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Verfahren zur Herstellung von 11 a-Oxytestosteron bzw. 11 a:-Oxy-10-normethyltestosteron
Zusatz zum Patent 936 203 Gegenstand des Patents 936 2o7 ist ein Verfahren zur Herstellung
von oxydierten Steroiden, nach welchem man Steroide mit einem oxydierend wirkenden
Stamm einer Pilzart der Ordnung Mucorales oder von aus derartigen Pilzen erhältlichen,
oxydierend wirkenden Enzymen behandelt und gegebenenfalls die erhaltenen oxydierten
Steroide in bekannter Weise, z. B. durch Extraktion, abtrennt. Auf diese Weise können
Steroide mit einfachen Mitteln und in hoher Ausbeute in die entsprechenden oxydierten
Steroide umgewandelt werden. Diese sind vielfach als Heilmittel bekannt. Außerdem
können durch das Verfahren nach dem Hauptpatent neue Verbindungen hergestellt werden,
welche bisher durch kein anderes Verfahren zugänglich waren.
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Von den Pilzen der Ordnung Mucorales werden nach dem Verfahren des
Patents 936 207 mit Vorteil Pilze der Gattung Rhizopus angewendet.
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine bevorzugte Ausführungsform
des Verfahrens nach dem Patent 936 2o7, und das erfindungsgemäße Verfahren besteht
im wesentlichen darin, daß zur Herstellung von iia-Oxytestosteron bzw. iia-Oxy-io-normethyltestosteron
das Testosteron bzw. das io-Normethyltestosteron mit einer Kultur einer Pilzart
der Gattung Rhizopus oder den daraus gewonnenen oxydierenden
Enzymen
behandelt wird. Das iia-Oxytestosteron besitzt eine androgene Wirkung von vergleichsweise
511/, derjenigen des Testosteronpropionates. Es treten jedoch bei seiner Verabreichung
keinerlei Nebeneffekte, wie etwa ein von der Nebenniere ausgehendes Schrumpfen oder
eine Abschwächung der Wirkung der Thymusdrüse, auf. Untersuchungen an Ratten zeigen,
daß die bei der Verabreichung gewisser Steroide, vor allem des Testosterons, zu
beobachtende Atrophie der vaginalen Epithelzellen im Falle der nach dem vorliegenden
Verfahren herstellbaren Verbindungen auch noch bei einer Gabe von 5 mg ausbleibt.
Die Verbindung besitzt eine den Stoffwechsel anregende Wirkung und ist bei der Herstellung
von Verbindungen, welche den Aufbau des Körpers sehr stark fördern, wie das ii-Ketotestosteron,
von Bedeutung. Dieses erhält man durch Oxydation der iia-ständigen Oxygruppe des
iia-Oxytestosterons. In ähnlicher Weise kann das iia-Oxytestosteron direkt zum Adrenosteron
oxydiert werden.
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Unter den Pilzen der Gattung Rhizopus haben sich die Arten Rhizopus
arrhizus und Rhizopus nigricans als besonders geeignet erwiesen.
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Es ist zwar schon versucht worden, Steroide mit Nebennierenrindenhomogenaten
bzw. nach dem Perfusionsverfahren enzymatisch zu oxydieren, jedoch verläuft dabei
die Oxydation in anderer Richtung als bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, welches
darüber hinaus die Vorteile besitzt, daß die verwendeten enzymatischen Rohstoffe
im Gegensatz zu den nur als Schlachthausabfall in sehr begrenzten Mengen zur Verfügung
stehenden Nebennieren industriell herstellbar sind und daß es daher auch in großem
Maßstab durchgeführt werden kann.
