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Publication number: DEU0001745MA
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Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Tag der Anmeldung: 8. Juli 1952 Bekanntgemacht am 9. Mai 1956

DEUTSCHES PATENTAMT

Gegenstand des Hauptpatents 936 207 ist ein Verfahren zur Herstellung von oxydierten Steroiden,, nach welchem man Steroide mit einem oxydierend wirkenden Stamm einer Pilzart der Ordnung Mucorales oder mit den aus derartigen Pilzen erhältlichen oxydierend wirkenden Enzymen behandelt und gegebenenfalls die erhaltenen oxydierten Steroide in bekannter Weise, z. B. durch Extraktion, abtrennt. Auf diese Weise können mit einfachen Mitteln Steroide in hoher Ausbeute in die entsprechenden oxydierten Steroide umgewandelt werden, die als Heilmittel bekanntgeworden sind. Außerdem können durch das Verfahren nach dem Hauptpatent neue Verbindungen hergestellt werden, welche bisher durch kein anderes Verfahren zugänglich waren.

Die Erfindung bezieht sich auf eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens nach dem Hauptpatent, und das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß das 4-Pregnen-8, 17a, 2i^triol-3, 20-dion durch Behandlung des 4-Pregnen-i7a, 2i-diol-3, 20-dions oder von dessen Acylaten mit einer Kultur einer Pilzart der Gattung Helicostylum oder mit aus dieser erhältlichen oxydierenden Enzymen hergestellt und das erhaltene 4-Pregnen-8, 17a, 2i-triol-3, 20-dion aus

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dem Reaktionsgemisch abgetrennt wird. Das neue 4-Pregnen-8, 17a, 2i-triol-3, 20-dion zeigt eine gute pharmakologische Wirkung vor allem als lokales Anästhetikum. Es ist außerdem für Synthesen verwendbar. Zur Herstellung des 4-Pregnen-8,17 a, 21-tri-0I-3, 20-dions aus 4-Pregnen-i7a, 2i-diol-3, 20-dion oder dessen 21-Acylaten, z. B. den 21-Acetaten, haben sich gewisse Spezies der Gattung Helicostylum, z. B. Helicostylum piriforme, als besonders geeignet erwiesen.

Es ist zwar schon versucht worden, Steroide unter, Zuhilfenahme von Nebennierenrindenhomogenaten bzw. im Wege der Perfusion enzymatisch zu oxydieren, jedoch verläuft dabei die Oxydation in anderer

Richtung als bei dem erfindungsgemäßen Verfahren. Dieses besitzt aber auch noch den Vorteil, daß die verwendeten enzymliefernden bzw. -haltigen Rohstoffe im Gegensatz zu den nur als Schlachthausabfall in sehr begrenzten Mengen, zur Verfügung stehenden Nebennieren industriell herstellbar sind. Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher auch in großem Maßstab durchgeführt werden.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird .vorzugsweise das Steroid mit einem lebensfähigen Pilz unter den Fermentationsbedingungen in Gegenwart einer für den Pilz geeigneten Nährflüssigkeit behandelt, wie in dem folgenden Beispiel näher ausgeführt wird. .

Beispiel

Herstellung von

4-Pregnen-8-, 17a, 2i-triol-3, 20-dion

Aus 20 g Laktalbuminauszug (bekannt unter der Handelsbezeichnung »Edamin«), 3 g Mäisquellwasser und 50 g technischer.Dextrose wurde ein Nährboden hergestellt, mit Leitungswasser auf 11 verdünnt und auf einen pH-Wert von 4,3 bis 4,5 eingestellt. 12 1 dieses sterilisierten Nährbodens wurden mit Sporen von Helicostylum piriforme beimpft und 24 Stunden bei einer Temperatur von 28° und einer solchen Belüftung und unter Rühren bebrütet, daß die Sauerstoffaufnahme nach dem von Cooper, Fernstrom und Miller (Ind. Eng. Chem., Bd. 36, 1944, S. 504) beschriebenen Verfahren 6,3 bis 7 Millimol je Stunde und Liter Na₂SO₃ betrug. In diesem Nährboden, der eine 24 Stunden alte Kultur von Helicostylum piriforme enthielt, wurden 2 g 4-Pregnen-i7a, 21-di-0I-3, 20-dion, welches in 100 ecm Äthanol gelöst war, suspendiert. Nach weiterer 24stündiger Bebrütung unter denselben Temperatur- und •Belüftungsbedingungen wurden die Würze und das Myzel extrahiert. ' Das Myzel wurde abfiltriert, zweimal· mit je einem seinem Volumen etwa gleichen Volumen Aceton, gewaschen und zweimal mit je einem seinem Volumen etwa gleichen Volumen Methylenchlorid extrahiert. Die lösungsmittelhaltigen Azeton- und Methylenehloridextrakte wurden dem. Würzefiltrat zugesetzt. Das Gemisch der Extrakte und des Würzefiltrates wurden erst zweimal j e mit einem ihrem halben Volumen entsprechenden Volumen Methylenchlorid, dann zweimal mit einem je einem Viertel ihres.Volumens entsprechenden Volumen Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten Methylenchloridextrakte wurden zweimal mit je einem einem Zehntel ihres Volumens entsprechenden Volumen einer 2% igen wässerigen Natriumbicarbonatlösung, dann zweimal mit je einem einem Zehntel ihres Volumens entsprechenden Volumen Wasser .gewaschen. Nach dem Trocknen der Methylenchloridauszüge mit etwa 3 bis 5 g wasserfreiem Natriumsulfat je Liter Lösungsmittel und nach der Filtration wurde das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand würde in 500 ecm Methylenchlorid gelöst, filtriert und das Lösungsmittel dann verdampft. Die entstehenden Kristalle des Rohproduktes -wurden getrocknet und fünfmal mit je 5 ecm. Äther je g Rohprodukt gewaschen, wobei ein Rückstand· von 5,354 g erhalten wurde. Der Rückstand wurde in ίο ecm Äthylendichlorid gelöst und über 350 g synthetisches Magnesiumsilikat (bekannt unter der Handelsbezeichnung »Florisik) mit jeweils 550 ecm der in der Tabelle aufgeführten Lösungsmittel chromatographiert.

