maisquellwasser und
50 g technischer Dextrose wurde durch Verdünnung auf 11 mit Leitungswasser
und Einstellung auf einen pH-Wert von 4,3 bis 4,5 ein Nährboden hergestellt. 81
dieses sterilisierten Nährbodens # wurden mit. Rhizopus arrhizus beimpft. und i9
-Stunden bei einer Temperatur von 28° mit einer solche4_ Luftzufuhr'und unter Rühren
bebrütet, daß die Sauerstoffaufnahme 6,3 bis 7 Millimol pro Stunde und Liter Na2S03
nach dem von Cooper, Fernstrom und Miller (Ind. Eng. Chem., Bd.36, 1944, S.504)
beschriebenen Verfahren betrug. In dieser eine 19stündige Kultur von Rhizopus arrhizus:
enthaltenden Kulturflüssigkeit wurden 2 g Pregnenolon 5-Pregnen-3ß-ol-2o-on), in
2o ccm Aceton gelöst, suspendiert. Nach einer weiteren, unter denselben Temperatur-und
Belüftungsbedingungen durchgeführten Bebrütung von 75 Stunden, wurden die Würze
und das Myzel extrahiert und eingeengt. Das Myzel wurde filtriert, zweimal mit je
einem seinem Volumen etwa gleichen Volumen Aceton gewaschen und zweimal mit je einem
etwa seinem Volumen gleichen Volumen Methylenchlorid extrahiert. Die lösungsmittelhaltigen
Aceton- und Methylenchloridauszüge wurden mit dem Würzefiltrat vereinigt. Die gesamte
Flüssigkeitsmenge wurde nacheinander mit 41 Methylenchlorid, 'dann dreimal finit
je 21 Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten Methylenchloridauszüge wurden
zweimal mit je einer einem Zehntel ihres Volumens entsprechenden Menge einer 9o/oigen
wäßrigen Natriumbicarbonatlösung und sodann zweimal mit gleichen Mengen Wasser gewaschen.
Nach dem Trocknen des Methylenchlorids mit etwa 3 bis 5 g wasserfreiem Natriumsulfat
je Liter Lösungsmittel und Filtration würde das Lösungsmittel abdestilliert, wobei
3,3162 g eines kristallinen Rückstandes erhalten wurden. Dieser Rückstand wurde
in Zoo ccm Benzol gelöst und über ioo g Aluminiumoxyd (mit Säure gewaschen und 4
Stunden bei i2o° getrocknet) chromatographiert. Die Säure wurde jeweils mit Zoo
ccm der in der nachstehenden Tabelle angegebenen Lösungsmittel beschickt.
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Die Fraktionen 28 bis 31 wurden vereinigt, in io ccm Methanol. gelöst
und bis zur beginnenden Kristallisation eingeengt. Einige Tropfen Wasser wurden
zugesetzt, die Mischung gekühlt und die Kristalle abgetrennt. Nach dreimaligem Umkristallisieren
aus Methanol unter Zusatz von Wasser zur Erleichterung der Kristallisation, oder
aus Methanol-Tetrachlorkohlenstoff, wurden 375 mg 5-Pregnen-3ß, 7, iia-triol-2o-on
erhalten; F., = 247 bis 248° und 25o bis 255°; [a37 =-4i° (i,086 in Methanol). Die
Struktur wurde durch Infrarotspektren bestätigt.
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Analyse: Berechnet für C21$,204 C = 72,3$ o%, H = 9,250/0 gefunden
. . . . . . . . . . C = 72,340/0 H = 9,13%.
| Fraktion Lösungsmittel Ausbeute |
| l mg |
| i, 2 Benzol ........ .......... 195 |
| 3, 4 Benzol -+- 5 % Äther- . . . . . . . . 70 |
| bis? Benzol +- io 0/0 Äther . . . . . . . . 56 |
| 8, 9 Benzol -f- 50 0/0 Äther . . . . . . . ii |
| io, ii Äther ....................... 7 |
| 12, 13 Äther -f- 5 % CHC13 . . . . . . . . 8 |
| 14, 15 Äther + io 0/0 CHCl3 . . . ... . . 32 |
| 16, 17 Äther - + 50% CHC13 . . . . . . . 1o8 |
| 18, i.9 Chloroform:.....:............. 590 |
| 20. , C H Cl3 -+- 50 /0 Aceton .-... 37 |
| 21 C H C13 -+- 50/0 Aceton ....... @@ 24 |
| 22 CHC13 + io % Aceton ....... 43 |
| 23 CHC13 -f- ioo/o Aceton ....... 37 |
| 24 C H C13 -E- 50 0/0 Aceton ....... 171 |
| 25 C H Cl3 + 50 0% Aceton ....... 155 |
| 26 Aceton .............. _ . . 399 |
| 27 Aceton ....... . ........... iio |
| 28 Aceton + 5 0% Methanol .... 244 |
| 29 Aceton -j- 5 % Methanol .... , z25 |
| 30, 31 Aceton + io °/o Methanol .... 118 |
| 32, 33 Aceton + 5001, Methanol .... 73 |
| 34, 35 Methanol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ._
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