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Nach der Erfindung wird das Testosteron bzw. das io-Normethyltestosteron
vorzugsweise mit einem lebensfähigen Pilz unter Fermentationsbedingungen in Gegenwart
einer für den Pilz geeigneten Nährlösung behandelt. Die folgenden Beispiele erläuterh
das erfindungsgemäße Verfahren. Beispiel i ii a-Oxytestosteron Es wurde eine Nährlösung
hergestellt, die !zog Lactalbuminauszug, 39 Maisquellwasser und 5o g technische
Dextrose je Liter gelöst enthielt und deren pH-Wert auf 4,3 bis 4,5 eingestellt
wurde. 31 dieser sterilisierten Nährlösung wurden mit Rhizopus nigricans geimpft
ünd 24 Stunden bei 28° bebrätet, wobei die Rührgeschwindigkeit und die Belüftung
so eingestellt 'wurden, daß die Sauerstoffaufnahme, gemessen nach der Methode von
Cooper, Fernstrom, Miller (Ind. Eng. Chem., Bd. 36, 1944, S. 5o4), 6,3 bis 7 Millimol
Na, SO, j e Liter und Stunde entsprach. Zu dieser eine 24 Stunden alte Kultur
von Rhizopus nigricans enthaltenden Nährlösung wurden 1,50 g Testosteron, das zur
Bildung einer Steroidsuspension in der Nährlösung in 30 ccm Äthanol gelöst
worden war; gegeben. Nach weiterer 24stündiger Bebrütung unter denselben Temperatur-
und Belüftungsbedingungen wurden die Würze und das Mycel extrahiert. Das Mycel wurde
filtriert, zweimal mit einem etwa dem Mycelvolumen gleichen Volumen Aceton, gewaschen
und zweimal mit einem etwa dem Mycelvolumen gleichen Volumen Methylenchlorid extrahiert.
Die Aceton- und Methylenchloridauszüge wurden einschließlich des Lösungsmittels
zu dem Würzefiltrat gegeben. Die vereinigten Extrakte und das Würzefiltrat wurden
nacheinander zweimal mit 0,5 Volumteilen Methylenchlorid und dann zweimal
mit o,25 Volumteilen Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten Methylenchloridauszüge
wurden zweimal mit o, i Volumteilen 20/0iger Natriumbicarbonatlösung und dann zweimal
mit o,i Volumteilen Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen der Methylenchloridlösung
mit 3 bis 5 g wasserfreiem Natriumsulfat je Liter dieser Lösung und Filtrieren wurde
das Lösungsmittel durch Destillation entfernt. Der Rückstand wurde in möglichst
wenig Methylenchlorid aufgenommen, filtriert und das Lösungsmittel an der Luft oder
auf dem Wasserbad verdampft. Der Rückstand wog nach dem Verdampfen des Methylenchlorids
2,55 g.
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Der rohe Rückstand konnte durch Aufnehmen in 35 ccm Methylenchlorid,
Zugabe von 3 g synthetischem Magnesiumsilikat (bekannt unter dem Handelsnamen »Magnesola)
und Filtrieren entfärbt werden. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurde der
Rückstand in einem 1_Tberschuß Aceton aufgenommen, mit o,2 g Diatomeenerde (bekannt
unter dem Handelsnamen »Celitcc) vermischt, filtriert und zur Trockene verdampft.
Der Rückstand wurde in 150 ccm Benzol gelöst, über 75 g Tonerde (mit Salzsäure
gewaschen und bei 12o° getrocknet) chromatographiert und mit je 15o ccm betragenden
.Mengen Lösungsmittel, wie in der Tabelle angegeben, eluiert. Die Papierchromatographie
wurde iil einem Propylenglykol-Toluol-System durchgeführt.
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Die vom Lösungsmittel befreiten Fraktionen 23 bis 3o ergaben 378 mg
festes Eluat, das in Aceton gelöst wurde. Diese Lösung wurde auf io ccm eingeengt,
eine kleine Menge eines flockigen Niederschlages abfiltriert und zur Trockene verdampft.