Helicostylum piriforme

Fraktion

Lösungsmittel

Äthylendichlorid

Äthylendichlorid zu Aceton 15 Äthylendichlorid zu Aceton 15 Äthylendichlorid zu Aceton 12 Äthylendichlorid zu Aceton 12 Äthylendichlorid zu Aceton 12 Äthylendichlorid zu Aceton 10 Äthylendichlorid zu Aceton 10 Äthylendichlorid zu Aceton 8 Äthylendichlorid zu Aceton Äthylendichlorid zu Aceton Äthylendichlorid zu Aceton Äthylendichlorid zu Aceton Äthylendichlorid zu Aceton Äthylendichlorid zu Aceton Äthylendichlorid zu Aceton Äthylendichlorid zu Aceton Äthylendichlorid zu Aceton Aceton

Herausgelöste Feststoffe mg

479.5 403,0

36,5

36,0

50,0

109,5

159.O 148,0

145,0 104,5 98,0 170,0 123,0

123,5 127,5 200,0 456,0 356,0 226,5

Die herausgelösten Fraktionen 18 und 19 wurden vom Lösungsmittel befreit und zweimal mit je 5 ecm Methanol und Aceton (1: 1) gewaschen, wobei ein Rückstand von 63 mg erhalten wurde. Zweimaliges Umkristallisieren aus je 3 ecm Methanol ergab Kristalle des 4~Pregnen-8, 17a, 2i-triol-3, 20-diönsj F. = 248 bis 252⁰; [a]²fj = ■+ 107⁰ (c = 0,946 in Dioxan). Die Mutterlaugen der Fraktionen 18 und 19 wurden mit den Fraktionen 17 und 20 vereinigt und über synthetisches Magnesiumsilikat (»Florisil«) erneut chromatographiert, wobei weitere 114,3 ^mg dieser Verbindung erhalten wurden. Analyse für C₂₁H₃₀O₅:

- ■ Berechnet ..... C = 69,58%, H = 8,34%; gefunden ...... C = 69,46⁰Z₀, H = 8,46%.

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Die Verwendung anderer Helicostylumarten und bzw. oder von 2i-Acylaten, z. B. dem 21-Acetat des 4"Pregnen-i7a, 2i-diol-3, 20-dions, führte zu dem gleichen Ergebnis.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von 4-Pregnen-8, 17 a, 2i-triol-3, 20-dion durch Behandlung von in ii-Stellung nicht oxydierten Steroiden mit oxydierend wirkenden Pilzen der Ordnung Mucorales oder mit aus derartigen Pilzen erhältlichen oxydierend wirkenden Enzymen und gegebenenfalls Abtrennung der erhaltenen oxydierten Steroide, insbesondere durch Extraktion, nach Patent 936 207, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Oxydation von 4-Pregnen-i7a, 2i-diol-3, 20-dion oder dessen Acylaten eine Kultur einer Pilzart der Gattung Helicostylum, insbesondere HeIicostylum piriforme, oder die aus dieser erhältlichen oxydierenden Enzyme verwendet, das extrahierte und vom Extraktionsmittel befreite Oxydationsprodukt in an sich bekannter Weise chromatographisch absorbiert, mit Lösungsmitteln steigender Polarität eluiert und die mit Äthylendichlorid zu Aceton = 1:1 erhaltenen Eluate abtrennt.