Der Rückstand wurde in i5 ccm Äthylacetat gelöst, auf dem Wasserbad auf 5 ccm eingeengt
und zur Kristallisation abgekühlt. Diese Kristalle wurden durch Filtration abgetrennt
und dreimal mit je i ccm Äthylacetat gewaschen; sie wogen 319,9 mg und wurden in
Methylenchlorid aufgenommen. Die erhaltene Lösung wurde mit synthetischem Magnesiumsilikat
(bekannt unter dem Handelsnamen »Magnesolu) entfärbt, die Suspension filtriert und
das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wurde nochmals aus 2 ccm Äthylacetat umkristallisiert,
-wobei 198,7 mg Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 179 bis i82° erhalten wurden.
Sie wurden in 7 ccm Äthylacetat gelöst, die Lösung auf 4 ccm eingeengt, wobei nach
der Kristallisation 169,7 mg ii a-Oxytestosteron mit einem Erweichungspunkt von
i78° und einem Schmelzpunkt von 181 bis 18z;5° erhalten wurden. Die optische Drehung
betrug [a]2D3 = -I° 93° (Chloroform). Das Infrarotspektrum zeigt die Anwesenheit
einer weiteren Hydroxylgruppe im Testosteron. Analyse Berechnet.als C10$'703 C=74,97°/0
H=9,270/0. gefunden ............ C=74,690/0, H=9,26°/0.
Die vereinigten
Mutterlaugen wurden bis zur beginnenden Kristallabscheidung eingedampft und die
Kristalle mit kaltem Äthylacetat gewaschen. Sie wogen 40,5 mg und zeigten einen
Schmelzpunkt von 177 bis z78°.
| Tabelle |
| Eluat- |
| Fraktion Lösungsmittel feststoffe- |
| mg |
| i, 2 Benzol + io % Äther . . . . . . . . . 5519 |
| 3, 4 Benzol --f- 50 0/0 Äther . . . . . . . . . 74,5 |
| 5 bis 7 Äther ...................... 904,5 |
| 8 bis io Äther + 5 0/0 Chloroform ..... igi,6 |
| 11, 12 Äther + io 0/0 Chloroform ..... 21,5 |
| 13 Äther -f- io % Chloroform ..... 2,4 |
| 14 bis 16 Äther -j-- 500/, Chloroform ..... 15,0 |
| 17 bis ig Chloroform . . . . . . . . . . . . . . . . .
66,-- |
| 20 Chloroform -E- 5 0/0 Aceton .... 34,7 |
| 21 Chloroform + 5 0/0 Aceton .... 27,5 |
| 22 Chloroform + 5 0/0 Aceton ... 3o,8 |
| 23 bis 25 Chloroform + io 0/0 Aceton .... 113,3 |
| 26 bis 28 Chloroform --f- 500/0 Aceton .... 139,7 |
| 29 Aceton ..................... 62,1 |
| 30 Aceton ...................... 32,4 |
| 31 Aceton ..................... 16,9 |
| 32 Aceton + 5 0/0 Methanol ....... 30,1 |
| 33 bis 41 Aceton-Methanol, angestiegen |
| auf ioo °/0 Methanol . . . . . . . . . . 35,3 |
| Insgesamt 1854,4 |
Beispiel 2 i i a-Oxy-io-Normethyltestosteron Auf die gleiche Weise, wie im Beispiel
i beschrieben, wird aus io-Normethyltestosteron (beschrieben von Birch, Journ. Chem.
Soc. [London], 1950, S.367) durch Einwirkung von Rhizopus nigricans 11 a-Oxynormethyltestosteron
erhalten. Dieses wird aus der Gärlösung nach der im Beispiel i beschriebenen Weise
abgetrennt und das iia-Oxy-normethyltestosteron durch Umkristallisieren aus Äthylacetat
gereinigt.
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Bei Verwendung von Rhizopus arrhizus an Stelle von Rhizopus nigricans
in den beiden vorstehenden Beispielen werden die gleichen Ergebnisse erhalten.
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Das iia-Oxytestosteron und das iia-Oxy-io-norznethyltestosteron sind
gegen Wärme und verdünnte Säuren beständig.